Abstract

Fundo

Os cancros do pulmão são responsáveis ​​pela maioria de cérebro metástases, que colocam grandes desafios terapêuticos. Biomarcadores prognosticating para o desenvolvimento de metástases cerebrais em pacientes com cancros do pulmão de células não pequenas (NSCLC) pode melhorar de cuidados pessoais. Seis biomarcadores de proteômica do soro foram previamente investigadas no Memorial Sloan Kettering, mas suas associações com metástases cerebrais eram desconhecidos.

Métodos

Serum NSE, Cyfra 21-1, ProGRP, SCC-Ag, TIMP1 e HE4 por ensaios proteômicas baseadas em ELISA foram prospectivamente coletadas de pacientes consecutivos com estágio IV NSCLC. O pré-tratamento níveis de biomarcadores no soro, bem como idade, histologia e estado de mutação

do receptor do factor de crescimento epidérmico

(

EGFR

) foram avaliados quanto à associação com a presença de linha de base de metástases cerebrais por meio de regressão logística e análise multivariada. Para pacientes sem metástases cerebrais no início do estudo, a incidência cumulativa de metástases cerebrais subsequentes foram comparados de acordo com biomarcadores de base e fatores clínicos utilizando o teste de Gray

Resultados

Um total de 118 pacientes foram inscritos, 31. (26%; 95% CI 0,19-0,35) tiveram metástases cerebrais no início do estudo e acrescidos de 26 (22%; 95% CI 0,15-0,30) metástases cerebrais desenvolvidos posteriormente. Pré-tratamento níveis de biomarcadores no soro estavam disponíveis em 104 pacientes. Não houve associação significativa entre as seis marcadores biológicos e de presença de linha de base ou subsequente desenvolvimento de metástases cerebrais. Idade mais jovem de 65 anos foi o único fator clínica significativamente associada com metástase cerebral no início do estudo (OR 3,00; IC 95% 1,22-7,34, P = 0,02) por meio de análise multivariada. Observou-se uma tendência de aumento da incidência cumulativa de metástases cerebrais posteriores em pacientes com

EGFR

mutação (p = 0,2), mas isso não foi estatisticamente significativa, possivelmente devido ao pequeno tamanho da amostra.

Conclusões

Serum NSE, Cyfra 21-1, Pro-GRP, SCC-Ag, TIMP1 e HE4 não estão significativamente associados com metástases cerebrais. Os nossos métodos, tendo em conta o tempo de seguimento podem ser aplicada a conjuntos de dados independentes para identificar um grupo de pacientes com uma propensão para o desenvolvimento biológico superior metástases cerebrais. Essa informação pode ser útil para o estudo de agentes visando o desenvolvimento de metástases cerebrais

Citation:. Li BT, Lou E, Hsu M, Yu HA, Naidoo J, Zauderer MG, et al. (2016) Serum biomarcadores associados com resultados clínicos Fail para Predict cérebro metástases em pacientes no estágio IV não-pequenas células do pulmão. PLoS ONE 11 (1): e0146063. doi: 10.1371 /journal.pone.0146063

editor: Amit Dutt, Centro Avançado de Atendimento, Pesquisa e Ensino em Câncer, Tata Memorial Center, Índia |

Recebido: 20 de julho de 2015; Aceito: 11 de dezembro de 2015; Publicação: 05 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:. financiamento filantrópico sem restrições ao Serviço de Oncologia Torácica no Memorial Sloan Kettering Cancer Center foi usado para apoiar o estudo, é recebida por MGK. Este estudo foi apoiado pelo Núcleo Grant (P30 CA008748) no Memorial Sloan Kettering Cancer Center do National Institutes of Health, EUA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as metástases cerebrais continuam a ser a forma mais comum de tumores do sistema nervoso central e aproximadamente metade deles resultam de cancros do pulmão [1, 2]. Apesar dos avanços na terapia do câncer, a sobrevida média para doentes com metástases cerebrais cancro do pulmão como um grupo é de apenas 4-6 meses [3]. Actualmente não há nenhum biomarcador aprovado que poderia ser utilizada em pacientes com cancros do pulmão para prognosticar de forma fiável para o desenvolvimento de metástases cerebrais. Estudos que explorem a associação de

do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR)

estado de mutação eo desenvolvimento de metástases cerebrais tiveram resultados contraditórios, e estudos que mostram uma maior incidência de metástases cerebrais em pacientes com

