Abstract

células-tronco cancerosas (CSC) ou células semelhantes a células-tronco cancerosas (CSC-LCs) foram identificados em muitos tumores malignos. CSCs são propostas a ser relacionado com a resistência aos medicamentos, recidiva tumoral e metástases e são considerados como um novo alvo para o tratamento do câncer; no entanto, existem poucos relatos sobre CSCs ou CSC-LCs em carcinoma de células renais (RCC). Diferentes abordagens têm sido relatados para a identificação CSC, mas não há marcadores universais para a CSC. Foram utilizadas duas abordagens diferentes, a abordagem tradicional população lado (SP), e a abordagem enzimática (aldeído desidrogenase 1 (ALDH1)) para identificar a população CSC-LC em duas linhas de células RCC, ACHN e KRC /Y. Descobrimos que ACHN e KRC /Y contêm 1,4% e 1,7% de células SP, respectivamente. células ACHN SP mostrou uma esfera mais elevada capacidade de formação, resistência aos medicamentos, e uma capacidade ligeiramente superior tumorigénica em ratinhos SCID do que os não-SP células NOD /(NSP), sugerindo que as células com propriedades CSC-LC estão incluídos nas células ACHN SP. células NSP KRC /Y SP e não mostrou diferença em tais propriedades. A análise revelou que a actividade ALDH1 células SP ACHN expressa um nível mais elevado de actividade do que as células NSP (SP vs NSP: 32,7% vs 14,6%). A análise das células ACHN ALDH1-positiva revelou que eles têm uma maior capacidade de formação de esfera, a capacidade de auto-renovação, a tumorigenicidade e expressar níveis mais elevados de ARNm de genes relacionados com a propriedade de CSC-LC (por exemplo, os genes de transportadores ABC, genes de auto-replicação, anti- genes de apoptose, e assim por diante) que as células ALDH1-negativas. O tratamento medicamentoso ou exposição a condição hipóxica induziu um aumento de 2 a 3 vezes no número de células ALDH1-positiva. Em conclusão, os resultados sugerem que a população de células ALDH1-positiva ao invés de células SP mostram propriedades CSC-LC em uma linha de células RCC, ACHN

Citation:. Ueda K, Ogasawara S, Akiba J, Nakayama M, Todoroki K, Ueda K, et al. (2013) a aldeído desidrogenase 1 Identifica células com Cancer Stem propriedades semelhantes a células em uma linha celular Carcinoma Renal Humano. PLoS ONE 8 (10): e75463. doi: 10.1371 /journal.pone.0075463

editor: Masaharu Seno, Universidade de Okayama, Japão

Recebido: 25 Março, 2013; Aceito: 14 de agosto de 2013; Publicação: 08 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ueda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células renais (CCR) é uma das mais. a maioria dos tumores malignos comuns do trato geniturinário, sendo responsável por 116.500 mortes em 2008 de acordo com a Organização Mundial da Saúde [1]. A incidência da RCC tem vindo a aumentar ao longo dos últimos 30 anos [2]. Além disso, porque RCC metastático é notoriamente resistente a maior parte das terapias convencionais, tais como a quimioterapia e a radioterapia, o prognóstico dos doentes com RCC é pobre como um terço dos pacientes que já têm a doença metastática no momento do diagnóstico inicial, e de 30-40% deles desenvolvem distante metástases após a ressecção do tumor primário [3]. Nos últimos anos, as terapias orientadas moleculares que têm sido desenvolvidos têm mostrado respostas objectivas importantes [4] – [6], e são agora reconhecidos como os actuais terapias padrão de RCC metastático. No entanto, a eficácia destas terapias alvo molecular é insuficiente.

Os dois modelos dominantes de carcinogênese são o modelo estocástico (evolução clonal) ea organização hierárquica do tumor modelo (células-tronco do câncer (CSC)). De acordo com o modelo de evolução clonal tradicional, a formação de tumores é a consequência da acumulação de acontecimentos genéticos aleatórios em células normais diferenciadas, enquanto que o modelo de CSC postula que um único CSC dá origem a uma organização hierárquica dentro de um tumor [7], [8]. Estudos recentes sugerem que os CSCs podem ser responsáveis ​​para a tumorigénese e contribuir para a resistência de alguns indivíduos a terapia do cancro, o que resultou em recidiva e metástase [9] cancro, [10]. Portanto, acredita-se que a identificação e caracterização de CSC ou célula-célula como cancro da haste (CSC-LC) pode contribuir significativamente para o desenvolvimento de terapias eficazes. Bussolati et ai. identificou uma população de tumor positivo CD105 células iniciando em CCRs, e uma revisão da literatura sobre o papel das células-tronco em RCC humana [11], [12]. Kim et al. relatou que a expressão de marcadores de células estaminais, OCT4 e CD133, pode servir, respectivamente, como um marcador de prognóstico pobre e favorável, em papilar RCC [13]. Além disso, eles sugerem que a expressão de CD133 é um marcador de prognóstico favorável [14].

