Abstract

Fundo

O levamisol, uma imidazo (2,1-b) derivado tiazol , tem sido relatada como sendo um potencial agente anti-tumoral. No presente estudo, investigou-se o mecanismo de acção de um dos análogos recentemente identificados, 4a (2-benzil-6- (4′-fluorofenil) -5-tiocianato-imidazo [2,1-b] [1] [3], [4] tiadiazole).

Materiais e Métodos

produção e expressão de várias proteínas apoptóticos ROS foram medidos após o tratamento 4a em linhas de células de leucemia. modelos de tumores de animais foram usados ​​para avaliar o efeito de 4a em comparação com levamisole sobre a progressão do adenocarcinoma da mama e da sobrevivência. Imunohistoquímica e western blot estudos foram realizados para entender o mecanismo de ação 4a ambos

ex vivo

e

in vivo

.

Resultados

Nós determinamos o IC

50 valor de 4a em muitas linhagens de células leucêmicas e câncer de mama e encontraram células CEM mais sensível (IC

50 5 M). Os resultados mostraram que o tratamento 4a leva à acumulação de ROS. A análise Western blot mostrou regulação positiva de proteínas pró-apoptóticos t-BID e BAX, após tratamento com 4-A. Além disso, a activação dependente da dose de p53 juntamente com FAS, FAS-L e a clivagem de caspase-8 que sugerem que induz a morte mediada por receptor via apoptótica em células CEM. Mais importante, observou-se uma redução no crescimento do tumor e um aumento significativo na sobrevivência após administração oral de 4a (20 mg /kg, seis doses) em ratinhos. Em comparação, 4a foi encontrada para ser mais potente do que o seu análogo parental levamisol base em ambos

ex vivo

e

In vivo

estudos. Além disso, imunohistoquímica e western blot estudos indicam que o tratamento 4a levou à revogação da proliferação de células tumorais e ativação da apoptose pela via extrínseca, mesmo em modelos animais.

Conclusão

Assim, nossos resultados sugerem que 4a pode ser utilizada como um agente quimioterapêutico potente

citação:. Hegde H, Karki SS, Thomas E, Kumar S, Panjamurthy K, Ranganatha SR, et ai. (2012) Novel Levamisol derivativos Induz extrínseca via de apoptose em células cancerosas e inibe a progressão do tumor em ratinhos. PLoS ONE 7 (9): e43632. doi: 10.1371 /journal.pone.0043632

editor: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, México |

Recebido: 13 de fevereiro de 2012; Aceite: 23 de julho de 2012; Publicação: 10 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Hegde et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela concessão de Lady Tata Memorial Trust, Reino Unido, e do Instituto indiano de Ciência arranque subvenção para SCR. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesse competindo

Introdução

O cancro é uma doença difícil de tratar, e só muito poucos medicamentos eficazes estão disponíveis. O desenvolvimento de moléculas terapêuticas de cancro Novel, eficientes, selectivos e menos tóxicos tem sido um objectivo difícil. Compreendendo o mecanismo molecular envolvido na cancros irá conduzir à descoberta de novos agentes anti-cancro. Alterações nos níveis de RNA e proteínas devido a mutações diferentes de expressão têm sido estudados em muitos cancros, incluindo leucemia e linfoma [1] – [4]. Recentemente, tem havido esforços extensos para caracterizar o mecanismo de translocações cromossómicas e deleções que resultam em leucemia e linfoma [5], [6]. Muitas fusões de genes foram também identificadas em cancros da próstata e cancros da mama [7]. As proteínas mais discutidos responsáveis ​​pela leucemia e linfoma no passado recente são os recombinação ativando genes (trapos, a enzima responsável pela diversidade de anticorpos) [5], [6] e ativação induzida deaminase (AID, a enzima responsável pela mutação somática e classe interruptor de recombinação) [5], [8]. No entanto, as enzimas responsáveis ​​para o desenvolvimento de fusões de genes ainda não foram identificados.

