Abstract

Fundo

A identificação de novos marcadores prognósticos para o câncer de próstata é altamente garantido, uma vez que é difícil identificar pacientes que necessitam de tratamento curativo. Os dados de ambos os modelos experimentais e amostras clínicas identificaram funções importantes do PDGFRβ em pericitos e fibroblastos no estroma tumor.

Metodologia /Principais Achados

Neste estudo o significado prognóstico da PDGFRβ no cancro da próstata estroma, e no tecido não maligno combinado, foi avaliada com imuno-histoquímica. PDGFRβ expressão foi analisada em estroma normal e do tumor de mais de 300 doentes com cancro da próstata. expressão alta PDGFRβ no estroma tumoral foi associada com grande tamanho do tumor, estágio avançado, alta pontuação de Gleason e alta densidade de navio. coloração PDGFRβ perivascular em tumores também foi correlacionada com alta pontuação de Gleason. Correlações também foram observados entre o estado PDGFRβ no estroma do tumor e estroma não-malignas. Da mesma forma, a alta expressão de PDGFRβ no estroma de tecido não maligno adjacente correlacionada com grande tamanho do tumor, estágio avançado, alta pontuação de Gleason e proliferação no epitélio não-malignas. Curiosamente, altos níveis de PDGFRβ no estroma do tecido tumoral e não-malignas foram associados à sobrevida específica por câncer mais curto em pacientes com câncer de próstata.

Conclusões /Significado

O estudo revelou uma série de novela associações entre a expressão do estroma PDGFRβ em tumores da próstata e várias características clínicas importantes, incluindo a sobrevivência

Citation:. Hägglöf C, Hammarsten P, Josefsson a, Stattin P, Paulsson J, Bergh a, et al. (2010) Estromal PDGFRβ Expressão na próstata Tumores e tecido da próstata não maligno Prevê Prostate Cancer Survival. PLoS ONE 5 (5): e10747. doi: 10.1371 /journal.pone.0010747

editor: Per Westermark, Universidade de Uppsala, Suécia

Recebidas: 3 de março de 2010; Aceite: 30 de abril de 2010; Publicado em: 20 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Hägglöf et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiada por doações irrestritas de um subsídio Linna à rede Starget do Conselho de Pesquisa sueco e doações da sociedade contra o cancro sueco e Konung Gustaf Vs Jubileumsfond. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o comportamento do tumor é, em geral, em grande parte, regulada pelas características do estroma tumoral. No caso do cancro da próstata Isto é bem ilustrado por uma série de estudos recentes que foram identificadas características do estroma e marcadores com significado prognóstico e resposta-predicativa.

Tumores com a alteração mais pronunciada na morfologia estroma, caracterizado por um grande perda de células musculares lisas e aumentos em fibroblastos, miofibroblastos, e as fibras de colagénio (reactivo estroma grau 3), tem um mau resultado em comparação com aqueles com um estroma morfologicamente mais semelhante ao que no tecido normal da próstata, isto é, os graus do estroma reactivos 1 e 2 [1]. Estudos recentes mostraram também que a cancros da próstata são caracterizados por perda de receptores de androgénio (AR) no estroma [2]. A baixa freqüência de AR estromal foi acoplado a um aumento da pontuação de Gleason, metástase, a má resposta à terapia de castração e um resultado desfavorável. Além disso, as características do estroma, tais como angiogénese, a acumulação de macrófagos, linfócitos e mastócitos, bem como alterações na matriz extracelular foram ligadas a variações em comportamento do tumor da próstata [3], [4], [5], [6], [7]. Notavelmente, foi também observado que os efeitos de campo do cancro e /ou mudanças de adaptação pode alterar o estroma e epitélio glandular no tecido não maligno que cerca de um modo prognosticamente significativo [2], [8], [9], [10] .