Há muitos relatos de que CSC-LCs de alguns tumores sólidos estão presentes na população lateral (SP), as células RCC células claras [15], [16], mas há poucos relatos sobre o papel das células SP na RCC humana [17], [18]. células SP foram originalmente identificados em análises por citometria de fluxo por sua capacidade de efluxo de corante vital ADN, Hoechst 33342, resultando em células de SP, e células Hoechst-positivos não-SP (NSP) Hoechst-negativo. Estudos anteriores de câncer in vitro e tumores primários in vivo demonstraram que as células SP são exclusivamente capaz de gerar tanto populações de células NSP SP e, exibindo propriedades consistentes com células-tronco ou CSC. células SP expressam altos níveis de ATP-vinculativo cassete (ABC) membros da família transportador, especialmente ABCG2, e apresentam resistência aos medicamentos mais quimioterápico do que as células NSP em linhas celulares derivadas de alguns tumores sólidos malignos humanos, como câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário e cancro de células escamosas [19] – [21]

recentemente, tem sido relatado que um aldeído desidrogenase (ALDH1) é responsável pela oxidação de retinol para o ácido retinóico e desempenha um papel central no desenvolvimento embrionário e na homeostase. em vários órgãos [22]. Alguns investigadores relataram que a elevada expressão de ALDH1 foi associada com a resistência à droga e de prognóstico reservado, e que é um marcador ALDH1 CSC [23], [24]. Ozbek et ai. relatado que a expressão ALDH1 foi correlacionada com o grau do tumor na RCC [25], mas as características biológicas das células ALDH1 positivo em RCC são ainda desconhecidos.

Neste estudo, foram isoladas células SP a partir de duas células RCC humana linhas e sistematicamente investigadas as propriedades CSC das células SP e células ALDH1-positivo e relação entre as células SP e células ALDH1-positivos.

Materiais e Métodos

linhas celulares e animais

Foram utilizadas duas linhas de células RCC: um derivado de efusão pleural maligna de um paciente com carcinoma de células renais (ACHN) e outro derivado de lesão primária de um paciente com carcinoma de células renais (KRC /Y). Estes 2 linhas de células RCC têm alta proliferativa e capacidades formadoras de colónias

in vitro

e possuem alta tumorigenicidade em ratinhos nus mesmo

in vivo

. ACHN foi adquirido a partir de American Type Culture Collection. KRC /Y foi criada em nosso laboratório [26]. O meio de cultura para ACHN consistiu em meio modificado de Eagle (EMEM) (Gibco, BRL /Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA). O meio de cultura para KRC /Y consistiu em meio modificado por Dulbecco (DMEM) (Nissui Seiyaku Co., Tóquio, Japão) suplementado com inactivado pelo calor (56 ° C, 30 min), 5% de soro fetal bovino (FBS, Bioserum, Vic, Austrália ), 100 U /mL de penicilina e 100 ug de estreptomicina (Gibco BRL /Life Technologies Inc.). As células foram cultivadas numa atmosfera de 5% de CO

2 no ar a 37 ° C. não obesos diabéticos /Imunodeficiência Combinada Grave (NOD /SCID) Feminino (5 semanas de idade) foram adquiridos (Clea Japan, Inc., Osaka, Japão), e alojados em armários de fluxo laminar sob condições específicas livres de patógenos. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ética em Experimentação Animal de Kurume University School of Medicine.

