Abstract

Os fibroblastos no microambiente do tumor são um factor determinante na progressão do cancro e pode ser um alvo promissor para a terapia do cancro. factor de crescimento semelhante à insulina-proteína de ligação 7 (IGFBP7) é conhecido como um supressor tumoral no cancro colo-rectal (CRC). O presente estudo investigou o mecanismo de indução de expressão IGFBP7 em fibroblastos pelo sobrenadante da linha celular CRC, SW620. Os resultados mostraram que a expressão de IGFBP7 foi regulada nos fibroblastos quando tratados com SW620 sobrenadante e exógena de TGF-β1. O IGFBP7 induzida pelo sobrenadante SW620 ou TGF-β1 foi parcialmente inibida pela TGF-β1 anticorpo específico AF e antagonista do receptor de TGF-β1 SB431542. Os genes alvo de sinalização Wnt, c-Myc, CCND1 e as proteínas Dvl2 /3, foram todos regulados positivamente em fibroblastos que expressam níveis elevados de IGFBP7, e a sobre-regulação pode ser inibida tanto por o antagonista de sinalização Wnt Dickkopf-1 ( DKK1) e pelo antagonista do receptor de TGF-β1 SB431542. Em conclusão, as células de CRC promover a expressão elevada de IGFBP7 em fibroblastos, muito provavelmente através da co-regulação de TGF-β e a sinalização de Wnt de um modo dependente de Smad2 /3-Dvl2 /3. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que os fibroblastos poderiam ser um novo alvo terapêutico na terapia de tumores

citação:. Rao C, Lin SL, Ruan WJ, Wen H, Wu DJ, Deng H (2014) Expressão de alta IGFBP7 em fibroblastos induzida por células de câncer colorretal é co-Regulado por TGF-β e Wnt Signaling numa /3-Dvl2 Manner Smad2 /3-dependente. PLoS ONE 9 (1): e85340. doi: 10.1371 /journal.pone.0085340

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 07 de julho de 2013; Aceito: 04 de dezembro de 2013; Publicação: 10 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Rao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Natural Science Foundation da província de Zhejiang (LY12H16027), a National Science Foundation Natural da China (30.870.971) e do Programa major da National Science Foundation Natural da China (81090420, 81090421). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um dos tumores mais malignos que ameaçam a sobrevivência humana em todo o mundo, ocupando o terceiro lugar entre todos os tumores malignos [1]. A invasão e metástase de células tumorais são a causa principal de morte. Mais investigação tem-se centrado sobre o próprio tumor, mas o importante papel do microambiente em progressão tumoral também tem vindo a ser reconhecido.

Um tumor pode ser pensado como uma ferida que não curam, a invasão e metástase não são apenas determinadas pelas células cancerosas, mas também pelo estroma tumoral [2]. As micro-metástases formar muito antes de um tumor pode ser diagnosticado, e interacção tumor-estroma desempenha um papel importante durante a progressão tumoral. Os fibroblastos são um dos componentes mais importantes de células do estroma do tumor, onde eles sempre adquirir um fenótipo activado [3]. Assim como na fibrose, os fibroblastos em tumores permanecem persistentemente ativada; eles segregam e modular a matriz extracelular (ECM) no estroma, que desempenha um papel importante durante a progressão tumoral [3] -. [5]

IGFBP7 é uma proteína secretada, que é conhecido por ser um supressor tumoral no cancro da mama , cérebro, cólon, pulmão, fígado e pâncreas [6] – [11]. É uma glicoproteína de célula-adesiva de ~ 30 kDa [12]. In vivo, a diferentes padrões de expressão IGFBP7 são encontrados em diferentes tipos de tumores. expressão IGFBP7 é baixa em glioblastoma, câncer de pulmão, câncer de pâncreas e câncer de fígado [6], [9], [10], [13], enquanto que tanto o aumento e diminuição da expressão de IGFBP7 foram relatados no câncer de mama e de próstata [14] – [17]. Estes achados sugerem que o papel de IGFBP7 em células tumorais é complexo, embora eles próprios estudos sobre IGFBP7 em células do estroma tumoral são raras. Em um relatório, IGFBP7 foi encontrada para promover a angiogénese em células endoteliais [18], embora o papel exacto do IGFBP7 em fibroblastos ainda é desconhecido.