As duas últimas décadas têm visto uma mudança dramática na paradigmas de tratamento de câncer. Por exemplo, imatinib (Gleevac), uma droga desenvolvida especificamente contra a tirosina-cinase activada na leucemia mielóide crónica, é um desses grandes avanços [9]. Além disso, muitos outros compostos também foram identificados e testados clinicamente. Embora, o sucesso de ensaios clínicos na identificação de novos agentes e modalidades de tratamento foi significativa, os tratamentos actuais têm muitas limitações. Isto inclui efeitos secundários induzidos pelas drogas e da resistência adquirida aos fármacos [10]. Assim, a necessidade para o desenvolvimento de agentes terapêuticos anti-cancro eficazes com propriedades farmacocinéticas bem definidos é de grande importância.

Actualmente, existem diferentes formas, através da qual uma droga é testada quanto à sua eficácia como agente anti-cancro . A este respeito, várias vias apoptóticas têm sido estudados extensivamente por muitos compostos para compreender o seu modo de citotoxicidade [11]. Os pontos de verificação do ciclo celular induzida por moléculas pequenas também têm sido investigadas [12], [13].

O levamisole é um imunomodulador em células de cancro diferentes, incluindo colo-rectal, cancro da mama, melanoma, leucemia e [14]. Anteriormente, demonstrou-se que ela afecta a proliferação celular em cancros diferentes [15] e modula a fosforilação relevante tanto para a progressão do ciclo celular e apoptose. Os estudos também demonstraram que isto pode ser usado para infestações helmínticas e anti-várias doenças autoimunes [16], [17]. Além disso, tem sido mostrado que o levamisol tem actividade anti-cancro em combinação com f luorouracilo (5-FU) como terapia adjuvante para o tumor-nódulo-metástase (TNM) fase III do carcinoma do cólon (Dukes C) [18].

As imidazo (2,1-b) tiazol derivados de levamisol foram relatados como agentes anti-tumorais potenciais [19]. Mais tarde, a actividade antitumoral do 5-formil-6-arylimidazo- [2,1-b] também foram relatados sulfonamidas -1,3,4-tiadiazole [20]. Com base nestes resultados promissores, que sintetizada uma série de análogos contendo flúor na posição 4, de 6-fenilo em imidazo- [2,1-b] -1,3,4-tiadiazole 4a e identificado como o composto de chumbo [21]. No entanto, o mecanismo pelo qual induziu citotoxicidade não era conhecido. Além disso, nunca foi testado em modelos animais para o seu efeito na progressão do tumor. No presente estudo, nós 4a relatam que exerce o seu efeito sobre as células tumorais através da activação da via extrínseca da apoptose. Nós também descobrimos que 4a inibe a progressão do tumor em ratos de forma eficaz e aumenta o tempo de vida significativamente.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

Todos os produtos químicos utilizados no presente estudo eram de qualidade analítica e foram adquiridos à Sigma-Aldrich, EUA. Os anticorpos foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology, EUA.

Síntese da 4a

Síntese e caracterização de -5-tiocianato-imidazo 2-benzil-6- (4′-fluorofenil) [2, 1-b] [1], [3], [4] tiadiazole, 4a tem sido descrito anteriormente [21]. Levamisol (cloridrato Tetramisole, Cat. N ° L9756) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich, EUA.

cultura celular

linhas de células humanas, CEM (leucemia de células T), K562 (mielóide crónica leucemia) REH (leucemia de células B) e Nalm6 (leucemia de células B), foram cultivadas em RPMI 1640 (Sera Lab, Reino Unido) contendo 10% de FBS (Gibco BRL, EUA), 100 U de penicilina G /ml e 100 ^ g de estreptomicina /ml (Sigma-Aldrich, EUA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. EAC (cancro da mama) A linha de células foi comprado a partir de National Center for Cell Science, Pune e cultivadas em DMEM contendo FBS a 10% como descrito acima.

tripano de corante azul de exclusão ensaio

O efeito de 4a sobre a viabilidade de leucêmica (CEM, K562, REH, Nalm6) e as células de câncer de mama (EAC) foram determinadas por Trypan ensaio de exclusão de corante azul [22]. As células foram cultivadas (0,75 × 10

5 células /ml) durante 24 h e o composto foi adicionado no intervalo de 1-100 | iM para determinar o IC

50 valor. DMSO células tratadas foram utilizados como controlo do veículo. As células foram recolhidas a intervalos de 24 horas durante cinco dias e o número de células viáveis ​​foi determinada após coloração com azul de tripano. Para Levamisol, água foi usada como controlo de veículo. No caso de EAC, uma linha celular aderente, a viabilidade foi medida a 48 e 72 h após o tratamento de 4a. Cada experiência foi repetida pelo menos duas vezes e as barras de erro foram calculados e representados graficamente.

