Abstract

O câncer de pâncreas é uma doença agressiva com prognóstico sombrio. É de suma importância para compreender os mecanismos etiológicos subjacentes e identificar romance, consistente e fácil de aplicar fatores prognósticos para a terapia de precisão. TUSC3 (supressor tumoral candidato 3) foi identificado como um potencial gene supressor tumoral e estudo anterior mostrou TUSC3 é diminuída no cancro pancreático ao nível de ARNm, mas a sua função supressora de tumores putativo continua a ser verificada. Neste estudo, a expressão TUSC3 foi encontrado para ser suprimida tanto a nível de ARNm e de proteína em modelos de linhas celulares, bem como em amostras clínicas; diminuição da expressão TUSC3 foi associado com maior estadiamento TNM patológica e pior prognóstico. Em três pares de linhas celulares com diferente actividade de NF-kB, a expressão TUSC3 foi encontrado para ser inversamente correlacionada com a actividade de NF-kB. TUSC3-silenciados linha de células de câncer pancreático exibiram reforçada potencial de proliferação, migração e invasão. Em um modelo de camundongos implantados ortotópico, TUSC3 células exibiram fenótipo mais agressivo, com mais metástases hepáticas silenciados. Em conclusão, o estudo mostra atuais que diminuíram coloração TUSC3 imunológica é um prognóstico fator de mau sobrevida em pacientes com câncer de pâncreas e diminuição TUSC3 promove células de câncer pancreático proliferação, invasão e metástase. A correlação inversa entre atividade e TUSC3 expressão NF-kB pode sugerir um padrão de regulação da novela para esta molécula

Citation:. Fan X, Zhang X, Shen J, Zhao H, Yu X, Chen Y, et al. (2016) Diminuição TUSC3 Promove cancro do pâncreas Proliferação, invasão e metástase. PLoS ONE 11 (2): e0149028. doi: 10.1371 /journal.pone.0149028

editor: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |

Recebido: 01 de agosto de 2015; Aceito: 26 de janeiro de 2016; Publicação: 12 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Fan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Shanghai Municipal 415 da Comissão de Saúde e Planejamento Familiar (Grant No.201440345 para Xiaoqiang Fan) [https://www.wsjsw.gov.cn/WSJ /]. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma doença agressiva com prognóstico sombrio. É o nono câncer mais comum no mundo, mas ocupa a quarta posição de mortes relacionadas ao câncer [1], com aproximadamente 227.000 pessoas morrer com esta doença a cada ano [2]. A ressecção cirúrgica continua a ser a única opção para a cura. No entanto, a maioria dos pacientes são descobertos em fase posterior por falta de sintomas específicos, perdendo a chance de ressecção curativa. Mesmo aqueles que se submetem a ressecção com intenção curativa geralmente recaída dentro de dois anos [3]. agentes quimioterápicos convencionais e as novas drogas-alvo moleculares ter efeitos modestos sobre o curso da doença [4-6], e melhorar apenas ligeiramente sobrevida livre de doença em um ambiente terapia adjuvante [3, 7]. Estratificação dos pacientes de acordo com o risco de recorrência vai ajudar a maximizar a personalização de intervenção e aumentar a eficácia terapêutica, com efeitos colaterais mínimos. Nos últimos anos, muitos fatores patológicos foram estabelecidos para predizer o prognóstico incluindo o tamanho do tumor, grau tumoral, invasão vascular, metástases em linfonodos e invasão perineural [8]. Sistêmicas marcadores de índice inflamatório e tumorais circulantes, tais como CA 19-9 também foram explorados por seu valor prognóstico [9-12]. Existem também alguns marcadores moleculares que são conhecidos por ser preditivo da eficácia do tratamento e resultados a longo prazo, como Kras [13], EGFR, e Her2 /neu et al [14]. No entanto, eles ainda são insuficientes para pacientes consultoria e terapia individualizada. É de suma importância para compreender os mecanismos que contribuem para a progressão da doença e identificar romance, consistente e fácil de aplicar fatores prognósticos para a terapia de precisão.