Durante interacções tumor do estroma, os fibroblastos podem ser afectados pela sinalização parácrina gerado pela células cancerosas. Entre estes sinalizações, o TGF-β é pensado para ser o mais potente. fibroblastos de TGF-p activado por criar um importante pró-invasão e nicho pró-angiogénese para o desenvolvimento do tumor [19] – [21]. Tem sido relatado que a sinalização de TGF-β actua principalmente através das vias Smad [22]. Após a activação, ligando a TGF-β se liga ao receptor de TGF-β I /II (TβRI /II), e os recrutas TβRI fosforilados e fosforila Smads regulados pelo receptor (R-SMADs). O complexo TβRII-ALK5 activa Smad2 /3, enquanto o complexo TβRII-Alq1 activa Smad1 /08/05. Uma vez activada, R-Smads fosforilar e formam complexos com Smad4, e mover-se para dentro do núcleo para regular a actividade transcricional [23].

Além de sinalização de TGF-β, a sinalização de Wnt também desempenha um papel importante no desenvolvimento de CRC . Os relatórios têm apontado que ~ 90% dos casos de CRC são devidos a mutações da via de sinalização Wnt [24]. Após a activação de Wnt canónica, Wnt ligandos se ligam a receptores Frizzled e LRP (proteína relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade) para promover a fosforilação da LRP de uma forma dependente DVL-[25], [26]. Em seguida, p-LRP recruta Axins do complexo de degradação para a membrana da célula, ajudando β-catenina a escapar da degradação. Os movimentos acumulados β-catenina a partir do citoplasma para o núcleo, e forma um complexo com a activação da transcrição TCF /LEF. O complexo nuclear /LEF-β-catenina TCF activa a transcrição de genes alvo de sinalização Wnt, tais como c-myc, CCND1, FGF20, DKK1 e WISP1, que regulam a proliferação e diferenciação celular [26] – [29].

neste estudo, utilizou-se o sobrenadante a partir de SW620, uma linha de células de CRC que é derivado a partir do tumor metastático de um carcinoma colo-rectal, e HELF que é uma das linhas de células de fibroblastos canónicas. O fato de que ambos SW620 e HELF são linhas celulares negativas IGFBP7 torna a interpretação das nossas descobertas mais inequívoca. O objetivo deste estudo é analisar o padrão de expressão de IGFBP7 em fibroblastos e o mecanismo por trás dele.

Materiais e Métodos

reagente e anticorpos

proteína recombinante TGF-β1 foi comprado de PeproTech, EUA. AF (TGF-β1 anticorpos neutralizantes) e a proteína recombinante DKK1 foram adquiridos a partir de R D, EUA. SB431542 (TGF-β /ALK5 /inibidor Smad2) foi obtido a partir de Sigma, EUA. As fontes comerciais de anticorpos primários foram como se segue: de coelho anti-fosfo-Smad2 (Ser465 /467), de ratinho anti-Smad2, de coelho anti-β-catenina, de coelho anti-TβRII e coelho Kit anti-sinalização Wnt Anticorpo Sampler, Cell Signaling tecnologia, EUA; anticorpo anti-actina β coelho, Santa Cruz, EUA. anticorpos secundários para Odyssey foram adquiridos de Li-COR, EUA.

As culturas de células

fibroblastos (HELF) e CRC linha celular SW620 foram cultivadas em RPMI1640 (Gibco, EUA) suplementado com penicilina Solução estreptomicina (100 U /ml de penicilina, 0,1 mg /ml de estreptomicina, Gibco, EUA), 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 50% de sobrenadante de linha celular SW620 CRC. O meio de cultura foi mudado diariamente durante 3 dias, para ambas as linhas celulares. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 atmosfera.