ensaio MTT

O ensaio de MTT foi realizado como descrito anteriormente [23]. As células CEM, K562, REH ou Nalm6 (0,75 × 10

5 células /ml) foram tratados com 4-A (para CEM e REH células 1, 5, 10 e 20 m; para K562 1, 5, 10, 20, 40 e 100 uM; de Nalm6, 1,5,10, 20, 40 uM), incubadas durante 48 e 72 h e submetida a ensaio MTT. As células tratadas com DMSO ou água foi usada como controlos de veículo para 4a, respectivamente. Experiência foi repetida pelo menos duas vezes independentes, são indicados, cada um com reacções duplicados e as barras de erro.

libertação de LDH ensaio

a libertação de LDH para o meio após o tratamento com 4 bis (1, 5, 10 e 20 | iM) em células CEM após 48 e 72 h de tratamento foi medido utilizando o protocolo padrão [24]. A percentagem de libertação de LDH foi calculada como:. Liberação de LDH em media /(liberação de LDH em media + liberação de LDH intracelular) × 100%

Detecção de produção de ROS intracelulares por citometria de fluxo

O nível do total da produção de ROS intracelular foi medida usando células sonda fluorescente permeável dichlorodihydro 2,7-diacetato de fluoresceína (H

2DCFDA) em células CEM e REH [25]. As células CEM foram tratadas com 5 e 10 uM de 4a e células REH com 10 uM durante 5, 10, 15, 30 e 60 min, colhidas, lavadas e a intensidade da fluorescência foi analisada por citometria de fluxo. As células tratadas com H

2O

2 foram usados ​​como controle positivo para a compensação de amostras experimentais.

análise de Western blot

O lisado celular foi preparado seguindo o tratamento com 4a na CEM (0 , 0,5, 1, e 5? M durante 48 h). Western blot foi realizada tal como descrito previamente [23]. Resumidamente, ~ 40 ug de proteína da amostra foi submetido a electroforese em 8-12% SDS-PAGE, transferidos para membrana de PVDF (Millipore, EUA) e sondaram-se com os respectivos anticorpos primários e secundários biotinilados. Os anticorpos primários utilizados foram BCL2, BCL-xL, BAX, t-BID, p53, p-p53 [Ser 392], PUMA, AKT, pAKT [Ser 473], FAS, FAS-L, FADD, SMAC /DIABLO, CASPASE -3, caspase-8 e citocromo C. As manchas foram desenvolvidos utilizando reagentes quimioluminescentes (Immobilon ™ ocidental, Millipore, Índia) e digitalizados pelo sistema de documentação de gel (LAS 3000, Fuji, Japão). As manchas foram retirados posteriormente, conforme o protocolo padrão e re-sondado com anticorpo anti-tubulina [23].

Separação de mitocondrial e frações citosólica de 4a tratada células CEM

células CEM foram tratadas com 5 4a uM durante 48 h, recolhidos e utilizados para o isolamento de fracções mitocondriais e citosólicas utilizando o kit de extracção mitocondrial (IMGENEX, EUA, Cat. No. 10082k) de acordo com as instruções do fabricante. DMSO células tratadas foram utilizados como controle. As frações resultantes foram utilizados para análise western blot contra o anti-citocromo C. actina foi utilizada como controle de carga.

In vivo experimentos

Declaração de Ética.

Os ratos foram mantidos como per os princípios e diretrizes do comitê de ética em cuidados com os animais, do Instituto indiano de Ciência, em conformidade com a Lei Nacional do índio em cuidados com os animais e utilização. O delineamento experimental do presente estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética animal (Ref. CAF /Ética /125/2007/560), Instituto Indiano de Ciência, Bangalore, Índia.