α- PDGF e receptores de tirosina-quinase β-exercem importantes funções de controlo em células mesenquimais, tais como pericitos, fibroblastos e células musculares lisas vasculares durante o desenvolvimento [11], [12]. Estudos experimentais identificaram diferentes efeitos funcionais do receptor PDGF estromal sinalização em vários modelos de tumor. Tem sido demonstrado que a activação de receptores de PDGF parácrina sobre fibroblastos actua como um sinal para o recrutamento potente estroma tumoral [13], [14], [15]. Outros estudos demonstraram os benefícios terapêuticos da segmentação receptores de PDGF do estroma envolvendo tanto efeitos anti-tumorais directos, bem como efeitos benéficos sobre a absorção de drogas de tumores [16], [17], [18], [19], [20]. significado clínico dos resultados de modelos experimentais é indicado por numerosos estudos que demonstram a expressão do estroma receptor PDGF em tumores sólidos humanos diferentes [13]. Mais recentemente, esses estudos foram complementados com análises revelando que a expressão do receptor PDGF alta estromal é um marcador de um resultado desfavorável em pacientes com câncer de mama [21].

Os efeitos biológicos de receptores de PDGF em fibroblastos tumorais e pericitos, juntamente com o advento das drogas com actividade inibidora do receptor de PDGF, tais como imatinib, sorafenib e sunitinib, motiva assim uma caracterização sistémica do padrão de receptores de PDGF em tumores sólidos humanos expressão. Para este fim, o presente estudo descreve a expressão de PDGFRβ em cerca de 300 casos de câncer de próstata e no tecido da próstata não maligno torno correspondido, e também relata a associação entre a expressão PDGFRβ e características moleculares, histopatológicos e clínicos.

resultados

expressão PDGFRβ variável no tecido

normal e de próstata tumor

a fim de avaliar a importância de PDGFRβ no cancro da próstata, uma TMA contendo correspondência não-malignas e tecido tumoral de 377 pacientes com câncer de próstata com até 25 ano de acompanhamento foi analisada por PDGFRβ imuno-histoquímica.

de acordo com estudos anteriores, expressão PDGFRβ foi predominantemente encontrada no estroma fibromuscular e em células perivasculares (Figura 1 e Tabela 1). No próstata não maligna 27% e 18% foram classificados como tendo PDGFRβ expressão positiva no estroma fibromuscular e células perivasculares, respectivamente. Perivascular e coloração estroma não se correlacionaram. Nas áreas de tumor de 34% foram positivos no estroma do tipo fibroblastos e 17% nas células perivasculares. Coloração no estroma do tumor e ao redor dos vasos sanguíneos dos tumores foram correlacionados (Rs = 0,59). As associações significativas foram observadas entre o estado PDGFRβ no estroma maligno e não maligno (Tabela 1).

Secções coradas para a PDGFRβ de não-maligna (A, B e C) e do tumor (D, E e F) a partir de tecido de pacientes com cancro da próstata. Casos A e D mostram coloração negativa, B e E mostram coloração estromal moderada enquanto C e F apresentam uma forte coloração do estroma. Barra de escala = 200? M.

Em alguns casos, a expressão PDGFRβ também variou dentro do tecido da próstata do mesmo paciente (Figura S1).

ocorrer expressão do estroma PDGFRβ predominantemente em αSMA células positivas

Para caracterizar ainda mais a expressão do estroma PDGFRβ, uma coloração dupla foi realizada com anticorpos contra αSMA e PDGFRβ.

Estas análises confirmaram que a maior parte da expressão na PDGFRβ fibromusclar não-maligna e o estroma tumoral do tipo fibroblastos ocorreu em células αSMA-positivos (Figura 2). Além disso, as análises também demonstrou a presença de células αSMA-positivos no estroma do tumor e tecidos não-malignas que não apresentem qualquer expressão do estroma PDGFRβ.

colorações duplas de tecido da próstata com PDGFRβ (verde) e αSMA (vermelha) em tecidos não-maligna (a e B) e do tecido tumoral (C e D). Barra de escala = 100 M.