Preparação de SW620 sobrenadante

BF A linha celular SW620 foi p laqueada em frascos de cultura (8 × 10

5 células) em RPMI 1640 suplementado com penicilina-estreptomicina Solução (como acima), e 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Gibco, EUA). Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera. O sobrenadante (SW620-S) foi recolhido após 2 dias, filtrada com uma membrana de filtro de 0,22 um (Millipore, Irlanda) e armazenado a -80 ° C.

tratamento celular

fibroblastos cultivadas em frascos de cultura foram lavadas duas vezes com PBS, em seguida, substituído por RPMI 1640 sozinho ou 50% RPMI 1640 suplementado com 50% fresco SW620-S, diferentes concentrações de proteína TGF-β1 recombinante, com ou sem FA, SB431542 durante vários períodos de tempo; os tratamentos foram funciona a cada 3 dias, e a expressão de IGFBP7 foi detectada por Quantitative real-time PCR, RT-PCR e análise de Western blot.

quantitativa PCR em tempo real (Q-PCR) e RT-PCR

O ARN total a partir de fibroblastos tratados ou não tratados foi extraída com Reagente TRIzol (Invitrogen, EUA) e reversamente transcrito em ADNc utilizando transcriptase reversa Superscript II (Takara, Japão). reacções de Q-PCR foram realizadas com SYBR Premix Ex Taq (Takara, Japão) no rápido Real-Time PCR System ABI 7900HT (Applied Biosystems, EUA). Os iniciadores utilizados para Q-PCR foram concebidos de acordo com o GenBank (Tabela S1). As condições de Q-PCR foram as seguintes: 10 segundos de desnaturação a 95 ° C, 5 segundos de desnaturação a 95 ° C, 30 segundos de extensão de recozimento a 60 ° C durante 40 ciclos. A fluorescência foi detectada no final de cada fase. A transcrição de IGFBP7 foi normalizado ao nível transcrição do gene GAPDH de limpeza. reacções de RT-PCR foram realizadas com polimerase Taq (Takara, Japão). As condições de RT-PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação a 94 ° C, 30 segundos de desnaturação a 94 ° C, 30 segundos de emparelhamento a 59 ° C, extensão de 30 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos, a extensão de 5 minutos a 72 ° C. A transcrição de IGFBP7 foi normalizado para o nível de transcrição do gene GAPDH de limpeza.

análise de Western blot

Os fibroblastos foram lisadas em tampão RIPA. Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 1,33 × 10

5 rpm durante 1 hora a 4 ° C, e o teor de proteína no sobrenadante foi medida utilizando o ensaio de proteína BCA. 50 ug de extracto de proteína total foram carregados num gel de SDS-PAGE a 10% e, em seguida, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, EUA). A membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado em TBST (Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,05% v /v de Tween-20) durante 2 horas à temperatura ambiente e incubadas com anticorpo primário (1:1000) durante a noite a 4 ° C. Depois de se lavar com TBST 3 vezes, as manchas foram sondadas com anticorpo secundário (1:5000) durante 1 hora à temperatura ambiente. β-actina foi utilizada para normalizar a quantidade de proteína da amostra carregada. Imunotransfer�cias foram escaneados com Odyssey (LI-COR, EUA). avaliação semiquantitativa das bandas foi realizada por análise densitométrica com o software ImageJ.

Microscopia de imunofluorescência

Células sobre lamelas foram fixadas em acetona fria por 10 minutos. As lamelas com as células, em seguida, foram lavadas com PBS 3 vezes durante 5 minutos à temperatura ambiente, depois permeabilizadas em 0,05% de Triton X-100 durante 20 minutos e bloquearam-se com soro bovino normal a 10% durante 30 minutos. As células foram incubadas com anticorpos primários diluídos em PBS durante a noite a 4 ° C. As lamelas foram lavadas em PBS antes da incubação durante 1 hora com anticorpos secundários e 20 minutos com DAPI (1: 5000; Invitrogen). As imagens foram tiradas por um microscópio confocal Zeiss LSM510.

A análise dos dados

Os resultados foram expressos em média ± S.E.M. de 3 experiências. O teste t pareado foi utilizado para as comparações individuais de grupos com igual variância e distribuição normal. Análise de variância (ANOVA) seguido por pós-teste de Newman-Keuls foi utilizado para comparar vários dados para cada grupo. A análise estatística foi realizada utilizando o software Prism (GraphPad, EUA).