Animais

camundongos albinos suíços, 6-8 semanas de idade, pesando 18-22 g foram adquiridos de biotério central, Indian Institute of Science (IISc), Bangalore, Índia e mantido na casa animal, Departamento de Bioquímica, IISc. Os animais foram alojados em gaiolas de polipropileno e desde padrão dieta pellet (Agro Corporação Pvt. Ltd., Índia) e água ad libitum. A dieta sedimento padrão composto por 21% de proteína, 5% de lípidos, 4% de fibra bruta, 8% de cinzas, 1% de cálcio, 0,6% de fósforo, 3,4% de glucose, 2% de vitamina, e 55% de extracto livre de azoto (hidratos de carbono). Os ratos foram mantidos sob condições controladas de temperatura e umidade com um 12 h ciclo de luz /escuridão.

Elaboração de Ehrlich carcinoma de ascite (EAC) células.

células EAC foram coletados a partir da cavidade peritoneal de ratinhos dadores portador de tumor de 20-22 g de peso corporal e suspenso em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Um número fixo de células viáveis ​​(1 × 10

6 células /22 g b. Em peso) foram implantadas na cavidade peritoneal de cada rato receptor e permitidos para se multiplicar. As células tumorais foram retiradas, diluída em solução salina, contadas e re-injectado (1 × 10

6 células /animal), a coxa direita de tecido de animais experimentais para o desenvolvimento de tumor sólido.

A avaliação da actividade antitumoral de 4a no rato

Para estudar e comparar a actividade antitumoral da 4a, 32 ratos albinos suíços foram utilizados no presente estudo, (dois lotes de 16 animais cada). De 16 ratos, quatro foram utilizados como controle sem tratamento (normal). Resto dos ratinhos foram injectados com EAC para induzir tumor sólido, e dividido em três grupos, cada um contendo quatro animais de controlo do tumor (dois grupos), Levamisol tratados (grupo três) e 4a tratados (grupo de quatro). Grupo dois receberam água como controlo de veículo, o grupo de três receberam a administração oral de Levamisole (20 mg /kg, b. Em peso) e o grupo de quatro receberam a administração oral de 4a (6 doses de 20 mg /kg) em cada dia alternativa utilizando gavagem gástrica a partir a partir de 12

° dia da injecção de células tumorais.

os diâmetros de tumor em desenvolvimento foram medidos, no caso do grupo dois, três e quatro animais usando compassos de calibre de vernier, uma vez em cinco dias. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula V = 0.5ab

2, em que ‘a’ e ‘b’ indica o diâmetro maior e menor, respectivamente [26]. No final de 25

th e 45

th dias de período experimental, um animal de cada grupo foi sacrificado por deslocamento cervical e os tecidos do normal (grupo um), do tumor (grupo de dois), tratada Levamisol (grupo três ) e 4a tratados (grupo de quatro) animais foram coletadas e armazenadas.

Para verificar a longevidade induzida pela 4a em camundongos tumorais, 24 animais foram estudados, dois lotes contendo 12 cada. De 12, seis serviu como controle do tumor e outros foram tratados com 4a como explicado anteriormente. A percentagem de aumento no tempo de vida foi calculada e comparada com a dos animais de controlo. O padrão de morte para os controlos e 4A animais tratados foi registado e% de aumento no tempo de vida foi calculada usando a fórmula [(T-C) /C] × 100, em que “T” indica o número de dias que os animais 4a tratados sobreviveram e ‘C “indica o número de dias animais tumorais sobreviveu [26] – [28].

Avaliação da toxicidade de 4a em ratinhos normais

ratinhos Swiss albinos foram tratados com 4a e Levamisol (6 doses, em dias alternados) e os efeitos colaterais foram avaliados em dois momentos diferentes (20

th e 50

th dia). Dentre 36 ratos, 18 cada, foram utilizados a 20

th e 50

th dia. Em ambos os casos, 6 animais serviu como controlo, enquanto que 6 foram tratadas com Levamisole (20 mg /kg) ou de 4a (20 mg /kg). O peso corporal de cada animal foi monitorado durante todo o experimento e peso médio calculado a 20

th e 50

th dia para o controle, 4a e ratos Levamisol administrados e foram plotados com barras de erro. A fim de avaliar o efeito de 4a e Levamisol nas funções fisiológicas, o sangue foi recolhido em 20

th e 50

° dia, tal como descrito anteriormente [29]. O soro foi separado e os testes de função do fígado e rim foram realizados para cada animal, para determinar os níveis de fosfatase alcalina (ALP), creatinina, ureia e contagem de sangue foi realizada usando o plasma como descrito anteriormente [29]. Os valores são apresentados como média ± SEM.