Expressão da CSC Marcadores em linhas de células RCC

Foram analisadas a expressão do putativo CSC marcadores ABCG2, CD90, CD105, CD133 e molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) em ACHN e KRC /Y. As células foram incubadas no escuro a 4 ° C durante 30 minutos com anticorpos monoclonais conjugados com fluorescência-, incluindo isotiocianato de fluoresceína (FITC) de anticorpo CD90 anti-humano de rato -conjugated (5E10, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e de ratinho anti anticorpo CD105 -sangue humano (MEM-226, EXBIO, Praha, Czech) e ficoeritrina (PE) -conjugated CD133 /2 anticorpos (293C3, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemanha) e anticorpo anti-EpCAM (ABE-1, BD Biosciences ). As células com anti-BCRP anticorpo monoclonal de ratinho (ABCG2) (BXP-21, Chemicon, Temecula, CA, EUA) foram incubadas durante 30 minutos e posteriormente incubadas no escuro a 4 ° C durante 30 minutos com cabra conjugado com FITC anti-murganho Ig (FITC-GAM) (BD Biosciences). As células foram lavadas, ressuspensas e analisadas num FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA).

Células cultivadas

Identificação SP celular e CSC marcador Expressão em Células SP e NSP

com 80 % de confluência foram descoladas com Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, EUA) e suspensas a 1 x 10

6 células /ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com 2% de FBS e depois incubadas com Hoechest 33342 corante por si só (5 ug /mL para ACHN e 10 ug /mL para KRC /Y) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) ou com 20 ug /ml de reserpina (Sigma-Aldrich) a 37 ° C durante 60 min. As amostras foram lavadas, centrifugadas e ressuspensas em 2 ml de PBS frio suplementado com 2% de FBS, em seguida foi adicionado iodeto de 1 ug /mL de propídio (PI) (BD Biosciences) e as células foram filtrados através de um 40 um filtro celular (BD Biosciences). A análise de citometria de fluxo foi realizada como previamente descrito [27]. A reserpina é convencionalmente utilizado como um parâmetro de orientação para determinar a fronteira entre células SP e PEN. As análises foram realizadas com um FACSAria II (BD Biosciences). A expressão de CD90 e EpCAM em ACHN, e que de CD105 e EpCAM em KRC /Y, em SP e células NSP foi ainda examinado. As células foram coradas utilizando o método descrito acima.

Ensaio de Crescimento de Células de Células SP e NSP

Um total de 2.000 células e células SP NSP foram plaqueadas em placas de 96 poços e cultivadas num CO

2 incubadora. As células foram colhidas às 24, 48, 72, 96, 120 ou 144 horas e a proliferação foi analisada no ensaio colorimétrico, utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il-il -) – brometo de tetrazólio 2,5-difenil (MTT ) kits de ensaio de crescimento celular (Chemicon, Temecula, CA, EUA), como descrito em outros lugares [28].

Formação de Colónias ensaio de SP e células NSP

O ensaio de ancoragem agar mole independente crescimento clonogênica foi realizada. Resumidamente, 2 × 10

4 células foram suspensas em 2 mL de EMEM ou DMEM contendo 0,36% de agar mole (Gibco BRL /Life Technologies Inc.) e 10% de FBS numa placa de 35 mm. A suspensão de células foi então coberta com um disco de agar presolidified 0,72%. O meio contendo 0,36% de agar mole foi completada, uma vez por semana. Colónias ( 10 células) que surgiram dentro de 3 semanas foram apresentados como clonogenicidade. Cinco pratos foram examinados para cada tipo de célula e cegamente contado sob o microscópio (× 200) em todos os campos.

Formação Sphere Ensaio de SP e Células NSP

SP isoladas e células NSP dos dois linhas de células (4000 células /placa) foram cultivadas em meio isento de soro, incluindo o factor de 10 ng /mL de crescimento epidérmico (EGF) (Sankojunyaku, Tóquio, Japão) e 20 ng /de factor de crescimento de fibroblastos básico mL (bFGF) (Sankojunyaku) usando ultra- -baixa-fixação placas de 6 poços (Corning Inc., Corning, NY, EUA) por 1 semana, após a qual a formação de esfera foi avaliada por contagem do número de esferas ( 3 células). sob o microscópio (200 ×)

Drug Resistance Ensaio

Isolado SP e NSP células foram plantadas em 2.000 células por poço em placas de 96 poços, e o efeito do inibidor multiquinase sorafenib (2 M) (Cell Signaling Technology. Inc. , Danvers, MA, EUA) e IFNa (4000 UI /ml) (oif, Otsuka Pharma Co., Ltd., Tóquio, Japão) foi examinada. A resistência às drogas foi determinada após o tratamento durante 72, 96 ou 144 horas por ensaio MTT.