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

expressão alta IGFBP7 em fibroblastos é induzida por SW620-S

Dado o tumor- papel supressor de IGFBP7 em linhas de CRC de células [30], e a expressão de alto na frente invasiva de tumores CRC (resultados não publicados), os presentes resultados mostraram que SW620-S induzidas expressão IGFBP7 em fibroblastos, após a incubação de fibroblastos na presença de SW620-S durante vários períodos de tempo. Os resultados revelaram que SW620-S substancialmente regulado para cima o nível de IGFBP7, em comparação com o grupo controle. Os fibroblastos expostos a SW620-S mostrou uma sobre-regulação de ARNm IGFBP7 dependente do tempo (Figura 1A e 1B). Além disso, a expressão elevada IGFBP7 também foi detectada em fibroblastos tratados com o sobrenadante das outras duas linhas celulares de CRC HT29 e Lovo (Figura 1C e 1D, Figura S1).

. B. ARNm de expressão IGFBP7 determinada por RT-PCR (A) e Q-PCR (B) em fibroblastos expostos a SW620-S para 0, 2, 4 e 6 dias respectivamente. expressão C. D. IGFBP7 ARNm determinada por RT-PCR em fibroblastos expostos a HT29-S (C) e Lovo-S (D) durante 0, 2, 4 e 6 dias. O nível de ARNm foi normalizada para a da GAPDH nos mesmos extractos celulares. *

P

. 0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratados e grupo controle (0 dia)

TGF-β1 em SW620-S induz a expressão IGFBP7 em fibroblastos

estudo prévio dos factores segregados pelas linhas celulares de CRC têm mostrado que as células cancerígenas segregam TGF-β1 durante interacções tumor do estroma [31]. Na suposição de que a indução IGFBP7 era devido ao TGF-β1, fibroblastos foram expostos a 5 ng /ml de TGF-β1 exógeno; eles mostraram um aumento dependente do tempo em ARNm IGFBP7 (Figura 2A e, 2B). Além disso, os fibroblastos expostas a diferentes concentrações de TGF-β1 exógeno que varia de 5 ng /ml a 20 ng /ml durante 6 dias mostrou um aumento dependente da dose no ARNm IGFBP7 (Figura 2C e 2D). Os dados mostraram que a expressão de IGFBP7 não é somente dependente do tempo, mas também sobre a concentração de TGF-β.

. B. ARNm de expressão IGFBP7 determinada por RT-PCR (A) e Q-PCR (B) em fibroblastos expostos a RPMI1640 ou 5 ng /ml de TGF-β1 durante 0, 2, 4 e 6 dias. expressão C. D. IGFBP7 ARNm em fibroblastos expostas a 0, 5, 10 e 20 ng /ml de TGF-β1 durante 6 dias determinados por RT-PCR (C) e Q-PCR (D). EF fibroblastos foram tratados com SW620-S ou 5 ng /ml de TGF-β1 na presença de 0, 20, 200 ng /ml da FA durante 6 dias, ARNm IGFBP7 em fibroblastos foi detectada por RT-PCR (E) e Q-PCR (F). O nível de ARNm foi normalizada para a da GAPDH nos mesmos extractos celulares. *

P Art 0,05 entre SW620-S /fibroblastos tratados com TGF-β1 e grupo controle.

+

P

0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratadas com ou sem 20 ng /ml da FA.

++

P Art 0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratados com ou sem 200 ng /ml AF.

#

P Art 0,05 entre fibroblastos TGF-tratados-p1 com ou sem 20 ng /ml AF.

##

P

. 0,05 entre fibroblastos TGF-tratados-p1 com ou sem 200 ng /ml AF

Para verificar se TGF-β1 foi a proteína secretada CRC por células responsáveis ​​pela indução IGFBP7, utilizou-se imunodepleção com um anticorpo específico do TGF-β1-(20 ng /ml da FA) para remover o TGF-β1 do SW620-S. Este Imunodeprimido SW620-S não conseguiu induzir IGFBP7 em fibroblastos (Figura 2E). Os fibroblastos tratados com SW620-S ou TGF-β1 na presença de AF inibiu parcialmente a IGFBP7 induzida por SW620-S ou TGF-β1 sozinha, o que indica que o TGF-β1 era o principal, mas não o único, o factor que induziu IGFBP7 ( Figura 2F).