análise de Western blot para 4a tratada células tumorais sólidas e líquidas

tumor sólido foi desenvolvido como descrito anteriormente [29]. Após 6 doses de 4a, tumor foi recolhido e o extracto foi preparado usando o método de tampão RIPA [23]. O tumor líquido foi desenvolvido através da injecção de células de EAC (2 × 10

6 células) a partir de ratinhos dadores para a cavidade peritoneal dos animais experimentais. Após a injecção da EAC (5

° dia), os animais foram tratados com 4a (20 mg /kg; 4 doses a cada dia alternativos) e as células da EAC foram isolados a partir da cavidade peritoneal. As células da linhagem de macrófagos foram separadas das células não aderentes EAC por aspiração suave, e lavadas com 1 x PBS. A viabilidade celular foi verificada utilizando o ensaio de exclusão de corante azul de tripano e 92% de células foram encontrados para estar vivo em ambos os grupos experimentais e controles. EAC células foram lisadas em tampão RIPA, extracto foi preparado tal como descrito anteriormente [30], e usado para a análise de Western blot.

A avaliação histológica

tumor e no fígado de ratos normais e experimentais foram recolhidas e processados ​​de acordo com protocolos padrão. Resumidamente, os tecidos foram embebidos em parafina, seccionados a 5-10 ^ M num micrótomo rotativo (Leica Biosystems, Alemanha) e corados com hematoxilina e eosina [31], [32]. tecidos cerebrais foram colhidos, processados ​​e corados com Luxol Fast Blue para estudar desmielinização. Cada seção foi avaliada por microscopia de luz e imagens foram capturadas (Zeiss, Alemanha).

imuno-histoquímica (IHQ) Análise

coloração de anticorpos foi realizado em, embebidos em parafina tecidos em formalina fixo, que foram seccionados em uma espessura de 5 um. As lâminas foram de-parafinado utilizando xileno, re-hidratados e tratados com 3% H

2O

2 em PBS. A recuperação de antígenos foi feito utilizando tampão de citrato de sódio-0,01%, seguido de bloqueio em PBST contendo BSA a 0,1% e 10% de FBS. Incubação do anticorpo primário (Ki67, BID ou 53BP1) foi realizada durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário biotinilado (1 h). As lâminas foram então lavadas, incubadas em estreptavidina-HRP (1:1000). As lâminas foram de novo lavadas (PBS contendo 0,1% de Tween 20) e a cor foi revelada utilizando DAB + H

2O

2, contrastadas com hematoxilina e montadas em DPX (Sigma-Aldrich, EUA). As imagens foram capturadas usando microscópio de luz (Zeiss, Alemanha). Mudança na intensidade da coloração de anticorpos após o tratamento 4a foi determinada usando software ImageJ [33].

A análise estatística

Os valores são expressos como média ± SEM para controle e amostras experimentais e análise estatística foi realizada utilizando One-way ANOVA seguido por teste de Dunnett, e cada valor foi comparado com o controlo e o significado mencionado. Para esta análise, foi utilizado o software GraphPad Prism 5.1. Os valores foram considerados estatisticamente significantes, se o valor de p foi igual ou inferior a 0,05.

Resultados

4a induz citotoxicidade nas células cancerosas

Anteriormente, enquanto triagem uma série de derivados de levamisol, foram identificados como o composto 4a chumbo (Fig. 1A) [21]. No presente estudo, utilizamos uma variedade de linhas de células leucêmicas (CEM, K562, REH e Nalm6) e uma linha de células de câncer de mama ratos, carcinoma ascítico de Ehrlich (EAC) para avaliar o seu potencial para induzir citotoxicidade. Em primeiro lugar, IC

50 de 4a em células CEM, K562, Nalm6 e REH foi determinada utilizando ensaios de azul de tripano e MTT (Fig. 1). As células tratadas com DMSO foram utilizados como controlo do veículo. Os resultados mostraram que o tratamento 4a afectado significativamente a viabilidade celular nas concentrações mais baixas em CEM, Nalm6 e REH (Fig. 1B, C). Interessantemente, as células K562 mostrou menos sensibilidade em relação a tratamento 4a (Fig. 1B, C). Com base em ambos os ensaios de azul de tripano e MTT, o IC