tumorigenicidade Ensaios de SP e Células NSP in vivo

Para explorar a capacidade tumorigénica, SP e células NSP (1, 10 ou 100 × 10

3) foram isolados a partir das duas linhas de células RCC, colocados em meio de 100 ml, e injectados separadamente para dentro do espaço subcutânea no flanco de ratinhos de cinco semanas de idade NOD /SCID fêmea sob anestesia. capacidade Oncogenia foi julgado 8 semanas após a injecção.

cDNA Preparação e quantitativo em tempo real RT-PCR para Gene Expression Assay

Depois de células SP e NSP em ACHN e KRC /Y foram isolados, o total o ARN foi extraído utilizando um Kit RNeasy Além disso Micro (Qiagen, Valencia, CA, EUA), e ADN complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando o sistema de transcrição reversa (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Quantitativa em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR) foi realizada para examinar a expressão de genes relacionados com a propriedade de CSC-LC (por exemplo, genes de transportador ABC (ABCB1 e ABCG2), genes de auto-replicação (BMI1 e c-myc), genes anti-apoptose (BCL2 e CFLAR), genes relacionados à hipóxia (hipóxia fator inducible 1α (HIF1α) e de crescimento endotelial vascular fator-A (VEGFA)) e epiteliais-mesenquimais transição (EMT) genes relacionados com (Caracol e torção) ) com um ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Gene ensaios de expressão e de Iniciador e Sonda misturas foram utilizados para ABCB1, ABCG2, ALDH1A1, BMI1, c-MYC, BCL2, CFLAR, HIF1α, VEGFA, Caracol, Twist, e β-actina (IDs de ensaio (HS 00184500_m1, Hs00184979_ml, Hs00946916_m1, Hs00180411_ml, Hs00153408_ml, Hs00608023_m1, Hs00153439_m1, Hs00153153_ml, Hs00900055_ml, Hs00195591_m1, Hs01675818_s1, e Hs99999903_m1, respectivamente; Applied Biosystems), e condições de ciclos térmicos foram as seguintes: incubação inicial a 95 ° C durante 10 min, em seguida 40 ciclos alternando sucessivamente com 95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 20 s, e 72 ° C durante 15 s, e depois mantida a 72 ° C durante 10 min.

a análise da expressão do gene comparativa foi realizada utilizando o 2

(- ΔΔCt) métodos com a normalização do nível de gene controle interno, β-actina

Expression ALDH1 em SP e NSP células e em células em condições patológicas

expressão ALDH1 foi investigada em. as amostras preparadas a partir de SP e células NSP, as células tratadas com o fármaco, e as células cultivadas sob condições hipóxicas. Resumidamente, as células SP e NSP foram isolados a partir de células e ACHN KRC /Y cultivadas durante 72 horas, utilizando o método descrito acima. células parentais e isolado e SP células NSP foram utilizados como amostras. células ACHN cultivadas com EMEM contendo Sorafenib (1 M) ou IFN (4.000 UI /m) por 48, 72 ou 96 horas e as células cultivadas em hipoxia (1% O

2) condições de 48, 72 ou 96 horas foram também utilizado como as amostras. As amostras foram suspensas em tampão de ensaio ALDEFLUOR contendo substrato de ALDH, BAAA (Bodipy-aminoacetaldeído) (50 ug de reagente seca), com ou sem 5 ul da dietilaminobenzaldeído inibidor da ALDH específica (deab 1,5 mM em 95% de solução de estoque de etanol), como um negativo controle, e incubado durante 60 min a 37 ° C (KIT ALDEFLOUR, Stem tecnologias células, Vancouver, BC, Canadá), e analisados ​​por citometria de fluxo (FCM).

características biológicas de ALDH1-positivas e ALDH1- As células negativas

ensaio de formação

Sphere foi realizada em ACHN e células KRC /Y. Ensaio de tumorigenicidade e ensaio de expressão de genes foram realizados para examinar características biológicas das células ACHN ALDH1-positivos e ALDH1-negativo. Para comparar a capacidade de auto-renovação entre células ACHN ALDH1-positivos e negativos ALDH1, examinámos uma capacidade de formação de esfera por três passagens seriadas sucessivas de células individuais-dissociado de acordo com o método de Lim et ai. [29]. Resumidamente, após a dissociação da primeira passagem esfera com 0,25% de tripsina, as células individuais-dissociados em ALDH1-positivos e negativos ALDH1-células de ACHN foram plaqueadas em placas de 6 poços. Uma semana mais tarde, o número de esferas foi contada e o mesmo processo foi repetido mais uma vez. Ensaio de tumorigenicidade e ensaio de expressão do gene foi realizada como descrito acima, excepto a comparação em 1 × 10

3 células não foi executada no ensaio de tumorigenicidade.