Esses achados confirmam assim a existência de subconjuntos de células αSMA-positivos do estroma, que diferem no que diz respeito à expressão PDGFRβ.

estroma e PDGFRβ perivascular coloração em tumores de próstata está correlacionada com marcadores prognósticos

as análises foram realizadas para investigar possíveis associações entre a expressão PDGFRβ em tumores e os parâmetros clínicos ou características histológicas dos tumores.

Presença de coloração PDGFRβ na a fibroblastos como estroma tumoral foi significativamente correlacionada positivamente com grande tamanho do tumor, estágio avançado, alta pontuação de Gleason e densidade de vasos de alta (Tabela 1). Em pacientes com uma classificação de Gleason 4-6 ou Gleason 7 do tumor, apenas cerca de 20% dos tumores do estroma mostrou PDGFRβ coloração, mas foi consideravelmente mais comum nos casos com classificação de Gleason 8-10 tumores (Figura 3 A).

coloração PDGFRβ no estroma tumoral foi mais comum nos casos com escore de Gleason 8-10 tumores, em comparação com pacientes com Gleason score 4-6 ou escore de Gleason 7 (a). Presença de PDGFRβ imunocoloração foi mais comum no estroma tecido da próstata normal quando um escore de Gleason 8-10 tumor estava presente na próstata em comparação com se o tumor tinha Gleason score 4-6 (B).

expressão perivascular PDGFRβ na área do tumor também foi correlacionada positivamente com estágio avançado, densidade de vasos do tumor e alta pontuação de Gleason (dados não mostrados).

em conjunto, estes resultados demonstram previamente un-reconhecido associações entre estromal e expressão PDGFRβ perivascular em tumores da próstata e características associadas com um fenótipo de câncer mais agressivo.

coloração estromal PDGFRβ no tecido não maligno adjacente estão correlacionados com marcadores prognósticos

PDGFRβ expressão no tecido não maligno adjacente também foi analisada no que diz respeito às associações com as características do tumor (Tabela 1).

high PDGFRβ em não-malignas, estroma fibromuscular foi correlacionada com grande tamanho do tumor, estágio avançado, a proliferação de células epiteliais e escore de Gleason alto (Tabela 1). Foi consideravelmente mais comum encontrar expressão PDGFRβ no estroma tecido da próstata normal quando um escore de Gleason 8-10 tumor estava presente em outras partes do órgão em relação a se o tumor era marcar Gleason 4-6 (Figura 3 B).

expressão perivascular PDGFRβ no tecido não maligno circundante também foi positivamente correlacionada com a proliferação de células epiteliais (dados não mostrados)

.

Estas análises sugerem assim novas relações entre as propriedades de cancro da próstata e o fenótipo do estroma da tecido da próstata não maligno adjacente a tumores de próstata.

expressão do estroma PDGFRβ em tumores e no tecido da próstata não maligno torno tumores prediz sobrevida específica por câncer

os resultados das análises de expressão PDGFRβ foram finalmente combinados com dados de sobrevivência para investigar possível significado prognóstico.

os pontos de corte para estroma tumor PDGFRβ e estromal não-malignas PDGFRβ nas análises foi definido para o terceiro quartil, correspondendo a 1,0 e 0,5 para o tumor e não estromal -malignant PDGFRβ coloração, ou seja, alta imunorreatividade PDGFRβ foi ≥1.0 de tumor e ≥0.5 de estroma não-malignas.