50 valor foi estimado como sendo de aproximadamente 5, 70, 10 e 8 uM em células CEM, K562, Nalm6 e REH, respectivamente, após 48 h de tratamento 4a. Curiosamente, em comparação com 4a, o tratamento Levamisol em células CEM mostrou menor sensibilidade (Fig. 2A, B). 4a exibiu citotoxicidade significativa em células EAC (IC

50, 33 uM), enquanto que as células eram insensíveis à Levamisol, na gama de concentrações testadas (Fig. 2C e D). Além disso, o ensaio de LDH foi realizada a lesão celular induzida por ensaio de 4a em células CEM. As células foram tratadas com 4a durante 48 e 72 h, respectivamente, colhidas e submetidas a medição de LDH. Os resultados mostraram um aumento dependente da dose na libertação de LDH (Fig. S1).

A. A estrutura de 4a. B. 4a citotoxicidade induzida como determinado pelo ensaio de azul de tripano. As células CEM, K562, Nalm6 e REH foram cultivadas (0,75 × 10

5 células /ml) e a citotoxicidade foi medida após a adição de concentrações crescentes de 4a, tal como indicado. As células foram contadas em intervalos de 24 h até que as células atingiram a fase estacionária e foram representados graficamente. DMSO células tratadas foram utilizados como controlo do veículo. O erro padrão foi calculado com base no mínimo de duas experiências independentes. C. Determinação da proliferação celular utilizando um ensaio MTT após a adição de 4a a CEM, K562, Nalm6, e as células REH (48 e 72 h). Os resultados apresentados são a partir de um mínimo de duas experiências independentes, cada um foi feito em duplicado e os resultados são expressos como% da proliferação celular. Em todos os painéis “C” está para o controle do veículo tratado DMSO.

A. A estrutura de levamisol, o composto parental de 4a. B. Determinação da proliferação de células utilizando o ensaio de MTT em células CEM tratadas com Levamisole ou 4a. No caso de levamisol, as concentrações utilizadas foram 1, 5, 10 e 20 uM, enquanto que foi de 10 uM para 4a. erro padrão foi calculado com base em dois experimentos independentes. C, D. Citotoxicidade de 4a e Levamisol em células EAC como medido pelo ensaio de azul de tripano. As células foram cultivadas EAC (0,75 × 10

5 células /mL) e tratado com 1, 5, 10, 20 e 40 uM de 4a ou levamisol. A viabilidade das células foram determinados por ensaio de azul de tripano às 48 e 72 h. erro padrão foi calculado com base em três experimentos independentes.

4a induz espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS)

A superprodução de ROS após a adição de um composto é um indicador da resposta celular levando a danos no ADN e apoptose. Nós descobrimos que o tratamento 4a induzida a produção de ROS em caso de CEM (5 e 10 uM), bem como REH (10 uM) de células a 10 e 15 min (Fig. 3 A, B, Fig. S2). Além disso, o aumento do tempo de incubação não aumentar o nível de ROS. As células tratadas com H

2O

2 foram usadas como controlo positivo, enquanto que as células tratadas DMSO serviu como controlo do veículo (fig. 3). Assim, os nossos resultados sugerem que a produção de ROS é um passo intermediário envolvido na 4a citotoxicidade induzida.

A, B. CEM (A) e as células tratadas com 4a (5 mM e 10 mM, respectivamente) REH (B) para diferentes pontos no tempo foram utilizados para testar a formação de ROS intracelular por citometria de fluxo. A concentração selecionado para o estudo foi baseado em seu respectivo IC

50 valores.

2O

2 células tratadas H foram utilizados como controle positivo, enquanto as células só foram utilizados como controle negativo. DMSO células tratadas foram utilizados como controlo do veículo. população de células mostrando ROS foi mostrado junto com erro padrão da média (n = 2).

