Abstract

Uma diminuição na taxa de mortalidade quase cinquenta por cento de câncer bucal é urgentemente necessária. Melhorias no diagnóstico precoce e tratamentos preventivos mais eficazes poderia afetar uma tal diminuição. Para este fim, procedemos pela primeira vez um estudo aprofundado proteómica à base de massa espectrometria de espingarda quantitativa de biopsias de escova orais não-invasiva recolhidos. Proteínas isoladas de biópsias escova de tecido saudável normal, orais dos tecidos lesão pré-maligna (OPMLs), carcinoma de células escamosas oral (CCEO) e tecido controle pareado foram comparados. Em conjuntos de dados de proteômica replicadas, a proteína secretora inibidor de protease de leucócitos (SLPI) sobressaíram com base na sua diminuição em abundância em ambos os tecidos OPML e lesão CCEO em comparação com o tecido normal saudável. Western blot em amostras de biópsia escovado adicionais confirmaram uma tendência de gradual diminuição da abundância SLPI entre o tecido normal e OPML saudável, com uma diminuição maior no tecido da lesão CEB. Observou-se uma diminuição SLPI semelhante

in-vitro

comparando modelo OPML e linhas de células de CCEO. Além disso, células esfoliadas orais em toda a saliva dos pacientes mostrou uma perda de SLPI correlacionada com a progressão do cancro oral. Estes resultados, combinados com dados de proteômica indicando uma diminuição na SLPI no tecido controle saudáveis ​​pareados de pacientes com tumores em comparação com o tecido do tecido normal saudável, sugeriu uma diminuição sistémica do SLPI nas células orais correlacionadas com o desenvolvimento de câncer oral. Finalmente,

in-vitro

experiências mostraram que o tratamento com SLPI diminuiu significativamente a actividade de NF-kB numa linha celular OPML. Os resultados indicam uma actividade anti-inflamatória em OPML, apoiando um papel mecanicista de SLPI na progressão CEB e sugerindo o seu potencial para o tratamento preventivo de lesões orais em risco. Colectivamente, os nossos resultados mostram pela primeira vez que o potencial de SLPI como um biomarcador baseado em mecanismo, não-invasivo de progressão do cancro oral com potencial no tratamento preventivo

citação:. Yang Y, Rhodus NL, Ondrey FG, Wuertz BRK, Chen X, Zhu Y, et al. (2014) Quantitative proteômica Análise de Oral Escova Biópsias Identifica secretora leucócitos Inibidor de Protease como um promissor, baseado na Mecanismo Oral Cancer Biomarcador. PLoS ONE 9 (4): e95389. doi: 10.1371 /journal.pone.0095389

Autor: John M. Koomen, Moffitt Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de janeiro de 2014; Aceito: 25 de março de 2014; Publicação: 18 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão 1R01DE017734 do National Institutes of Health (EUA) para TJG e bolsas de investigação 81000439 e 81271134 da National Natural Science Foundation da China para Y.Y. e Y.Z. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Infelizmente, a taxa de sobrevivência para pessoas diagnosticadas com câncer oral, predominantemente na forma de carcinoma de células escamosas oral (CCEO), é apenas um pouco melhor do que 50% [1]. CEB é precedido pela ocorrência de uma lesão pré-maligna oral, leucoplasia comumente, que transforma a cancro invasivo em 5% a 17% dos casos [2], [3]. Se diagnosticado precocemente, tratamentos preventivos são mais eficazes, aumentando a taxa de sobrevivência de 80% ou mais [4]. Assim, existe uma necessidade urgente de melhores formas de diagnosticar e tratar OPML em situação de risco e /ou em estágio inicial CCEO lesões orais [2].

biópsia incisional Invasiva seguido por exame histopatológico é o padrão ouro atual para via oral diagnóstico de câncer [5]. Infelizmente, ele tem várias limitações. A natureza invasiva e dispendiosa leva a testes menos frequentes de lesões suspeitas e, consequentemente, um diagnóstico tardio de CCEO [6], [7]. Um estudo retrospectivo encontrou apenas cerca de uma taxa de seguimento 14% para biópsias de bisturi dentro de um período de [2] de 3 anos. Além disso, a biópsia bisturi é propenso a sub-amostragem de lesões [8], [9], levando a erros de diagnóstico.