EGFR

mutação não ter tido em conta a relativa maior sobrevida desses pacientes [4-9]. O desenvolvimento de biomarcadores prognósticos não invasivos para metástases cerebrais pode ajudar a selecionar pacientes de alto risco com câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) para a vigilância imagiologia cerebral mais intensa e as estratégias de tratamento profilático como aqueles comprovada para melhorar a sobrevida de câncer de pulmão de pequenas células [ ,,,0],10, 11].

Um estudo anterior publicado no

British Journal of Cancer

por Jacot

et al

[12] descobriram que altos níveis de soro neurônio específico do enolase (NSE) pode ser associada com metástases cerebrais em pacientes com cancros do pulmão. Os níveis elevados de NSE foi pensada para ser mediada por neuronais metástases cerebrais danos nos tecidos circundantes, no entanto, esta conclusão não foi validado, independentemente, [12]. O nosso grupo já publicou uma análise de seis marcadores biológicos: NSE, fragmento da citoqueratina 19 21-1 (Cyfra 21-1),-pro-péptido libertador de gastrina (GRP-Pro), antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC-Ag), tecido inibidor de metaloproteinase-1 (TIMP1), e proteína humana epidídimo 4 (HE4), e examinaram a capacidade de melhorar o diagnóstico não invasivo e a diferenciação de tipos histológicos de cancro do pulmão [13]. Em uma análise mais aprofundada deste conjunto de dados, detectou tendências de aumento dos níveis de biomarcador de soro no subgrupo de pacientes com metástases cerebrais cancro do pulmão. Nós, portanto, procurou avaliar o valor prognóstico destes marcadores biológicos, examinando sua associação com a presença de linha de base e posterior desenvolvimento de metástases cerebrais em pacientes com NSCLC. Além disso, também procuraram determinar se os fatores clínicos, tais como idade, histologia, e

status de EGFR

mutação, associado com o desenvolvimento de metástases cerebrais, tendo em conta a sobrevivência e tempo de seguimento.

Materiais e Métodos

desenho do estudo e pacientes

Esta pesquisa foi aprovada pelo Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Review Board. Foi realizado um estudo prospectivo em MSK com o objetivo principal de avaliar o valor prognóstico de biomarcadores à base de soro (NSE, Cyfra 21-1, Pro-GRP, SCC-Ag, TIMP1 e HE4) [13]. pacientes consecutivos com câncer de pulmão metastático tratados em MSK entre 2004 e 2008 foram convidados a se inscrever. Todos os pacientes forneceram amostras de consentimento e soro informado por escrito foram coletadas antes do início da quimioterapia. Os valores quantitativos de biomarcadores séricos foram analisados ​​retrospectivamente para a sua associação com a presença de linha de base e posterior desenvolvimento de metástases cerebrais. Todos os pacientes deste análise tivesse confirmado patologicamente estágio IV NSCLC. características clínico-patológicas de pacientes, incluindo idade, histologia e

EGFR

estado de mutação foram avaliadas para associação com a presença de linha de base e posterior desenvolvimento de metástases cerebrais.

ensaios de biomarcadores Plasma

As amostras foram coletadas , armazenadas a -80 ° C, processados ​​e analisados ​​em uma clínicos Laboratory Improvement Alterações MSK (CLIA) certificada laboratório. Foram realizadas análises biomarcador soro utilizando kits validados disponíveis comercialmente imunoenzimático (ELISA). A NSE CanAg EIA imunoensaio não-competitivo (

Fujirebio Diagnostics AB

,

Suécia

) foi usada com dois anticorpos monoclonais dirigidos contra a forma αγ da enolase enzima glicolítica (2-fosfo-D- glicerato hidrolase, EC 4.2.1.11). O Cyfra 21-1 EIA (

Fujirebio Diagnostics AB

,

Suécia

) foi usado com dois anticorpos monoclonais (MAB) específicos para citoqueratina 19 no soro. O CanAg ProGRP EIA (

Fujirebio Diagnostics AB

,

Suécia)

ensaio não competitivo foi usado. O CanAg SCC EIA imunoensaio não competitivo (

Fujirebio Diagnostics AB

,

Suécia

) foi realizada utilizando a técnica de sanduíche direto. O ensaio imunoenzimático sanduíche quantitativo foi usado para avaliar TIMP1 Human

(Quantikine® R D Sistema

,

Minneapolis

,

Minnesota)

. O HE4 EIA (

Fujirebio Diagnostics AB

,

Suécia)

foi usado com dois anticorpos monoclonais de rato (2H5 e 3D8) dirigidos contra dois epitopos no domínio C-WFDC de HE4.