expressão alta IGFBP7 em fibroblastos é principalmente através de TGF-β /ALK5 /Smad2 via de sinalização

na sinalização TGF-β, o complexo TβRII-ALK5 fosforila Smad2 /3. A fim de determinar se a indução de IGFBP7 foi através da sinalização de Smad2-dependente, SB431542 (um antagonista selectivo de TGF-β ALK5 sinalização //Smad2) foi adicionado a fibroblastos. Em fibroblastos expostos a SW620-S ou exógena de TGF-β1 com SB431542 10 mM, a indução IGFBP7 foi parcialmente inibida (Figura 3C e 3D). Alta expressão de P-Smad2 foi detectada em fibroblastos tratados com SW620-S durante vários períodos de tempo. Esta sobre-regulação de P-Smad2 foi dependente do tempo, atingindo um pico no dia 6 (Figura 3B). Os níveis de p-Smad2 (Figura 3E) e TβRII (Figura 3A) aumentaram SW620-S ou exógena de TGF-β1 foram diminuiu para o nível normal por SB431542, que indicou que este aumento da regulação foi através do TβRII-ALK5-Smad2 /3 via.

A. A expressão de TβRII foi detectado por Western blot. B. Os fibroblastos foram expostos a SW620-S para 0, 2, 4 e 6 dias, e p-Smad2 foi detectado por Western blot. Os níveis de proteína foram normalizadas para que de β-actina nos mesmos extractos celulares. CD. Os fibroblastos foram expostos a SW620-S ou TGF-β1 na presença de 10 uM SB431542 durante 6 dias, e expressão de ARNm IGFBP7 foi detectada por RT-PCR (C) e Q-PCR (D). O nível de ARNm foi normalizada para a da GAPDH nos mesmos extractos celulares. E. Os fibroblastos foram expostos a SW620-S ou TGF-β1 com SB431542 10 mM durante 6 dias, e a expressão de Smad2, p-Smad2 (E) foi detectado por Western blot. Os níveis de proteína foram normalizadas para que de β-actina nos mesmos extractos celulares.

*

P Art 0,05 entre SW620-S /fibroblastos tratados com TGF-β1 e grupo controle.

+

P Art 0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratados com ou sem SB431542,

#

P Art 0,05 entre fibroblastos TGF-tratados-p1, com ou sem SB431542.

IGFBP7-regulação em fibroblastos é parcialmente através da ativação da via de sinalização Wnt canônica

Uma vez que via de sinalização Wnt regula a ativação dos fibroblastos, partimos para determinar se Wnt , especialmente a via de sinalização Wnt canônica, foi outro regulador. Os fibroblastos tratados com SW620-S mostrou alta expressão de c-Myc e CCND1, os genes alvo a jusante da via de sinalização Wnt, de um modo dependente do tempo. O Wnt canónica de sinalização de proteína β-catenina detectado por Western blot (Figura S2A) foi aumentado e activado como demonstrado por microscopia immunofluorence (Figura S2B) que indicou que a sinalização de Wnt canónica foi activado durante IGFBP7 sobre-regulação (Figura 4A e 4B).

A. B. Os fibroblastos foram tratados com S-SW620 para 0, 2, 4 e 6 dias, e a expressão do mRNA da sinalização de Wnt genes alvo c-myc (A) e CCND1 expressão (B) ARNm foi avaliada por Q-PCR. C-E. Os fibroblastos foram tratados com SW620-S na presença de 50 ng /ml de DKK1 (antagonista de Wnt) durante 6 dias, e expressão de ARNm IGFBP7 foi detectada por RT-PCR (C) e Q-PCR (D). A expressão de ARNm foi normalizada para a da GAPDH nos mesmos extractos celulares. A proteína de sinalização Wnt Dvl3 foi detectada em fibroblastos por Western blot (E). A expressão da proteína foi normalizada para a da β-actina na mesma extracto celular. *

P Art 0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratados e grupo controle. **

P Art 0,05 entre fibroblastos tratados com DKK1 e grupo controle.