Análise estatística

comparação do crescimento da célula de ensaio foi realizada utilizando de dois factores ANOVA factorial, e os de ensaio de formação de colónia, ensaio de formação de esferas, e o ensaio de resistência à droga foram realizadas utilizando Student

t

-test. As outras comparações de dados foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney. Um valor de

P Art 0,05 foi considerado significativo

Resultados

Expressão da CSC Marcadores

ACHN expressa CD90 (96,9%) e EpCAM (. 87,7%), mas a expressão de CD105 (1,5%), CD133 (1,3%) e ABCG2 (0,9%) manteve-se em níveis muito baixos. Por outro lado, KRC /Y expressa CD105 (28,9%) e de EpCAM (93,0%), mas a expressão de CD90 (1,7%), CD133 (1,7%), e ABCG2 (2,9%) foi muito baixa.

células SP Análise e expressão de marcadores CSC em SP e NSP Cells

As frações celulares SP em ACHN e KRC /Y foram de 1,4% e 1,7%, respectivamente (Fig. 1A). Subsequentemente, foi examinada a expressão de marcadores de CSC, tais como CD90 e EpCAM em ACHN, e CD105 e EpCAM em KRC /Y, em SP e células de PNS. Não houve diferença aparente no CD90 e expressão EpCAM entre SP e células NSP em ACHN. Embora não houve diferença na expressão de EpCAM entre SP e células PNS de KRC /Y, a expressão CD105 nas células SP (24,6%) foi muito mais elevado do que em células de NSP (4,6%) (Fig. 1B).

(A) e ACHN KRC /Y foram marcadas com Hoechst 33342, e, em seguida, analisadas por FCM. As taxas de células SP em ACHN e KRC /Y foram de 1,4% (A-A) e 1,7% (A-C), respectivamente, que diminuiu significativamente na presença de reserpina (a-b, a-d). A experiência foi repetida pelo menos três vezes para cada linha celular e os resultados quase idênticos foram obtidos. Uma figura representativa de nossas experiências é mostrado. (B) Não houve diferença aparente no CD90 e expressão EpCAM entre SP e células NSP em ACHN. Na linha celular KRC /Y, embora não houve diferença na expressão de EpCAM, células SP expressa uma taxa mais elevada de células CD105-positivos do que as células NSP (SP vs NSP: 24.6% vs 4.6%). As experiências foram repetidas duas vezes, e quase resultados idênticos foram obtidos. Uma figura representativa de nossas experiências é mostrado.

Características biológicas de SP e Células NSP em ACHN e KRC /Y in vitro

Não houve diferença significativa na capacidade proliferativa das células e clonogenicidade entre SP e células NSP em ACHN. Por outro lado, após cultura durante 48 horas, as células SP em KRC /Y tinha uma capacidade significativamente maior do que as células proliferativa NSP (

P

0,0001) (Fig. 2A). Embora as células de SP em KRC /Y tinha um clonogenicidade significativamente mais elevada do que as células NSP (

P

0,01) (Fig. 2B), não houve diferença significativa na capacidade de formação esfera entre SP e células PNS de KRC /Y. Por outro lado, as células SP em ACHN tinha uma capacidade de formação de esfera significativamente maior do que as células NSP (Fig. 2C). Depois de 72, 96 ou 144 horas de tratamento com sorafenib ou IFNa, a sensibilidade para cada fármaco foi avaliada com o ensaio MTT. Não houve diferença na sensibilidade entre as células e as células SP PNS de KRC /Y contra Sorafenib ou IFNa tratamento. No entanto, as células de SP em ACHN tinha uma significativamente maior resistência IFNa (

P

0,0001). (Fig. 2D)

(A) curvas de crescimento de células de SP e PEN. células SP em KRC /Y mostrou uma capacidade proliferativa maior em comparação com células NSP (*

P Art 0,0001). (B) O clonogenity foi significativamente aumentado nas células SP em KRC /Y (*

P

0,01). (C) Esfera capacidade de formação foi significativamente maior em células de SP em ACHN (*