Tendo em conta estas limitações da biópsia bisturi, muita atenção tem sido dada à identificação de biomarcadores moleculares indicativa da doença em amostras de doentes de forma não invasiva recolhidos [10]. Um método de amostragem não invasivo promissora é a utilização de biópsias da escova [11], [12]. Aqui, uma escova relativamente rígido é utilizado para recolher suavemente uma amostra de células trans-epitelial directamente a partir da lesão por via oral, ou combinado mucosa oral. Esta recolha é simples e barata, com o mínimo de desconforto para o paciente. Mais importante que fornece uma amostra potencialmente rico em informações das células diretamente da lesão, que pode ser ainda analisada [11], [12].

Para desenvolver biomarcadores moleculares não-invasiva recolhidos a partir de biópsias de pincel, prometendo moléculas candidatas dentro destas amostras deve primeiro ser identificadas. tecnologias em grande escala para perfilamento molecular (por exemplo, genômica, proteômica) pode identificar esses candidatos. Em particular, a análise usando proteômica baseada em espectrometria de massa poderia fornecer não só leva em biomarcadores de proteína acionáveis ​​destas amostras, mas também subjacente conhecimento dos mecanismos de progressão do câncer e possíveis alvos para o tratamento. atenção no entanto, a análise proteômica das biópsias escova orais via proteômica baseados em MS tem visto limitado [13], [14], especialmente utilizando as tecnologias mais contemporâneas no campo. Até à data, ninguém aplicou proteômica quantitativos baseados em MS espingarda, sem dúvida, o método in-depth mais versátil e de proteomas caracterizam [15], a análise de biópsia escova oral.

Neste estudo, temos aplicado quantitativa proteômica shotgun MS-baseado na análise de biópsias escova recolhidos a partir de tecidos normais e saudáveis, OPML, e CCEO. Dentre uma série de proteínas que apresentam diferenças replicados abundância, a proteína de secreção de inibidor de protease de leucócitos (SLPI) mostrou dramática diminuição relativa aos tecidos normais correlacionados com os passos da progressão do cancro oral. Esta diminuição da abundância de SLPI foi verificada através de western blot em amostras de biópsia da escova, e também foi observado em células esfoliadas na saliva total de pacientes OPML e CEs. Consistente com os resultados dos pacientes, as linhas celulares modelo de OPML e CCEO também mostrou uma diminuição na SLPI. Além disso, o tratamento de uma linha celular com SLPI OPML modelo mostrou uma inibição da actividade de NF-kB, um factor de transcrição conhecido por desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro mecanismos inflamatórios via oral subjacente. Colectivamente, os nossos resultados mostram pela primeira vez que uma perda progressiva de SLPI abundância na transição do OPML para CEB, e sugerem um novo papel para o SLPI como um biomarcador ligado mecanismo, não-invasivo de cancro oral, com potencial como um tratamento OPML agente.

Materiais e Métodos

pacientes e espécimes

o estudo foi feito com consentimento informado por escrito de todos os doadores de exemplo usando um protocolo sujeito humano aprovado pelo Institutional Review Board na da Universidade de Minnesota (IRB número do estudo 0001M34501). Todas as coleções de saliva foram feitas sem estimulação via babando passivo, durante o dia entre as horas de 09:00 e 17:00. Inteiros de saliva e escova biópsias foram coletados de 11 pacientes diagnosticados com um OPML displásicos e 11 pacientes com CEB na Universidade de Minnesota Otorrinolaringologia clínica. Para cada paciente, as amostras de saliva foram coletadas primeiro, seguido da coleta de biópsias escova da lesão e da mucosa saudável de área contralateral correspondente, usando pincéis Rovers Orcellex (Rovers Medical Devices B.V., Holanda). biópsias escova de mucosa oral e saliva total também foram coletados de 10 voluntários saudáveis. Os voluntários saudáveis ​​não tinha principais fatores de risco para CEB (não-fumantes, moderada a baixa uso de álcool) e estavam livres de lesões orais. Imediatamente após a colheita, as amostras foram armazenadas a -20 ° C, e, em seguida, transferido para -70 ° C até à sua utilização. Além disso, informações sobre o tabaco e de álcool dos pacientes foram coletadas. As características da população do estudo estão resumidos na Tabela S1.