Noventa placas de oito poços foram revestidas e analisados ​​usando um analisador de placa robótico. As microplacas foram revestidas com o seguinte rábano MAb marcada com peroxidase: anti-NSE E17 Mab, anti-Cyfra 21-1 MAb, MAb anti-ProGRP E146, anti-SCC MAb, MAb anti-TIMP1, e biotinilado anti-HE4 MAb 2H5. As amostras de soro foram então adicionados e incubados com o anticorpo monoclonal indicado. Após lavagem, o cromogénio reagente (peróxido de hidrogénio e 3, 3 ‘, 5, 5’-tetrametilbenzidina) foi adicionado a cada poço. Para TIMP1, depois de lavar um anticorpo policlonal ligado a enzima específica para TIMP1 foi adicionado à microplaca. Depois da lavagem, uma solução de substrato foi adicionado a cada poço

A análise estatística

Os níveis de biomarcadores foram dicotomizados no limite superior do normal com base em dados publicados anteriormente:. NSE (20 ng /mL ), Cyfra 21-1 (3,3 ng /ml), Pro-GRP (50 pg /ml), SCC-Ag (2,5 ng /ml), TIMP1 (58,9 ug /L), e HE4 (83 pmol /L) [ ,,,0],14-19]. Os dados foram obtidos a partir de uma base de dados clínica prospectivamente mantidos anônimos no MSK.

Para investigar se esses marcadores biológicos (alta vs. normal) e os fatores clínicos, incluindo idade, histologia e

EGFR

mutação têm valor prognóstico para metástases cerebrais, analisamos primeiro sua associação com a presença ou ausência de metástase cerebral no momento do diagnóstico IV palco e, em seguida, com o desenvolvimento da subsequente metástase cerebral entre os pacientes que não tiveram metástase cerebral de base. Associação de fatores com presença de metástases cerebrais foi avaliada por meio de regressão logística. A análise univariada foi realizada em todas as variáveis, e se não foi observada associação significativa, foi necessário, então nenhuma outra análise multivariada. Se um fator foi encontrado para ser significativamente associada com metástases cerebrais em análise univariada, um modelo de regressão logística multivariada foi montado para avaliar a associação ajustada para co-variáveis ​​clinicamente relevantes.

Em seguida, nós capturamos as datas do desenvolvimento subsequente de metástases cerebrais em pacientes que não tinham metástase cerebral de base. Uma abordagem time-to-evento com competindo metodologia de risco foi utilizado para analisar esse resultado, uma vez que leva em conta as diferenças de tempo de seguimento e as numerosas mortes nesta população metastático que impedem observar uma metástase cerebral [20]. Nós usamos a função de incidência cumulativa para estimar a probabilidade de posterior metástase cerebral onde a morte, sem metástase cerebral foi considerada um evento competindo. A associação entre os níveis de biomarcadores (alta vs. normal) e a incidência cumulativa de posterior metástase cerebral foi avaliada pelo teste de Gray. Uma abordagem semelhante foi utilizado para avaliar os fatores clínicos de associação com o desenvolvimento de metástase cerebral posterior. Para todas as análises, um valor p inferior a 0,05 foi considerado significativo. análise de risco concorrente foi analisada utilizando

cmprsk

pacote em R versão 3.1.1 (https://www.R-project.org). Todas as outras análise estatística foi realizada utilizando SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC):

Resultados

As características dos pacientes

Um total de 118 pacientes com estágio IV NSCLC que estavam tratamento naïve foram inscritos, 57 (48%) dos quais desenvolveram metástases cerebrais, detectado tanto no diagnóstico (n = 31, 26%, 95% CI: ,19-,35) ou posteriormente durante o seu curso de tratamento (n = 26, 22%, IC 95%: 0,15-0,30) (Tabela 1). A idade média foi de 64 (intervalo 36-85), 68 eram mulheres e 50 eram homens. Por subtipos histológicos, 99 tinham adenocarcinoma, 13 tinham carcinoma de células escamosas, e 6 tiveram NSCLC não especificado de outra forma. biomarcadores séricos de pré-tratamento de linha de base estavam disponíveis para 104 pacientes. Atrito era devido ou a coleção de pré-tratamento não atendidas ou amostras perdidas.