+

P

. 0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratados com ou sem DKK1

Tendo mostrado que a sinalização Wnt foi ativado, que, em seguida, investigou a relação entre este activação ea alta expressão de IGFBP7. DKKs são secretadas glicoproteínas que são conhecidas para antagonizar a sinalização de Wnt canónica [32]. Quando os fibroblastos foram tratados com DKK1, a expressão elevada de IGFBP7 induzida por SW620-S foi parcialmente inibida (Figura 4C e 4D). As proteínas de sinalização Wnt Dvl2 /3 detectadas por Western Blot foram inibidas pelo DKK1 (Figura 4E), o que sugere que a sobre-regulação de IGFBP7 estava intimamente relacionado com a via de sinalização Wnt canónica. Portanto, os factores responsáveis ​​pela expressão elevada de IGFBP7 pode ser o TGF-β1 e Wnt ligandos como Wnt3a que activado o TGF-β e a via de sinalização Wnt.

TGF-β e Wnt via de sinalização canónica co-operar na regulação da expressão elevada de IGFBP7 em fibroblastos

a fim de esclarecer a relação entre TGF-β e via de sinalização Wnt, nós tratados fibroblastos com TGF-β1, e descobriu que ele também aumentou o nível de c-Myc , CCND1 e DKK1; Além disso, este aumento da regulação foi parcialmente inibida por SB431542 (Figura 5A-5C). Estes resultados foram observados ao nível da proteína, como proteínas Dvls são mediadores positivos da sinalização de Wnt situado a jusante dos receptores Frizzled e a montante da β-catenina. Dvl3 foi regulada por meio do tratamento TGF-β1 (Figura 5D), que indica que a sinalização de Wnt foi activado durante a interacção e esta mudança foi invertido pelo antagonista de TGF-β SB431542, sugerindo que, com TGF-β sinalização de activação, a sinalização de Wnt foi igualmente activado. Nós, portanto, encontrou a existência de um romance de cross-talk entre Wnt e sinalização TGF-β que foi Dvl2 /3-Smad2 /3-dependente.

A-D. Os fibroblastos foram expostos a SW620-S ou TGF-β1 na presença de 10 uM SB431542 durante 6 dias, e a expressão de ARNm do Wnt genes alvo de sinal de c-Myc (A), CCND1 (B) e DKK1 (C) foram avaliados pelos Q-PCR. a expressão de ARNm foi normalizada para a da GAPDH nos mesmos extractos celulares. A expressão de Dvl3 foi detectado por Western blot (D). A expressão da proteína foi normalizada para a da β-actina na mesma extracto celular. *

P Art 0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratados e grupo controle. **

P

. 0,05 entre TGF-tratados-p1 fibroblastos e grupo controle

+

P Art 0,05 entre fibroblastos SW620-S-tratados com ou sem SB431542.

#

P Art 0,05 entre fibroblastos TGF-tratados-p1 com ou sem SB431542. E. Modelo de alta expressão de IGFBP7 induzida pelas interacções das células de fibroblastos tumorais. F. TGF-β sinal de activação se regula-Smad2 /3 e Dvl2 /3, acompanhada por sobre-regulação da via Wnt genes alvo c-myc, CCND1 e DKK1, de tal modo que IGFBP7 é sobre-expresso.

Discussão

Estas experiências demonstraram que o sobrenadante a partir da linha celular SW620 (SW620-S) IGFBP7 induzida em fibroblastos principalmente através da co-regulação de TGF-β /ALK5 /Smad2 de sinalização e de sinalização Wnt canónica . Esta é a primeira prova do mecanismo subjacente à expressão alta IGFBP7 em fibroblastos durante as interações tumor-estroma. Nossa hipótese é que IGFBP7 é um dos genes alvo a jusante do TGF-β /Smad2 e sinalização Wnt canônica, embora a posição exata do IGFBP7 ainda precisa de mais investigação.