Linhas Celulares

células MSK Leuk1 [16], cresceu de mucosa bucal adjacentes às lesões leucoplasia, foram um presente do Dr. Peter Sacks, da Universidade de Nova Iorque. células MSK Leuk1 foram cultivadas em KGM-2 Média (Lonza Walkersville, MD) suplementado com extracto de pituitária de bovino, factor de crescimento epidérmico humano recombinante, insulina humana recombinante, hidrocortisona, epinefrina, e transferrina a 37 ° C em 5% de CO

2 .

Transformado queratinócitos epidérmicos humanos (Rhek) imortalizadas pelo vírus Ad-12 SV40 [17] foram obtidas do Dr. Jhong S. Rhim no Instituto Nacional do Câncer, (Frederick, MD). A linha de células CCEO CA-9-22 [18], foi um presente de Toshio Kuroki, MD. As células foram mantidas em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 10% de soro fetal de bovino, L-glutamina (5,8 mg /ml), e penicilina /estreptomicina (50 ug /ml) a 37 ° C em 5% de CO

2 como aderentes culturas em monocamada.

escovado Preparação amostra de biópsia

Para estudos de proteômica de descoberta baseados em MS e estudos de validação western blot, amostras de biópsia escova de indivíduos que caem nos dois grupos foram preparados de forma idêntica. A fim de maximizar a recuperação de péptidos e minimizar etapas de manipulação de amostras, utilizou-se um “on-escova” método de digestão para produzir uma solução de péptido para análise proteómica à base de MS (ver Figura 1A na secção de resultados). A cabeça da escova foi submersa e lisadas em 50 mM de Tris a pH 8,0 com 2% de SDS a 95 ° C durante 10 min com agitação em vórtex intermitente. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação a 16 100 x g e recuperando o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. a recuperação de proteínas foi medida utilizando o ensaio de BCA (Thermo Scientific). As proteínas recuperadas foram então digeridos e processados ​​para análise por espectrometria de massa subsequente ou usadas para validação western blot.

A. Escovar coleção biópsia e protocolo de preparação da amostra. Projeto B. experimental para quantitativos experimentos de proteômica baseados em MS. Um experimento utilizou tecido combinado de pacientes OPML, enquanto o segundo experimento utilizou combinado de tecidos de pacientes com tumores.

Isobaric Peptide Tagging e Preparação de Amostras

Proteínas de células escovado foram reduzidos em DTT para 1 h a 55 ° C e tripsina digerida utilizando um protocolo modificado FASP [19]. Iodoacetamida foi utilizado como o reagente de alquilação de cisteína. Os péptidos resultantes foram dessalinizadas utilizando cartuchos de extracção em fase sólida (TC18 Sep-Pak ‘, Waters). Os péptidos foram então dissolvido no tampão fornecido pelo fabricante e marcado com o reagente iTRAQ (Applied Biosystems) à temperatura ambiente durante 1 h e dessalinizada com cartuchos Sep-Pak.

As amostras foram em seguida fraccionadas por off-line HPLC semi-preparativa. Os péptidos combinados, iTRAQ-marcados foram ressuspensos em tampão A (10 mM de formato de amónio pH 10 em 98:2 água: acetonitrilo) e fraccionado por off-line de pH elevado C18 de fase reversa (RP) cromatografia [20]. Um MÁGICA 2002 HPLC (Michrom BioResources Inc., Auburn, CA) foi utilizado com uma coluna C18 Gemini-NX, de 150 mm x 2 mm de diâmetro interno, 5 um de partícula, tamanho de um poro 110 (Phenomenex, Torrence, CA). O tampão A foi de formato de amónio 10 mM, pH 10 em 98:2 água: acetonitrilo e solução tampão B foi de formato de amónio 10 mM, pH 10 em 10:90 de água: acetonitrilo. O caudal foi de 150 ul /min. com um gradiente de 0-35% de tampão B ao longo de 60 min., seguido de 35-60% ao longo de 5 min. As fracções foram recolhidas a cada 2 minutos e a absorvância de UV foi monitorizada a 215 nm e 280 nm. As fracções contendo péptido foram divididos em dois grupos iguais numeradas, “precoce” e “tardia”. A primeira fracção “precoce” foi concatenada com a primeira fracção “tardia”, e assim por diante. concatenados amostras foram secas sob vácuo, ressuspendidas em solvente de carga (98:2:0.01, água: acetonitrilo: ácido fórmico). antes da análise por espectrometria de massa