EGFR

testes de mutação foi realizada em 44 pacientes, o teste foi pela seleção clínica per padrão de cuidado no momento. Daqueles testados, 17 pacientes tiveram

mutação EGFR, dos quais 11 (65%) tiveram metástases cerebrais, quer na linha de base ou posteriormente.

Associação dos biomarcadores à base de soro com metástase cerebral

dos 104 doentes que tinham pré-tratamento de soro de linha de base recolhido biomarcadores, houve uma distribuição uniforme dos pacientes com metástases cerebrais no início do estudo (n = 26, 25%), em comparação com pacientes que subsequentemente desenvolveram metástases cerebrais (n = 25, 24%) (Tabela 2). Median follow-up entre os sobreviventes nesta coorte foi de 7 anos (variação 3.6-9 anos). O número de pacientes com biomarcadores basais altos vs. normal em relação ao metástases cerebrais são detalhados na Tabela 2.

Para cada biomarcador de soro testado no início do estudo (NSE, Cyfra 21-1, Pro-GRP, SCC-Ag, TIMP1 e HE4), a análise univariada de biomarcadores individuais não deu qualquer associação com a presença de metástase cerebral no início do estudo, portanto, nenhuma outra análise multivariada foi realizada (Tabela 3).

pacientes sem metástases cerebrais no início do estudo, não foram observadas diferenças significativas entre pacientes com níveis elevados versus normais de biomarcadores pré-tratamento em relação à incidência de metástases cerebrais subsequentes em todos os pontos do tempo (FIG 1). Houve uma tendência para uma maior incidência cumulativa de metástases cerebrais em pacientes com elevado HE4 linha de base em comparação com aqueles com níveis normais de HE4 mas esta não era estatisticamente significativa (P = 0,07). Nenhuma outra análise multivariada foi realizada desde há fatores foram significativamente associados com a incidência cumulativa de posterior metástase cerebral. As comparações estatísticas de metástases cerebrais subsequentes com base nos níveis Timp1 e SCC-AG não foram possíveis devido a muito poucos pacientes ou eventos (Tabela 2).

Associação de idade e NSCLC histologia com metástases cerebrais

em comparação com doentes com 65 anos ou mais, pacientes com menos de 65 anos tinham significativamente mais metástases cerebrais no início do estudo (36% vs 16%; Odds Ratio [oR 3,01], IC 95%: 1,24-7,28, P = 0,01) (Tabela 3). Esta associação permaneceu significativa na análise multivariada ajustando para histologia e

EGFR

estado de mutação (OR 3,00, 95% CI: 1,22-7,34, P = 0,02) (Tabela 4). No entanto, entre os pacientes sem metástases cerebrais basais, não houve diferença significativa entre os grupos etários na incidência de metástases cerebrais subsequentes (P = 0,5) (Figura 2).

No que respeita à histologia, não houve diferenças significativas entre pacientes com adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas histologia em relação à linha de base a presença de metástases cerebrais (OR IC = 0,84, 95%: 0,22-3,30, P = 0,81) (Tabela 3). Em pacientes sem metástases cerebrais no início do estudo, não houve diferença significativa entre os pacientes com adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas histologia em relação à sua incidência cumulativa de metástases cerebrais subsequentes em todos os pontos de tempo (p = 0,51) (Figura 2).