4a modula a expressão de proteínas apoptóticas

A fim de estudar o mecanismo pelo qual 4a induz a morte celular , estudámos os níveis de expressão de diversas proteínas de apoptose a seguir ao tratamento 4a. As células CEM foram escolhidos para o estudo, uma vez que mostrou a sensibilidade máxima para 4a. As células CEM foram tratadas com concentrações crescentes de 4a (0,5, 1 e 5 | iM, durante 48 h), lisado celular foi preparado e usado para estudos de Western blot. Os resultados mostraram que o tratamento 4a levou a um aumento notável dos níveis de p53, assim como a fosfo-p53 (Fig. 4A). Uma vez que o p53 é um activador conhecido de apoptose, testou-se a expressão de várias proteínas da família BCL2 que têm funções pro /anti-apoptóticos (Fig. 4A, B). Consistente com os resultados anteriores, foi observado um aumento na expressão de proteínas pró-apoptóticas PUMA, Bax, e a clivagem de BID (Fig. 4A, B). Curiosamente, observaram-se também a regulação positiva de proteínas anti-apoptóticas, BCL2 e BCL-XL, nomeadamente a 0,5 e 1 uM concentrações (Fig. 4B). Além disso, o tratamento 4a levou ao aumento na expressão de proteínas de sinalização do receptor de morte, FAS, FAS-L e FADD, indicando que a citotoxicidade induzida por 4a pode ser mediada através do receptor de morte mediada por apoptose (Fig. 4C).

lisado de células CEM foi preparado o tratamento seguinte com 4a (0, 0,5, 1 e 5? M durante 48 h). células tratadas com DMSO foram utilizados como controlo (0 | iM). estudos de transferência de Western foram realizadas utilizando os anticorpos primários e secundários específicos para a expressão de (A) fosfo p53, p53, Puma, fosfo AKT, AKT (B) BCL2, BCL-xL, BAX e t-@ BID @; (C) FAS, FAS-L, FADD, e SMAC /DIABLO (D) caspase-3, caspase-8 e CITOCROMO C. α-tubulina foi utilizada como controlo de carga. A quantificação das bandas em cada blot mostrado no painel da esquerda é mostrado como diagrama de barras com o erro padrão com base em dois experimentos independentes seguintes normalização com a respectiva tubulina E. liberação de citocromo C das mitocôndrias após o tratamento com 4-A. Mitocondrial, bem como fracções citosólicas foram separadas a partir de células CEM após 48 h de tratamento com 4a (5 uM), as células tratadas de DMSO foram utilizados como controlo (C), transferência de Western foi efectuada utilizando anti-citocromo C. actina foi utilizada como controlo de carregamento .

via PI3K /AKT é conhecido por ser activado na maioria dos T-ALL. Sabe-se também que desempenha um papel crítico no controle de sobrevivência e a apoptose. Aumento de p-AKT desloca as células para a sobrevivência, por interferir com a p53 mediada via de apoptose. Por isso, estávamos interessados ​​em verificar os níveis de AKT após tratamento com o composto. Os resultados mostraram regulação positiva de AKT após a adição de 4-A (Fig. 4A). Apesar do aumento dos níveis de p-AKT, a morte celular induzida por um fármaco, o que sugere que a razão dos sinais pró-apoptóticos e anti-apoptóticos na célula foi rompida.

SMAC /DIABLO é uma proteína mitocondrial de mamífero, que funciona como um componente de regulação durante a apoptose. Foi testada a sua expressão após tratamento 4a e os resultados mostraram uma regulação positiva da expressão de proteína (Fig. 4C). Também foi observado um aumento dependente da dose no nível do citocromo C (Fig. 4D) [34]. Verificou-se ainda a liberação de citocromo C para o citoplasma e os resultados mostraram um aumento distinto do nível de citocromo C citosólica após tratamento com 4-A (Fig. 4E).

caspase-8 é uma outra proteína ativada durante o via extrínseca da apoptose. Os resultados mostraram a clivagem de caspase-8 após tratamento 4a (Fig. 4D). Isto confirma ainda mais a activação da apoptose mediada pelo receptor de morte. Activado caspase-8 também cliva procaspase-3 e de acordo com isso, encontrar a activação de pro-caspase-3 em comparação com os controlos, após tratamento 4a, de um modo dependente da dose (Fig. 4D).

inibe tratamento 4a a progressão do tumor em ratinhos

CAO derivada de adenocarcinoma da mama é um carcinoma agressiva e rapidamente crescente comumente utilizado para a avaliação do efeito de novas moléculas pequenas na progressão do tumor. Com base em estudos-piloto, 20 mg /kg de peso corporal de 4a foi utilizado para tratamento em animais portadores de tumores (dados não mostrados). Após 12