P

0,05). (D) A resistência aos medicamentos de SP e células NSP tratados com Sorafenib ou IFNa. células SP em ACHN teve maior resistência IFN (*

P Art 0,0001). Os experimentos foram repetidos duas vezes, e os resultados quase idênticos foram obtidos.

tumorigenicidade Os ensaios in vivo em SP e Células NSP

Ambos células NSP SP e mostrou tumor capacidade de formação em cada um dos duas linhas de células RCC. A proporção de tumorigenicidade entre as células SP e NSP em ACHN e KRC /Y não foi significativamente diferente, mas a tumorigenicidade de células SP foi ligeiramente maior do que a de células NSP em ACHN (Tabela 1).

análise do CSC-LC propriedade relacionada com a Expressão gênica em SP e células NSP por qRT-PCR

Não houve diferenças significativas nas expressões de mRNA de genes transportadores ABC (ABCB1 e ABCG2), genes de auto-replicação (BMI- 1 e c-myc), genes anti-apoptose (BCL2 e CFLAR), genes relacionados com a hipoxia (VEGFA e HIF1α), e genes relacionados (EMT-Snail e torção) entre SP e células NSP nas linhas celulares 2. células SP em ACHN expressa um nível ligeiramente superior de mRNA ALDH1A1 do que as células NSP, mas não foi observada nenhuma diferença aparente na KRC /Y (Fig. 3).

Não houve diferenças significativas nas expressões de mRNA de genes transportadores ABC (ABCB1 e ABCG2), genes de auto-replicação de genes (IMC-1 e c-Myc), anti-apoptose (BCL2 e CFLAR), genes relacionados à hipóxia (VEGFA e HIF1α), e genes relacionados com a EMT (Caracol e torção) entre SP e células NSP nas linhas celulares 2. células SP em ACHN expressa um nível ligeiramente superior de mRNA ALDH1A1 do que as células NSP, mas não foi observada nenhuma diferença aparente na KRC /Y. O experimento foi repetido pelo menos quatro vezes para cada linha celular e quase idênticos resultados foram obtidos.

ALDH1 Expressão e características biológicas de ALDH1-positivas e ALDH1-negativas células RCC

a taxa de células ALDH1 positivo em células KRC /Y foi de 6,5%. Não houve diferença na expressão ALDH1 entre SP e células de PNS. Em células ACHN, a taxa de células ALDH1-positivo foi de 15,3%. Além disso, o número de células SP ALDH1-positivo (32,7%) foi mais elevada do que a de células de NSP (14,6%) (Fig. 4A). O crescimento celular foi significativamente suprimida em células tratadas com Sorafenib ou IFNa e em células expostas a hipoxia, em comparação com células de controlo (Fig. 4B). Em relação à expressão ALDH1, não houve diferença aparente na taxa de células ALDH1-positiva entre células de controlo, as células tratadas com Sorafenib ou IFNa, e células expostas a condição hipóxica durante 48 horas. No entanto, a percentagem de células positivas aumentou-ALDH1 cronologicamente, especialmente em células tratadas com Sorafenib ou expostos a condições de hipóxia. Em particular, após a exposição ao sorafenib ou IFNa, ou hipoxia durante 96 horas, as percentagens de células positivas ALDH1 foram 40,0%, 19,2% e 37,1%, respectivamente (Fig. 4C).

(A) O expressão de ALDH1 em células SP e células NSP em ACHN e KRC /Y. As taxas de células ALDH1-positivo em ACHN e KRC /Y eram 15,3% e 6,5%, respectivamente. (B) de comparação do crescimento das células entre células de controlo, as células tratadas com Sorafenib ou IFNa, e células expostas a hipoxia em ACHN. O crescimento celular foi medido a 48, 72 ou 96 horas após o tratamento com droga ou exposição a hipoxia. O crescimento celular após o tratamento de drogas ou exposição a hipoxia foi significativamente suprimida em comparação com o controle (*

P Art 0,005, **

P Art 0,0001 vs. controlo). (C) A percentagem de células ALDH1-positiva em células tratadas com Sorafenib ou IFNa, ou células expostas a hipoxia durante 48, 72 ou 96 horas. A percentagem de células ALDH1-positiva em células tratadas com Sorafenib ou IFNa, ou células expostas a hipoxia durante 96 horas foi superior em comparação com o estado normal. As experiências foram repetidas duas vezes, e quase resultados idênticos foram obtidos. Uma figura representativa de nossas experiências é mostrado. (D) Esfera capacidade de formação entre as células ALDH1-positivas e células ALDH1-negativo. A formação de células esfera ALDH1-positivo em ACHN e KRC /Y foi maior do que a de células ALDH1-negativo. As experiências foram repetidas duas vezes, e os resultados quase idênticos foram obtidos.