Kaplan-Meier análise mostrou que os pacientes a espera vigilante com o quartil mais alto de expressão PDGFRβ no estroma tumoral tinha uma sobrevida específica por câncer significativamente menor em comparação com o resto (probabilidade de 15 anos de sobrevida livre de eventos (P-EFS) foi de 67 ± 5% e 34 ± 9% nos dois grupos) (Figura 4 a).

pacientes, divididos em dois grupos dependendo da expressão do estroma PDGFRβ no tumor (a) e os tumores de tecidos da próstata não maligno circundante (B). linha sólida, alta PDGFRβ no estroma tumoral (≥1.0); linha a tracejado, em baixo PDGFRβ estroma tumoral ( 1,0; A). linha sólida, alta PDGFRβ no estroma não-malignas (≥0.5); linha a tracejado, em baixo PDGFRβ estroma não-maligna ( 0,5; B).

Curiosamente, a expressão elevada de PDGFRβ no estroma de tecido da próstata normal adjacente também foi associada a uma sobrevivência significativamente reduzida em pacientes gerido pela espera vigilante (15 anos P-EFS foi 68 ± 5% e 41 ± 9% nos dois grupos)

High tumor e estroma não-malignas PDGFRβ imunocoloração foi associado (Figura 4 B). com um aumento do risco relativo para a morte específico do cancro da próstata numa análise de regressão de Cox univariada (Tabela 2). Na análise de regressão multivariada de Cox incluindo o conhecido marcador de prognóstico GS e estágio do tumor local, alta estromal PDGFRβ no tecido tumoral e não-maligna não foi um marcador prognóstico independente (dados não mostrados).

Discussão

a presente análise descobriu um conjunto de novas associações entre o estroma tumor estatuto PDGFRβ, histopatológico, incluindo correlações positivas com pontuação de Gleason, estágio do tumor e tamanho do tumor (Tabela 1). Essas descobertas são uma reminiscência da situação descrita recentemente no cancro da mama onde a expressão do estroma PDGFRβ foi positivamente correlacionada com alto grau [21]. Estes resultados levantam a questão do mecanismo subjacente (s). A partir de agora, não é possível concluir se as associações são causadas por um fenótipo estromal induzida por epiteliais ou por um fenótipo epitelial induzida por estroma.

As análises do presente estudo também revelou associação significativa entre as características clínicas, incluindo a sobrevivência, e a expressão do estroma PDGFRβ no tecido não maligno presente (Tabela 1). Esta observação das propriedades prognosticamente significativas do tecido não maligno adiciona a uma série de observações semelhantes que em conjunto têm levado a propor o termo “tumor indicando tecido não maligno” (matiz), o que implica que as análises do tecido da próstata não maligno pode produzir informações de prognóstico [2], [10]. Outros estudos recentes têm apresentado resultados semelhantes seguintes análises de exemplo pAKT, pEGFR e AR [2], [10], [22]. De uma perspectiva prática isso é importante uma vez que muitas biópsias de diagnóstico única amostra de tecido não-malignas.

A biologia subjacente das variações na expressão do estroma PDGFRβ deveria ser clarificada. De analisa o presente não está claro se as alterações no tecido não-malignas são secundárias à presença de perto por tecido maligno, tal como sugerido em modelos animais [8], ou se em vez reflete um ambiente de tumor permissivo que contribui causalmente para formação de tumores malignos mais.

as análises incluindo coloração dupla com anticorpos αSMA e PDGFRβ revelou que a expressão PDGFRβ ocorreu em células αSMA -positivas (Figura 2). No entanto, verificou-se também que estas células, em tumores marcados como tendo um estroma PDGFRβ-positiva, ocorreu juntamente com células αSMA -positivo /PDGFRβ-negativas. Estes resultados, assim, exemplificam claramente a heterogeneidade molecular entre as células do estroma fibromusclar não-maligna e do estroma tumoral do tipo fibroblastos. Descobertas similares foram feitas em tumores experimentais [23]. Como também sugerido por outros [24], os resultados devem estimular a uma melhor classificação desses subconjuntos e análises sobre o seu significado funcional continuou

.