Neste estudo, nós mostramos que as células CRC induziu uma expressão elevada de IGFBP7 (Figura 5E). Como IGFBP7 é um supressor de tumor, a maioria das pesquisas sobre IGFBP7 tem-se concentrado nas próprias células tumorais. Em um modelo de xenoenxerto de tumor, por exemplo, a sobre-expressão de IGFBP7 inibido o crescimento do melanoma [33]. Por que então as células tumorais secretam fatores que induzem IGFBP7 que por sua vez suprime seu próprio crescimento? Isto pode ser o resultado da resistência de fibroblastos para as células tumorais. Qual é o significado da expressão elevada de IGFBP7 em fibroblastos? Actualmente, esta é difícil de avaliar, porque há pouca pesquisa sobre o papel da IGFBP7 no estroma tumoral. IGFBP7 foi encontrado altamente expresso nos vasos de glioma [34]; ele pode interagir com a proteína de matriz extracelular para induzir a adesão e a migração de células endoteliais [35], [36]. Pen e seus colegas também informou que IGFBP7 nas células endoteliais pode induzir a angiogênese [18]. Outros constataram que IGFBP7 provavelmente participa na activação e proliferação de fibroblastos [37]. Estas observações sugerem que IGFBP7 em células de tumor no estroma pode desempenhar um papel completamente diferente do IGFBP7 nas células estromais de tumores. Os nossos dados não publicados mostraram que IGFBP7 pode estar correlacionada com a activação de fibroblastos, mas o significado detalhada da sua elevada expressão em fibroblastos ainda é desconhecido e requer uma investigação mais aprofundada.

Os nossos resultados mostraram que a expressão em fibroblastos IGFBP7 está intimamente relacionado com o TGF-β secretado por células de CRC. Além disso, a expressão de IGFBP7 é não só dependente do tempo mas também dependente da dose no que se refere ao TGF-β. O anticorpo e o inibidor de TGF-β confirmou este resultado. Tem sido relatado que a sinalização de TGF-β também regulou a expressão de IGFBP7 em células endoteliais cerebrais [18], um outro exemplo de um compartimento de células de estroma. E nós sabemos, o TGF-β sinalização /Smad3 tem sido considerada como supressor de tumor durante a progressão tumoral, uma vez CDKN1A induzida por TGF-β (P16) e expressão CDKN2B (P15) está correlacionada com a inibição de tumores [38]. No entanto, outros estudos conclui que o CTGF e PAI-1, o gene-alvo a jusante de TGF-β /Smad3 sinalização, está correlacionada com um risco elevado de metástases no cancro da mama [39]. Ele sugere TGF-β /Smad3 pode inversamente promover a invasão e migração na fase final da formação do tumor [40], [41]. Portanto, especula-se que o TGF-β secretada por células cancerosas que promovem a expressão em fibroblastos IGFBP7 pode diminuir a função supressora de tumores de fibroblastos no tecido tumoral.

A relação de IGFBP7 e a sinalização de Wnt não tem sido investigada, e o nosso estudo é a primeira a mostrar que a sinalização de Wnt podem regular a expressão de IGFBP7 em fibroblastos. Tem sido relatado que a sinalização de Wnt /β-catenina regula a diferenciação de fibroblastos, o que sugere que a sinalização de Wnt /β-catenina é um regulador importante do fenótipo de fibroblastos [42]. Isto sugere que a sinalização de Wnt podem afectar IGFBP7 através mediando o estado de diferenciação de fibroblastos.