A esfera capacidade de formação de células ALDH1-positivo em ambos ACHN e KRC /Y foi maior do que a de células ALDH1-negativo. Além disso, as células ALDH1-positivos em ACHN gerado tamanhos esfera significativamente maiores do que as células ALDH1-negativa (Fig. 4D). Além disso, verificou-se que as células individuais esfera-dissociado plaqueadas a uma densidade de 4000 células por poço deu origem a esferas secundárias e terciárias dentro de 1 semana de semeadura. Embora o número de esferas foi demonstrado diminuir na segunda e terceira passagens em comparação com a primeira passagem, a esfera capacidade de formação de células ALDH1-positivo em ACHN foi mantida durante a segunda e a terceira passagens. Por outro lado, as células ALDH1-negativo formado algumas esferas secundárias (Fig. 5).

A esfera capacidade de formação de células ALDH1-positivo em ACHN foi mantida durante a segunda e terceira passagens (*

P

. 0,0001)

formação do tumor foi observada em três dos cinco e cinco de cinco camundongos injetados com 10 × 10

3 e 100 × 10

3 ALDH1- células positivas, respectivamente, em 8 semanas. No entanto, a injeção de células ALDH1 negativo desenvolvido há tumores visíveis em todos os ratos por esta altura (Tabela 2).

qRT-PCR em células ALDH1-positivos e ALDH1 negativo ACHN

Foram realizadas análises de qRT-PCR para comparar a expressão de genes relacionados com a propriedade CSC-LC em células ACHN ALDH1-positivos e ALDH1-negativo. ALDH1-células positiva expressaram níveis significativamente mais elevados de ARNm de todos os genes, excepto que as células do caracol ALDH1-negativo. Os níveis de aumento foram como se segue: ABCB1, 4,9 vezes; ABCG2, de 2,5 vezes, ALDH1A1, 4,8 vezes; BCL2, 5,0 vezes; CFLAR, 4,1 vezes; IMC-1, 3,9 vezes; c-myc, 3,9 vezes; HIF1α, 3,4 vezes; VEGFA, 2,7 vezes; Twist, 4.0 vezes (Fig. 6).

células ALDH1 positivo mostrou significativamente mais elevada expressão de mRNA de ALDH1A1, genes relacionadas com os transportadores (ABCB1 e ABCG2), genes de auto-replicação (IMC-1 e c- MYC), genes anti-apoptose (BCL2 e CFLAR), genes relacionados à hipóxia (HIF1α e VEGFA) e os genes relacionados com a EMT (torção) do que células ALDH1 negativo em ACHN. No entanto, não houve diferença significativa na expressão de ARNm de Snail entre células ALDH1-positiva e ALDH1-negativo. Os experimentos foram repetidos pelo menos quatro vezes, e quase idênticos resultados foram obtidos.

Discussão

Uma vez que o conceito de CSC foi proposto para explicar a heterogeneidade das células tumorais, CSCs ou CSC- CLs foram identificados em muitos tipos de cancro. Em geral, os CSCs possuem tanto a auto-renovação e diferenciação capacidades que permitem CSC para recriar parcialmente a heterogeneidade celular do tumor parental. Um número de estudos relataram que a incapacidade de terapias convencionais para evitar a recorrência ou metástases é devido à presença de pequenos subconjuntos de células resistentes, nomeadamente CSCs [8], [30]. Nos últimos anos, a técnica SP tornou-se um dos métodos mais utilizados para isolar CSC-LCs. Uma vez que a coloração e medição método detalhado de Goodell et ai. foi introduzido pela primeira vez, vários investigadores relataram que as células SP são um subconjunto de células com elevado grau de malignidade, e as características de CSC-lcs [15], [16], [31]. No que diz respeito ao RCC, Addla et ai. relataram que as células SP representaram 4-6% do total de células cancerosas. No entanto, as características celulares de células SP não são bem compreendidos [17].