° dia de injecção EAC (pequeno tamanho do tumor era visível), os animais foram tratados com seis doses em dias alternados. Nós descobrimos que o tratamento com 4-A em animais portadores de tumor resultou numa redução significativa do tamanho do tumor em comparação com a do não tratado, bem como levamisol animais tumor tratado (20 mg /kg) (Fig. 5A). Verificou-se que 80% dos ratos sobreviveram após tratamento com 4-A, ao passo que 50% dos ratinhos não tratados de tumor estavam mortos entre 30 a 40 dias de desenvolvimento do tumor (Fig. 5A, B e dados não mostrados). A aparência macroscópica de tecido contendo tumor coxa, fígado e baço de controlo negativo, o controlo do tumor não tratado e murganhos 4a tratado mostrou uma diferença morfológica proporcional (Fig. 5C e dados não mostrados).

tumor sólido foi induzida em Swiss camundongos albinos por injeção de células da EAC. Seis doses de 4a e Levamisol (20 mg /kg) a cada administrada a ratinhos portadores de tumor em todos os dias alternados de 12

° dia da injecção de células EAC. A. Efeito de 4a e Levamisol na progressão do tumor em diferentes pontos de tempo. Os dados apresentados baseia-se em dois lotes independentes de experimentos com quatro animais cada. As barras de erro indicam SD experiências independentes. B. de Kaplan-Meier curvas de sobrevivência de ratinhos tratados com 4-A. Fora de 24 tumor induzida animais Swiss Albino, 12 foram tratados com 4-A (20 mg /kg) e gráfico de sobrevivência foi plotado, teste estatístico de log-rank mostrou P 0,005 (**). No caso de controle, tempo médio de sobrevivência foi encontrado para ser 59 dias e, no caso de 4a tratada ela é indefinida (valor mostrou até 250 dias). aparência C. Gross da 4a tratada e não tratada tumor ratos e seus órgãos selecionados a 25

th dia de tratamento. uma. rato sem tumor, b. rato portador de tumor, c. portadores de tumor de rato após o tratamento com 4-A, d. tecido da coxa de rato normal, e. tumor, f. tecido da coxa de um rato tratado, g. fígado de rato normal, h. fígado de um rato tumor, i. fígado de um 4a tratada rato, j. baço de um rato normal, k. baço de um rato com tumor, l. baço de um rato tratado.

Mais importante, descobrimos que depois do tratamento com 4-A, os animais com tumor mostrou uma diferença significativa na taxa de sobrevivência em comparação com o controle do tumor sem tratamento (Fig. 5B). Enquanto os animais de controlo sobreviveram durante apenas um máximo de 70 dias após o desenvolvimento do tumor, a maioria dos ratos tratados com 4-A sobreviveram durante mais de 250 dias, indicando um aumento de ~ 4-vezes no tempo de vida (Fig. 5B). Portanto, nossos resultados demonstram que o tratamento 4a reduziu significativamente a carga do tumor e aumentou o tempo de vida dos animais.

A avaliação histológica também foi realizada em dois momentos diferentes (25

th e 45

th dia ) de tratamento. Secções de tecido de tumor de um ratinho tratado 25 dias mostrou muitas hematoxilina núcleos corados com pouca coloração citoplasmática, indicando a proliferação de células activas, enquanto que no caso dos controlos, não há outros que não os núcleos de células de músculo esquelético foram corados (Fig. S3A). 4a tecidos tumorais tratadas apresentaram uma redução significativa nas células em proliferação (Fig. S3A). As secções de tecido a partir da coxa após 45

° dia de tratamento mostraram número insignificante de células em proliferação e eram mais comparável com a de tecidos normais, enquanto que as células em proliferação foram abundante em ratinhos portadores de tumor, em que nenhum tratamento foi dado (Fig. S3A). Para analisar se o tratamento 4a teve qualquer efeito adverso sobre outros tecidos, secções do fígado foram analisados ​​por hematoxilina e eosina (Fig. S3C, D). Nossos resultados mostraram hipertrofia dos hepatócitos, tanto do rolamento do tumor e 4a ratinhos tratados. No entanto, foi restaurada de volta ao normal apenas em casos em que o tumor regrediu após o tratamento com o composto 4a, ao contrário dos ratinhos não tratados, onde hepatócitos irregulares foram ainda observados (Fig. S3C, D).