Análise de massa espectrométrica

Um ion trap linear -Orbitrap (LTQ-Orbitrap) Velos instrumento (Thermo Fisher Scientific) [21] foi usado para a espectrometria de massa. O instrumento foi operado em um modo dependente top-ten dados empregando scans da pesquisa em 30.000 resolução 300-1800 m /z. MS tandem (MS /MS) scans foram adquiridas com uma largura de isolamento de 2 m /z e maior energia de dissociação de colisão (HCD) Modo de fragmentação. 40% de energia de colisão normalizado foi utilizado com uma duração de 20 milissegundos. As configurações de controle automático de ganho foram de 3 × 10

5 íons na armadilha de íons e 1 × 10

6 na Orbitrap. exclusão dinâmica foi utilizada com duração de 15 segundos e uma contagem de repetição de 1.

identificação de proteínas e quantificação

Os arquivos brutos foram convertidos para mzXml usando msconvert (distribuído como parte de ProteoWizard 1260/06/01) . MS /MS espectros foram comparados com a base de dados humana UniProt incluindo sequências mexidos e proteínas contaminantes comuns (um total de 136,002 entradas) usando Sequest v27.0. parâmetros da pesquisa incluiu uma (unidades de massa atómica) precursor 1,6 amu e 0,8 amu fragmento de tolerância de massa, 2 perdeu clivagens, especificidade tripsina parcial, modificações fixos de cisteína carbamidomethylated, iTRAQ modificação reagente a lisinas e N-terminais, e modificação variável da oxidação da metionina. Resultados da pesquisa foram filtrados a probabilidade de 99% de proteína e 95% de probabilidade de péptido no andaime (v3.3.1, proteoma Software), produzindo uma taxa de detecção falsa de 1%. As proteínas foram quantificados utilizando software personalizado desenvolvido in-house [22]. Apenas as proteínas identificadas a partir de dois ou mais espectros MS /MS corresponde a péptidos foram consideradas para análise quantitativa. Os valores P foram atribuídos a cada proteína quantificadas por três ou mais espectros MS /MS, como descrito [22]. Tabela S2 mostra todas as informações para as proteínas identificadas e quantificadas nestas experiências.

experiências de transferência ocidentais

Para experiências de transferência de Western, um conjunto independente de amostras foi utilizado devido à falta de material de amostra a partir da inicial conjunto de amostras usados ​​em experimentos de proteômica baseados em MS. Trinta microgramas (ug) de proteína biópsia escova de cada um dos sujeitos analisados ​​em experiências de validação, ou cinquenta ug de proteína de lisados ​​de células de linhas de células, juntamente com trinta ug de proteína de controlo positivo, foram separados por 12% SDS-PAGE. As proteínas foram então transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore), e sondados com anticorpo policlonal de coelho anti-SLPI (1:250; Abcam ab46763). Os blots foram marcadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (1:10,000) e visualizado com um sistema de detecção de ECL (Thermo Scientific)

.

No caso de saliva completa, as amostras não estimuladas foram recolhidas a partir de um conjunto independente de sujeitos (4 voluntários saudáveis, 5 pacientes com OPML e 5 pacientes com CEB primário). saliva total foi centrifugado a 3000 x g a 4 ° C, o sobrenadante contendo a fracção solúvel de proteínas da saliva foi recolhida, e os peletes de células lavadas com PBS e lisaram-se para se obter proteínas celulares. A proteína total foi quantificada utilizando o ensaio de BCA (Pierce Thermo).