Em nosso estudo, descobrimos que as frações de SP em ACHN e KRC /Y foram de 1,4% e 1,7%, respectivamente. Não houve diferença entre as células KRC NSP /Y SP e na tumorigenicidade, formando esfera capacidade, ou na resistência ao sorafenib ou IFNa, que são convencionalmente utilizados para o tratamento de carcinoma de células renais avançado. Estas descobertas indicam que as células KRC /Y SP não possuem as características de CSCs-CLs. Em contraste, ao passo que não houve diferenças significativas entre as células ACHN SP e NSP nos em ensaios de crescimento celular ou a formação de colónias in vitro, células SP mostrou uma esfera maior capacidade de formação, maior resistência IFN e superior tumorigenicidade em NOD /SCID do que as células NSP , sugestivas de células com propriedades CSC-LC são incluídos nas células SP ACHN. Actualmente, a abordagem SP é o método mais utilizado para identificar marcadores CSC, no entanto, muitos pesquisadores ainda questionam a relação entre as células SP e CSCs [32] – [34]. Além disso, Ibrahim et ai. estudaram a relação entre a concentração de coloração de Hoechst e tempo de incubação e concentração relataram que a coloração Hoechst tinha um efeito sobre a lesão celular [35]. No nosso estudo, a fim de identificar as células SP em ACHN e KRC /Y foi utilizado coloração Hoechst, a uma concentração de 5 ug /ml e 10 ug /ml, respectivamente. Hoechst coloração é geralmente levada a cabo a uma concentração de 5 ug /ml, mas no presente estudo foi utilizada uma concentração mais elevada em células KRC /Y [36]. Assim, não podemos descartar por completo a possibilidade de que o dano celular devido à coloração Hoechst foi responsável pela diferença nas características biológicas observadas entre as células KRC /Y in vivo e in vitro em nosso estudo atual.

Bussolati et al. relatado anteriormente em uma linha de células de carcinoma de células renais humana que as células CD105-positivos representaram um grupo de células com alta clonogenicidade e elevada tumorigenicidade; No entanto, nosso estudo descobriu que enquanto as células KRC /Y SP continha cerca de cinco vezes mais células CD105-positive como células KRC /Y NSP, não houve diferenças nas propriedades CSC-LC entre as células NSP KRC /Y SP e. Além disso, a expressão de CD105 foi encontrado em algumas células na ACHN. Assim, a corrente resultados entram em conflito com os resultados de Bussolati et ai., E sugerem a possibilidade de CD105 pode não ser um marcador universal CSC no CCR.

Muitos estudos recentes relataram que as células SP mostram uma expressão maior de transportadores ABC, especialmente ABCG2, do que as células NSP em muitos tumores sólidos e de linhas de células, e que este pode desempenhar um papel no efluxo de fármacos e resistência aos medicamentos. A expressão de transportadores de fármacos através ABCG2 é um marcador importante na identificação e análise de células SP [19], [20], [31], [37]. No nosso estudo, não se observou diferença na expressão ABCG2 ao nível do ARNm entre SP e células PNS de qualquer uma das duas linhas de células RCC estudados. No entanto, nos últimos anos, diversos estudos relataram que as células SP expressar outros transportadores, tais como ABCB1 e ABCB5, além de ABCG2 [38], [39]. Portanto, este resultado pode ser devido à expressão dos outros transportadores nas células SP, ou pode ser porque as funções de ABCB1 e ABCG2 não se reflectiu pela expressão de ARNm destes genes. Este ponto precisa ser mais estudada.

Em seguida, a fim de estudar outros marcadores CSC, foi realizado um ensaio Aldefluor. atividade enzimática ALDH1 tem sido reconhecido nos últimos anos como um marcador geral de ambas as células-tronco normais e CSCs [40], [41]. células ALDH1-positivas têm características CSC-LC, tais como a capacidade de se auto-replicar e para formar tumores, de modo que um certo número de investigadores têm utilizado a actividade enzimática ALDH1 como um marcador CSC em muitos tipos diferentes de cancro, incluindo o pulmão, fígado, pâncreas , da próstata, da bexiga, da mama e melanoma maligno [42] – [46]. Também tem sido relatada em diversas mama e outros cancros que a expressão elevada ALDH1 está intimamente associado com prognóstico clínico pobre [23]. Recentemente, ensaios de formação de esferas têm sido largamente utilizados para avaliar a capacidade de auto-renovação de CSC-CLs.