Associação de

EGFR

estado de mutação com câncer de pulmão metástase cerebral

dos 44 pacientes testados para

EGFR

mutação, 17 pacientes foram testados positivos, dos quais 11 (65 %) tinham metástases cerebrais, até ao final do estudo, incluindo 4 na linha de base e, subsequentemente, 7. Em comparação, apenas 11 dos 27 pacientes (41%) apresentaram resultados negativos para

EGFR

mutação tinha metástases cerebrais até o final do estudo, incluindo 5 no início e 6 posteriormente (Tabela 1). O OR associando

EGFR

mutação com metástases cerebrais de linha de base foi de 1,35 (P = 0,69) (Tabela 2). Em pacientes sem metástases cerebrais no momento do diagnóstico de estágio IV NSCLC (n = 35), houve uma tendência de maior incidência cumulativa de metástases cerebrais em pacientes testou positivo para

EGFR

mutação em comparação com os resultados negativos. (P = 0,22) (Figura 2).

Discussão

Nosso estudo não encontrou uma associação significativa entre qualquer um dos 6 biomarcadores séricos de pré-tratamento ea presença de linha de base ou o desenvolvimento posterior do cérebro metástases em pacientes com estágio IV NSCLC. Nosso estudo refutou a hipótese de Jacot

et al

[12] que NSE no soro pode ser um marcador específico para danos neuronais a partir de metástases cerebrais. As diferenças metodológicas podem ter contribuído para as diferenças de conclusões, uma vez que o estudo de Jacot

et al

[12] analisou a sobrevida de pacientes com metástases cerebrais cancro do pulmão, e nosso estudo examinou todos os pacientes com câncer de pulmão metastático para a sua linha de base ou subsequente desenvolvimento de metástases cerebrais. Um estudo mais antigo dos pacientes com cancros do pulmão de células pequenas por Van de Pol

et al [21] também mostrou que, embora os níveis de NSE no soro aumentou com o desenvolvimento de metástases cerebrais metacrônicos, alterações nos níveis de NSE não eram específicos para intracraniana atividade da doença. Enquanto a nossa análise primária publicada [13] fez confirmar a declaração, por Jacot

et al

[12] esse nível NSE pré-tratamento de linha de base foi de prognóstico para a sobrevida global (HR 1.266, P = 0,0298), nosso estudo sugere que NSE sérica não é um biomarcador específico para metástases cerebrais de câncer de pulmão e tais estudos adicionais não devem ser prosseguidos.

Até agora, nenhum biomarcador de soro para metástases cerebrais foi validado em pacientes com NSCLC. Lee et al [22] verificaram que o soro pré-tratamento antigénio carcinoembrionário correlacionada com metástases cerebrais em pacientes com NSCLC. No entanto, um estudo de validação independente terá de levar em conta tempo de metástases cerebrais e de sobrevivência para um biomarcador para ser considerado biologicamente relevantes e clinicamente útil na seleção de pacientes de alto risco para o desenvolvimento posterior de metástases cerebrais para atendimento personalizado.

A observação a partir deste estudo que os pacientes com idade inferior a 65 anos estão significativamente associados com metástases cerebrais no início do estudo é consistente com relatórios publicados anteriormente [11, 23]. Uma grande revisão retrospectiva da base de dados Southwest Oncology Group (SWOG) por Gaspar et al [23] revelou que a idade mais jovem e adenocarcinoma histologia foram associados com o desenvolvimento de metástases cerebrais. Se a idade mais jovem e histologia de adenocarcinoma têm uma propensão biológica maior para o desenvolvimento de metástases cerebrais não podiam ser adequadamente tratados por este estudo dado o pequeno número de pacientes que desenvolveram metástases cerebrais posterior (25 eventos). Quaisquer outras tentativas de investigar a associação da idade e histologia com o desenvolvimento de metástases cerebrais, utilizando conjuntos de dados independentes precisa levar em conta as diferenças na sobrevivência e tempo de seguimento.