Os ensaios de gene repórter

As linhas de células foram colocadas em placas a 50.000 células /poço em placas de 12 poços e co-transfectadas transientemente expresso através do trânsito reagente (MirusBio, Madison, WI) com um plasmídeo do gene repórter pIgκB-Luc 24 horas mais tarde, juntamente com um repórter pCMV-Lac Z contendo o promotor de CMV e o gene Lac-Z, em pcDNA3 para ajustar para a eficiência de transfecção. A construção repórter pIgκB-Luc contém sítios de condução do gene luciferase de ligação de três imunoglobulina de cadeia G-κ NF-kB e foi gentilmente cedido a nós por Dr. K. Brown (NIAID, NIH). Após transfecção durante a noite, as células foram tratadas com SLPI recombinante humana (R D systems, Minneapolis, MN). Os lisados ​​celulares foram analisados ​​através de Tropix dupla luz Reporter Gene Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) em um Tristar dupla injecção de flash luminómetro (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Nove repetições foram medidas por ponto de dados.

Resultados

Profiling Oral Cancer de progressão associada Dynamics Protein via quantitativos Proteomics baseados em MS

Duas rodadas de proteômica quantitativos baseados em MS foram utilizado (Figura 1B), utilizando rotulagem péptido isobárica com o reagente iTRAQ [23] para analisar proteínas solúveis isolados a partir de lisados ​​de células inteiras a partir de amostras de biópsia da escova orais. Os primeiros misturas de proteínas separadas em comparação reunidos a partir de dois tecidos OPML, dois tecidos de controlo OPML combinados, dois tecidos CEs e dois tecidos normais saudáveis. As segundas misturas de proteínas separadas em comparação reunidos a partir de quatro tecidos OPML, quatro tecidos CEs compensadas, quatro tecidos de controlo CEs e quatro tecidos normais saudáveis. A concepção da amostra foi determinada principalmente pela disponibilidade de amostras clínicas, a quantidade de proteína disponível a partir de cada biópsia escova e o nosso objectivo de comparar todos os diferentes tipos de tecidos disponíveis. Um total de 643 e de 1164 proteínas foram identificados e quantificados, para a primeira e segunda análise iTRAQ e respectivamente. O aumento do número de proteínas identificadas na segunda análise era muito provavelmente devido a um aumento da proteína total, devido à mistura de amostras mais pacientes em comparação com a primeira análise. Tabela S2 mostra informações sobre todas as proteínas identificadas e quantificadas nestas experiências.

Para priorizar proteínas para experimentos de validação subsequentes, olhamos para mudanças abundância de tecidos OPML ou CEs em comparação com os tecidos normais de controle saudáveis ​​em cada experimento iTRAQ. Nós limitado ainda mais esses resultados, procurando apenas as proteínas que apresentaram diferenças de abundância relativa consistentes em ambos os experimentos iTRAQ. Um total de 21 e 15 proteínas conheceu estes critérios para OPML e CEs tecidos, respectivamente (Tabela 1). Apesar dos fenômenos reconhecidos de compressão razão da abundância devido à interferência precursor em estudos baseados em marcação de peptídeos isobaric [24], [25], observamos uma série de bastante grandes mudanças de abundância relativa ( 2 vezes) em nosso estudo. Interessantemente, apenas três destas proteínas mostrou mudanças abundância em ambos os tipos de tecidos (OPML e CEs) em comparação com (texto em negrito na Tabela 1) normal e saudável.

De aquelas proteínas apresentadas na Tabela 1, a secretora leucócitos Protease Inhibitor (SLPI), destacaram-se com base na sua grande diminuição em ambos os tecidos OPML e CEs quando comparado com normais saudáveis ​​(19,5 e 12,4 diminuição média abundância para tecidos OPML e CEs, respectivamente). Com base nestes resultados, bem como o papel conhecido de SLPI como um inibidor de protease, com conexões para o cancro oral [26], que escolheu para validar ainda mais e investigar esta proteína. Para este fim, interrogado primeiro ainda mais os dados de proteômica quantitativa em SLPI. Destacam-se os resultados da segunda experiência iTRAQ que inclui o tecido de controlo saudável CEB combinados. Os resultados mostraram que não só diminuiu o SLPI foi no tecido da lesão em comparação com CEB normais saudáveis, mas também foi diminuída no tecido saudável combinados em comparação com os tecidos normais saudáveis ​​(Figura 2). A diminuição relativamente pequena também foi observado no primeiro experimento iTRAQ entre o tecido combinado de pacientes OPML e tecidos normais saudáveis ​​(Tabela S2).