sinalização Wnt é conhecido por ser activado quando fibroblastos são activados por TGF-β [43]. Aqui percebemos que a sinalização Wnt é ativada durante a indução IGFBP7 em fibroblastos por TGF-β. É estranho que, exceto para c-Myc e CCND1, a expressão de DKK1 foi também up-regulada por TGF-β. Sabemos que DKK1 é um antagonista canônica de sinalização de Wnt. Estes resultados publicados são, portanto, incompatíveis com os nossos resultados. No entanto, além disso, devemos observar que o DKK1 é também o gene alvo de sinalização de Wnt [28]. Este pode ser um mecanismo de retroalimentação negativa entre estas duas vias de sinalização. Estes dois sinais podem cooperar durante a indução IGFBP7 em fibroblastos. No que diz respeito à forma como eles cooperam: descobrimos que eles estavam ligados por Smad2 /Dvl3. Há várias explicações para a interação entre essas duas vias de sinalização. Um modo de interacção entre Wnt /β-catenina e TGF-β /SMADs sinais é a interacção entre Smads e β-catenina /TCF4 [44]. Um outro modo pode ser por Wnt5a induzindo a formação da MARK2 /complexo Dvl3 /Smad4 [45]. Ainda um outro modo podem ser Wnt3a promovendo um fenótipo associado a cancro fibroblastos, como em fibroblastos, parcialmente através do TGF-β /Smad2 activação de sinalização por um mecanismo β-dependente-catenina [46], indicando que Wnt e sinalização de TGF-β estão ligados por Smad. Dos resultados obtidos, em fibroblastos, a activação de Wnt induzida por TGF-β era mais provável através da sobre-regulação de Smad e Dvl3. Concluímos, portanto, que Dvl3 pode ser um ponto novela de cross-talk entre vias de sinalização Wnt em fibroblastos TGF-β e. Smad2 /3 e Dvl2 /3 podem formar um tipo de composto que pode ligar a TGF-β e sinalização de Wnt (Figura 5F). Tem sido relatado que o TGF-β e a sinalização de Wnt co-regular a determinação de células estaminais mesenquimais destinos em células mamárias, incluindo a indução de cancro de células estaminais. Portanto, a combinação destas duas vias de sinalização pode ser um mecanismo por trás de algumas condições, tais como doenças fibróticas [47] – [49].

Sabemos que a parácrina moléculas secretadas por células CRC durante as interações do estroma tumorais sinalização incluem TGF -β, Wnt e alguns outros factores, e que estes podem alterar os fibroblastos vizinhos. Sabemos também que os fibroblastos em estroma tumoral são responsáveis ​​pela síntese de MMPs e fibras colágenas. células tumorais ajuda MMPs invadir a membrana basal, enquanto que as fibras de colágeno fornecer células tumorais com um substrato físico conveniente sobre o qual migram [50]. É por isso que os fibroblastos em estroma tumoral têm sido chamados “invasores e migrators distante” [51].

Ao todo, a interação tumor-estroma é um processo complexo. Durante este processo, as células tumorais podem segregar factores de alterar a diferenciação de fibroblastos normais, e os fibroblastos alterados em retorno secretar factores que afectam a progressão da invasão tumoral e migração. Nós apresentamos dados que indicam o mecanismo de como IGFBP7 podem estar envolvidos nessa interação, e essa interação, sublinhando a participação dos fibroblastos do estroma tumoral, poderia formar o foco de uma nova abordagem terapêutica para o tratamento do câncer.

Informações em apoio

Figura S1.

HT29-S e Lovo-S induzir a expressão elevada de IGFBP7 em fibroblastos. análise semi-quantitativa do nível de expressão de ARNm de IGFBP7 determinada por RT-PCR em fibroblastos expostos a HT29-S (A) e Lovo-S (B) durante 0, 2, 4 e 6 dias. O nível de ARNm foi normalizada para a da GAPDH nos mesmos extractos celulares. *

P Art 0,05 entre HT29-S /fibroblastos Lovo-S-tratados e grupo controle (0 dia)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085340.s001

(TIF)

Figura S2.

β-catenina é activado durante a sobre-regulação de IGFBP7 em fibroblastos. A. Os fibroblastos foram tratados com S-SW620 ou TGF-β durante 6 dias e a expressão de proteína Wnt sinalização β-catenina foi detectada em fibroblastos por Western blot. A expressão da proteína foi normalizada para a da β-actina na mesma extracto celular. *

P Art 0,05 entre TGF-tratados-p1 fibroblastos e grupo controle. B. Os fibroblastos foram tratados com SW620-S ou TGF-β por 6 dias e β-catenina (vermelho) e DAPI (azul) foram detectados em fibroblastos por microscopia de imunofluorescência (ampliação original × 1000)

doi:. 10.1371 /journal .pone.0085340.s002

(TIF)

Tabela S1. Primers

Q-PCR

doi: 10.1371. /Journal.pone.0085340.s003

(DOC)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Brian Eyden (Manchester) para a edição de idioma Inglês, estimular a discussão e revisão do manuscrito. Agradecemos ao professor Mao-De Lai e membros de laboratório para obter ajuda e aconselhamento ao longo deste trabalho.