Devido ao número limitado de pacientes que haviam sido submetidos

EGFR

mutação no momento deste estudo, não fomos capazes de resolver de forma conclusiva a controvérsia sobre a associação entre o

EGFR

mutação eo desenvolvimento de metástases cerebrais. No entanto, os nossos métodos eram substancialmente diferentes a estudos anteriores, na tentativa de resolver esta questão [4-9]. Muitos estudos anteriores analisaram um conjunto de pacientes com NSCLC e conhecido metástases cerebrais, e olhou para a incidência de

EGFR

mutações dentro deste grupo selecionado sem contabilização para a sobrevivência e tempo para o desenvolvimento de metástases cerebrais [4, 5 , 7]. Enquanto vários relatórios têm encontrado uma maior incidência de metástases cerebrais em pacientes com

EGFR

cancros do pulmão mutantes, que nunca foi mostrado se isto é devido a uma propensão biológica ou simplesmente um resultado da maior sobrevida desses pacientes devido a EGFR terapia-alvo [24-26]. Em nosso estudo, não só têm avaliadas quanto à presença de metástases cerebrais, mas também o tempo para o desenvolvimento de metástases cerebrais em todos os pontos de tempo tomando assim em conta as diferenças na sobrevivência e tempo de seguimento.

Existem várias limitações neste estudo. A análise foi feita viés retrospectivamente que pode ter introduzido. Além disso, o tamanho da amostra foi relativamente pequeno e o número limitado de

EGFR

testes de mutação têm impedido qualquer análise estatística exploratória firme. Atrito devido à perdidas coleções ou amostras perdidas destaca os desafios práticos na concepção de um estudo de biomarcador. Apesar destas limitações e resultados negativos, não houve evidência para sugerir que os biomarcadores de soro testadas podem ser utilizadas clinicamente para prognosticar o desenvolvimento de metástases cerebrais. Embora tenha havido uma tendência para uma associação entre a alta base HE4 e aumento subsequente desenvolvimento de metástases cerebrais (p = 0,07), tal biomarcador não pode ser recomendada para uso clínico, sem validação independente de uma associação altamente significativa. soro dada HE4 foi mostrado recentemente para ser associado com mau prognóstico em pacientes com NSCLC [27], estudos adicionais de validação pode ser justificada.

A força principal deste estudo é nossos métodos para determinar a associação de biomarcadores com cérebro metástases tanto uniformemente no início do estudo e, posteriormente, e respondendo por tempo e sobrevida do paciente. A fim de confirmar a associação entre o

EGFR

mutação ou outros biomarcadores eo desenvolvimento de metástases cerebrais ao longo do tempo, conjuntos de dados independentes podem ser analisados ​​usando os mesmos métodos.

É importante ressaltar que, embora não-invasivos biomarcadores de prognóstico para o desenvolvimento de metástases cerebrais são importantes para melhorar terapias personalizadas dos doentes, tais biomarcadores deve ser mostrado ser altamente sensível e específico, de modo a ser clinicamente útil. Qualquer associação positiva encontrada por análises exploratórias devem ser independentemente validados antes da aplicação clínica [28]. Usando NSE no soro como um exemplo, apesar de relatos anteriores, nosso estudo independente revelou que ele não é um biomarcador específico para metástases cerebrais de câncer de pulmão. Além disso, grandes conjuntos de dados independentes não existem para todos os biomarcadores. Assim, quando o desenvolvimento de novos biomarcadores séricos para metástases cerebrais, a alta magnitude do efeito é essencial para a sua utilidade clínica potencial.

Em conclusão, este estudo biomarcador independentes descobriram que os biomarcadores séricos 6 de pré-tratamento, incluindo NSE não foram associados com a presença de base ou subsequente desenvolvimento de metástases cerebrais em pacientes com câncer de pulmão metastático. Os nossos métodos pode ser aplicada a conjuntos de dados independentes para identificar um grupo de pacientes com uma propensão para o desenvolvimento biológico superior metástases cerebrais, tendo em conta diferença no tempo de seguimento. Essa informação pode ser útil para o estudo de agentes visando o desenvolvimento de metástases cerebrais.

Reconhecimentos

Agradecemos a Michael Franklin, M.S., pela assistência editorial e revisão crítica deste manuscrito. Agradecemos também o IOS Press BV (Holanda) para fornecer permissão para usar porções previamente publicados da secção de Materiais e Métodos da nossa publicação anterior da seguinte maneira: Lou E, Johnson M, Sima C, Gonzales-Espinoza R, Fleisher M, Kris MG, Azzoli CG, biomarcadores séricos para avaliar a histologia e os resultados em pacientes com cancro do pulmão metastático. Cancer Biomark. 2014; 14 (4): 207-14, com a permissão do IOS Press

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