Validando Cancer Progressão-dependentes SLPI Abundância Dynamics em amostras independentes

a fim de validar a diminuição abundância observada de SLPI tanto OPML e tecidos de CCEO, primeiro perseguido semi-quantitativos experiências de transferência ocidentais em amostras de biópsia escova adicionais. Como mostrado na Figura 3A, as transferências de Western confirmaram os resultados baseados em MS, tal como o SLPI abundância mostrou um decréscimo gradual entre o tecido normal e o tecido saudável OPML, com uma redução mais dramática em tecidos CEs. Figura S1 mostra os resultados do controlo de carga através de coloração de proteína total de membranas utilizadas para resultados mostrados na Figura 3. Além disso, foram coletadas amostras de saliva todo un estimulada a partir dos mesmos pacientes que consentiram para escovar biópsias. Isolamos as células esfoliadas nestas amostras através de centrifugação e sondou as proteínas isoladas de SLPI após a lise celular. Os resultados mostraram uma tendência semelhante na diminuição abundância de SLPI entre os tecidos normais saudáveis ​​e ambos OPML e tecidos CEs (Figura 3B). Análise das proteínas solúveis contidas em sobrenadantes de saliva demonstrou uma tendência menos consistente (dados não mostrados).

. Verificação da diminuição do SLPI em tecidos colhidos por biopsia pincel. níveis de abundância B. SLPI medidos em células esfoliadas de saliva total. níveis de abundância C. SLPI medido em linhas de células modelo. controle positivo é uma amostra de saliva humana normal e saudável; células Rhek são de uma linha de células epiteliais normal, MSK é um modelo de linha de células OPML (MSK-Leuk1) e CA9-22 é uma linha de células de CCEO modelo.

Nós também a abundância testado de proteína SLPI em modelo OPML e linhas celulares CEs (Figura 3C). Aqui, nós escolhemos para comparar as proteínas solúveis isolados a partir de lisados ​​de células inteiras a partir de células de controlo, as células RHEK MSK-leuk1 (uma linha de células de modelo OPML [27]) e células Ca9-22 (uma linha de células de modelo CEB [28]). Semelhante aos resultados das biópsias escova paciente, observou-se uma diminuição drástica do SLPI na MSK-leuk1 e linhas celulares Ca9-22 comparação com as células saudáveis ​​de controle.

Testes potenciais efeitos anti-inflamatórios do SLPI tratamento sobre OPMLs

o papel da ativação e regulação de fatores pró-inflamatórios no mecanismo subjacente a transição do OPML para CEB NF-kB é bem conhecida [29], [30], [31]. Existem evidências mostrando que o SLPI inibe a NF-kB, [33] [32], embora isto não tenha sido demonstrado em modelos de cancro oral. Dada esta evidência, procurou-se investigar ou não SLPI diminui a atividade de NF-kB em células MSK-Leuk1, utilizando um ensaio de repórter baseado em luciferase [34]. Nós tratado as células MSK Leuk1 transfectadas com duas concentrações diferentes de péptido SLPI puro (20 ug /mL e 40 ug /ml), e medido de NF-kB em diferentes momentos após o tratamento (Figura 4). Os resultados para ambos os tratamentos foram comparáveis, com tanto que mostra aproximadamente uma queda de 40% no NF-kB depois de 24 horas de tratamento do SLPI. O tratamento com uma menor quantidade de SLPI (10 ug /mL) exibiram uma diminuição mais pequena e menos fiável na actividade de NF-kB (dados não mostrados).

dobrável mudança de NF-kB do gene repórter relativamente ao ensaio de controlo do veículo é representada em diferentes pontos de tempo após o tratamento.