As associações entre alta expressão do estroma PDGFRβ e menor sobrevida indicar que este receptor é causalmente ligado ao curso clínico da doença e, portanto, também sugere a segmentação de receptores de PDGF para fins terapêuticos. Alguns estudos menores têm sido relatados em que o imatinib têm sido utilizados no cancro da próstata, sem quaisquer efeitos óbvios [25], [26]. Os resultados do presente estudo, demonstrando grandes variações na expressão do estroma PDGFRβ, sugerem que estudos futuros avaliando esta abordagem irá requerer procedimentos mais rigorosos para seleção dos pacientes. Neste contexto, pode também ser notado que PDGFRβ epiteliais expressão só raramente foi detectado neste estudo (dados não mostrados). Além disso, não foram observadas associações entre esta expressão e as características clínicas ou histopatológicas.

Uma série de tópicos para estudos futuros são sugeridos pelos presentes achados. Estudos experimentais envolvendo co-culturas de células epiteliais e estromais deve ajudar a esclarecer se as associações do estroma-epitelial têm sua base mecanicista predominante no estroma ou compartimento epitelial. Outro tema interessante para estudos futuros seria investigar em que medida o estroma e fenótipos epiteliais estão ligados a genes de risco de câncer de próstata individual. Finalmente, análises contínuos são necessários para compreender se as variações associadas a tumores no tecido não maligno são uma causa ou uma consequência da formação de tumores. tecido cuidadosa análise em estudos prospectivos podem ser necessárias para esclarecer esta questão.

Materiais e Métodos

Pacientes e tissue microarray

As amostras de tecido foram coletadas de pacientes submetidos à ressecção transuretral da próstata (RTU) no hospital em Västerås, Suécia, entre 1975 e 1991. a análise histológica mostrou a presença de câncer de próstata. A idade mediana dos RTU foi de 74 anos (intervalo 51-95 anos). Informação relativa ausência ou presença de hiperplasia benigna da próstata não estava disponível. As amostras de tecido foram fixadas em formalina e incluídos em parafina seguido por reclassificação de acordo com o sistema de Gleason. Os corpos de prova foram utilizadas para a construção de um tecido de micro matriz (TMA) utilizando um instrumento Beecher (Sun Prairie, WI, EUA). A TMA: s continha 5-8 amostras de tecido de tumor que representa tanto o primário e secundário de Gleason e 4 amostras de tecido não-maligno de cada paciente. Os pacientes não tinham recebido qualquer terapia anti-câncer antes RTU. Rádio varredura nuclídeo óssea foi realizada logo após o diagnóstico para a detecção de metástases. Havia 377 pacientes incluídos no estudo, dos quais 293 pacientes foram acompanhados com a espera vigilante após RTU. Na sintomas de pacientes com metástases receberam tratamento paliativo com a ablação do andrógeno e em uma terapia de radiação alguns casos ou terapia com estrógeno, de acordo com as tradições de terapia na Suécia durante esse tempo. Além disso, 84 doentes que foram tratados com o tratamento paliativo imediatamente após o diagnóstico foram analisados. A sobrevida global mediana para o grupo de pacientes seguido com espera vigilante foi de 5,6 anos. Noventa e dois dos espécimes de RTU foram classificados como escore de Gleason (GS) 4-5, 107 pacientes como GS 6, 63 pacientes tiveram GS 7, e 115 pacientes GS 8-10. 3 pacientes (4,1%) com GS 6, 4 pacientes (8,2%) com GS 7, e 33 pacientes (33,7%) com GS 8-10 tinha metástases ósseas no momento do diagnóstico. Em agosto de 2003, 36 pacientes (9,5%) ainda estavam vivos, 131 pacientes (34,7%) tinha morrido de câncer de próstata e 210 pacientes (55,7%) tinham morrido por outras causas. O material foi coletado de acordo com os regulamentos suecos numa altura em que o consentimento informado não era necessária. O Comitê de Ética em Umeå University Hospital (Regional Ethical Review Board em Umeå) aprovou o estudo e dispensou a necessidade de consentimento.