Discussão

Temos realizado um primeiro de seu tipo, em profundidade de análise quantitativa proteômica espingarda de forma não invasiva amostras de biópsia escova orais recolhidos, buscando identificar mudanças abundância de proteínas associadas à progressão do cancro oral. biópsias de pincel são bem conhecidos por seu valor como uma amostra celular não-invasiva recolhidos para o cancro oral aplicações de diagnóstico [11], [12]. No entanto, estudos de proteômica baseados em MS aproveitando estas amostras potencialmente ricos em informação ter sido limitado. Notavelmente, Driemel et al [13] utilizado superfície melhorada, dessorção /ionização por laser (SELDI) MS para quantitativamente amostras de biópsia perfil escova e identificar potenciais biomarcadores de progressão. Remmerbach et al [14] utilizado mais padrão de MALDI-MS para analisar proteínas isoladas a partir de biópsias da escova bem. Embora estes estudos tiveram algum sucesso, o uso de uma SELDI ou métodos baseados em MALDI-mistura complexa é limitado a um subconjunto relativamente pequeno de proteínas e /ou péptidos nas amostras de interesse.

Proteómica espingarda baseada em MS

por outro lado, oferece uma vista expandida de proteomas biópsia escova, dada a sua capacidade de identificar e quantificar as proteínas de todas as classes de peso molecular [15]. Nosso estudo fornece a primeira demonstração de proteômica espingarda aplicados a amostras de biópsia escova orais. Uma pergunta no início deste estudo era saber se as células recolhidas através de biópsia escova iria fornecer um amplo proteína total para uma análise proteômica em grande escala. Verificou-se que um método de lise de células-em escova proporcionou melhor rendimento (pelo menos dezenas de microgramas de proteína total) de tentar lavar as células livres da escova antes de lise (dados não mostrados). Nossas descobertas deve abrir o caminho para proteômica shotgun análises adicionais de biópsias de pincel para a caracterização de lesões orais em diferentes contextos.

analisa Nossa réplica comparando o tecido normal saudável para OPML e CCEO tecido, bem como controles pareados, revelou uma série proteínas de interessantes que mostram mudanças na abundância. Embora outros candidatos dignos de uma validação adicional foram identificados, optamos por focar SLPI, dada a sua diminuição grande e reprodutível em abundância em ambos os tecidos OPML e CEs quando comparado ao tecido normal saudável. Os investigadores têm, tradicionalmente, reconheceu o papel do SLPI em inibir proteases de serina; No entanto, o conhecimento de suas funções têm continuado a se expandir para incluir antimicrobiana, imunidade e funções anti-inflamatórios [35]. O papel do SLPI na progressão do cancro oral é menos conhecida, no entanto, os recentes resultados em fatias de tecido biopsiados demonstrou uma diminuição na SLPI em tecidos CEs em comparação com saudável, bem como um potencial papel na inibição da invasão [26].

A nossa estudo revelou várias novas descobertas sobre o possível papel do SLPI no câncer oral. Por um lado, os nossos resultados são os primeiros a demonstrar uma queda significativa na SLPI em amostras de biópsia da escova orais recolhidos não-invasiva, bem como a fracção celular de saliva completa. Estes resultados são consistentes com os resultados recentes que mostram uma diminuição abundância SLPI em fatias de tecido de CCEO recolhidos através de biópsia bisturi tradicional [26]. É importante salientar o nosso estudo é o primeiro a analisar tanto tecidos CEs OPML e, demonstrando uma perda progressiva de SLPI no estado pré-maligno, seguido por uma diminuição CEB mais dramático. Nossos resultados sugerem um papel potencial para SLPI como um biomarcador para diagnóstico ou prognóstico de forma não invasiva recolhidos tanto em tecidos OPML ou CEs – uma descoberta significativa, dada a necessidade urgente de testes mais simples e mais baratas para o cancro oral que contornar as desvantagens de biópsia bisturi [8] [9].

Nossos resultados também sugerem um papel mecanicista para SLPI na progressão do cancro oral. Recentes descobertas usando

in-vitro cultura de células

sugeriram que SLPI inibe a capacidade de invasão das células cancerosas orais [26]. Estendendo estas conclusões, os nossos resultados sugerem uma redução sistêmica em SLPI, pelo menos em células epiteliais orais, em doentes susceptíveis ao desenvolvimento de câncer oral. Esta afirmação foi apoiada por cerca de uma diminuição de 5 vezes na SLPI em tecido saudável combinado em comparação com controles normais saudáveis, com uma diminuição concordante em sua abundância em células esfoliadas na saliva todo. Determinação da base (por exemplo, genética, epigenética etc.) para esta perda global em SLPI abundância em pacientes que desenvolvem CEB vai demorar mais investigação.