Neste material que já analisados ​​fatores de potencial significado prognóstico como a pontuação de Gleason, volume do tumor, estágio do tumor, proliferação de células tumorais e densidade vascular e os dados obtidos foram agora relacionadas com os resultados PDGFRβ atuais [2], [27].

PDGFRβ imunohistoquímica

PDGFRβ imuno-histoquímica foi realizada tal como descrito em Nupponen

et ai

2008 [28]. Anti PDGFRβ (monoclonal de coelho, # 3169, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) foi utilizado a uma concentração de 2 ug /ml. A intensidade da coloração foi marcado separadamente no estroma e ao redor de vasos, como negativo (0), fraca (1), moderado (2) ou forte (3). A pontuação coloração PDGFRβ são os valores médios de cinco a oito amostras marcou de tecido tumoral ou quatro marcou amostras de tecido não maligno. Para a análise de correlação as amostras foram pontuadas como positivas para a coloração PDGFRβ se foi detectada em pelo menos um dos núcleos de TMA.

Imunofluorescência

colorações imunofluorescentes de TMA foi realizada como acima (no imunohistoquímica secção) até que a incubação com o anticorpo anti-PDGFRβ. As secções foram então lavadas em PBS com 0,1% de Tween-20 (PBT) 3 x 5 min. Isto foi seguido por uma incubação de 1 h com o segundo anticorpo primário, anticorpo monoclonal de rato αSMA (M0851, clone 1A4, Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) diluída 1:100 em soro de cabra a 20% em PBT. Após lavagem em PBT durante 3 × 5 minutos, as lâminas foram incubadas com anticorpo anti-ratinho de cabra biotinilado (E0432, Dako Cytomations 1:500) durante 45 min à TA. Isto foi seguido por mais 3 × 5 min de lavagem em PBT. As lâminas foram então incubadas com Alexa Flour-anticorpo secundário anti-coelho de cabra 488 (A11008, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) diluída 1:100 em PBT durante 45 min à TA. Após a lavagem; as lâminas foram incubadas durante 45 min com estreptavidina conjugada com Cy3 (Sigma-Aldrich) diluída 1:500 em PBT durante 45 min à TA. Depois de lavar as lâminas foram secas e montadas com Vectashield médio com DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) de montagem.

Estatísticas

correlações bivariadas foram calculados com teste de correlação de Pearson. As correlações entre variáveis ​​categóricas e as variáveis ​​contínuas foram analisadas pelo teste de correlação de Spearman. Os dados foram coletados no momento do diagnóstico de câncer de próstata.

Os pacientes incluídos na sobrevivência analisa com a regressão de Kaplan-Meier e Cox foram seguidas com a espera vigilante. A duração da sobrevida livre de eventos (EFS) é definido como o tempo desde a RTU até a data de morte por câncer de próstata, a morte de outra causa, ou até a data do último follow-up. Evento na análise de sobrevivência foi definida como morte por câncer de próstata, mostrando assim a sobrevivência específicos de câncer. Diferenças no resultado foram testadas com o teste de log-rank. O significado prognóstico da PDGFRβ imunorreatividade foi avaliado com a análise de regressão de Cox sozinho e combinado com GS e estágio do tumor local. Probabilidade de sobrevida livre de eventos (P-EFS) é apresentado ± erro padrão (SE). O nível de significância estatística foi definido como

P Art 0,05 (frente e verso). A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 17.0.0 para Mac OS X (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Informações de Apoio

Figura S1. expressão

PDGFRβ varia ocasionalmente no tecido da próstata do mesmo paciente. Heterogéneas PDGFRβ padrões de coloração foi observada em muitos tumores. A e B ilustram diferentes partes do mesmo cancro da próstata. Barra de escala = 200? M

doi:. 10.1371 /journal.pone.0010747.s001

(7.24 MB EPS)

Reconhecimentos

Os membros do laboratório de A.O. são reconhecidos por comentários produtivos e de apoio ao longo do projeto.