Nossos resultados demonstram que SLPI inibe a atividade transcricional de NF-kB in vitro em células de OPML apoia ainda mais o seu papel mecanicista na progressão do cancro oral. O aumento da actividade transcricional de NF-kB, activação da expressão de citoquinas pró-inflamatórias, é um factor conhecido no desenvolvimento CEB [29], [30], [31]. Uma diminuição na abundância SLPI pode, pelo menos em parte, ser um fator contribuinte para o estado pró-inflamatório levando a CEB. Outros têm demonstrado um papel para o SLPI como um inibidor da actividade de NF-kB, demonstrando que este pode interromper a via de sinalização que conduz a activação de NF-kB [36] e /ou, possivelmente, competem para a ligação a DNA em sítios reguladores de NF-kB [32 ]. O nosso estudo é o primeiro a mostrar o SLPI como um inibidor de NF-kB, no contexto de cancro oral, especificamente numa linha celular OPML modelo. Compreender o mecanismo exacto de inibição levará mais investigação. Nossa observação abre a possibilidade intrigante de SLPI como uma opção de tratamento para lesões OPML em situação de risco, uma vez que tais tratamentos são urgentemente necessários para prevenir o desenvolvimento de CCEO invasivo. SLPI oferece vantagens possíveis Numa tal aplicação, uma vez que é uma proteína pequena (aproximadamente 11 kDa), que se sabe estar livres de modificações pós-traducionais, e mostrado para ser absorvida pelas células prontamente [32].

nossos resultados gerar um número de hipóteses intrigantes para testes no futuro. Por um lado, a possibilidade de SLPI como um biomarcador de diagnóstico ou prognóstico de forma não invasiva recolhido pode ser testado em maior número de pacientes e OPML CEs. O seu papel como um inibidor de NF-kB em OPML, com potencial para o tratamento preventivo poderia ser testado e investigado em vários modos. Experimentos examinando a natureza da inibição, como a ligação directa em locais de NF-kB, e efeitos na expressão gênica e protéica seria iluminador. Testando versões truncadas de SLPI também podem mostrar aumento efeitos inibidores sobre NF-kB devido a uma melhor absorção e /ou ligação ao DNA celular. Em uma nota final de interesse, evidências recentes também sugerem um papel para SLPI na inibição da infecção humana do vírus do papiloma (HPV) e desenvolvimento de cabeça e pescoço câncer subsequente [37]. Investigação sobre os efeitos do tratamento SLPI para células HPV + câncer seria de grande interesse. Os resultados que apresentamos aqui um ponto de partida para tais investigações futuras, o que poderia solidificar SLPI como uma proteína de alto valor no diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer oral.

Os dados de espectrometria de massa proteômica foram depositados ao ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) através do repositório parceiro PRIDE [38] com o PXD000807 identificador de conjunto de dados e DOI 10,6019 /PXD000807.

Informações de Apoio

Figura S1.

Coommassie manchado imagens da carga de proteína total (A) escovado pacientes cellsfrom orais; (B) esfoliada pacientes salivafrom inteiros cellsfrom; (C) linhas de células primárias, incluindo queratinócitos, células RhEK leucoplasia MSK, e CA-9-22 células cancerosas orais. Estas membranas foram usadas para obter resultados de Western blotting mostrados na Figura 3 de texto

doi:. 10.1371 /journal.pone.0095389.s001

(DOC)

Tabela S1. .

Características dos pacientes

doi: 10.1371 /journal.pone.0095389.s002

(DOC)

Tabela S2.

Todas as proteínas identificadas e quantificadas por análises proteômicas. Os resultados das duas análises separadas iTRAQ-bases de reagentes proteômica são mostrados em planilhas separadas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0095389.s003

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Reconhecimentos

os autores são gratos para o Centro de Espectrometria de Massa da Universidade de Minnesota, em particular LeeAnn Higgins e Todd Markowski, para obter assistência com a preparação da amostra e análise instrumental. Os autores também reconhecem a Supercomputing Instituto Minnesota para a sua manutenção de software e hardware utilizados para análise dos dados.