TUSC3 (tumor supressor candidato 3), foi identificado como um potencial gene supressor tumoral anteriormente. Ele está localizado na banda cromossômica 8p22, que é frequentemente suprimida em vários tipos de tumores, incluindo próstata [15] e câncer pancreático [16-18]. Portanto, TUSC3 é suposto ser um gene supressor de tumor. É um homólogo de levedura da subunidade do complexo Ost3p oligossacariltransferase (OST), um complexo de proteína da membrana integral, que catalisa a glicosilação ligada em N de proteínas no retículo endoplasmático (ER) [19, 20]. Mais tarde, TUSC3 também foi encontrado para ser envolvido no transporte de magnésio e actividade de oxidoredutase de [21]. Como N-glicosilação é uma modificação pós-tradução de proteínas eucarióticas ubíqua, modulando o dobramento de proteínas, protegendo-os de degradação, e regular a sua função, bem como a sua imunogenicidade, diminuiu TUSC3 é suposto estar implicada na patogénese do cancro através de glicosilação [22]. Krainer e seus colegas testaram expressão TUSC3 em 143 doentes da próstata utilizando um tissue microarray, e constatou que 13,3% das amostras de tecidos demonstrou nitidamente reduzida expressão da proteína de TUSC3, mas o acompanhamento da coorte não conseguiu mostrar a influência TUSC3 na progressão-livre ou geral sobrevivência [23]. No ovário, TUSC3 também foi encontrado para ser significativamente regulada em amostras de cancro do ovário de grau mais elevado [24]. Estudos posteriores mostraram seus baixos resultados de expressão de TUSC3 hipermetilação do promotor e do estado de metilação do promotor TUSC3 tem uma influência significativa e independente sobre a sobrevida livre e global de progressão para os doentes com cancro do ovário [25]. Já em 2005, a deleção homozigótica e heterozigotos do gene TUSC3 foi descoberto em linhas celulares de cancro do pâncreas e amostras com estudos baseados em array genômico [16]. No entanto, a sua função supressora de tumores putativo continua a ser caracterizado por esta doença. O que também continua a ser esclarecida é se a sua expressão está associada com o estadiamento clínico-patológico e se ele carrega um valor prognóstico para esta entidade câncer.

O nosso objectivo é explorar se a expressão TUSC3 está associada com cancro do pâncreas características clínico-patológicas e representa um factor de prognóstico para esta doença cancerosa e adicionalmente caracterizar a função da molécula na patogénese da doença por meio de modelos de linhas celulares e num modelo de ratinho

Materiais e.; Métodos

Pacientes Amostras

espécimes incluídos em parafina de 117 pacientes com câncer de pâncreas (PC) que foram submetidos à ressecção cirúrgica entre janeiro de 2002 e dezembro de 2012 em nosso hospital foram recuperados. Amostras de 69 homens e 48 mulheres, com idade média de 60,2 anos (variando de 42 a 71 anos; idade média de 61 anos) foram encontrados. O acompanhamento médio foi de 19 meses (variação de 1 a 69 meses.) O estudo conformado com as diretrizes éticas de 1975 Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo comitê de ética da Jimin Hospital, Shanghai, China. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento informado deste estudo.

Imunohistoquímica

5m secções de tecido de espessura foram desparafinados por aquecimento a 60 ° C e, posteriormente, re-hidratadas em xileno e álcoois graduados. A recuperação de antígenos foi realizada com solução de recuperação de epítopo DEPP-9, seguido de tratamento com

2 em PBS (pH 7,4) para extinguir a actividade da peroxidase de 0,3% H

2O endógena. Após bloqueio com soro de hospedeiro anticorpo secundário 10% durante 10 minutos, os cortes foram incubados em anticorpo primário (soro policlonal de coelho para TUSC3, diluição 1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 1 hora à temperatura ambiente. diluições de anticorpo primário foram feitas em soro de hospedeiro anticorpo secundário 10%. As secções, depois 2 x lavagens com PBS, foram incubadas em respectivos anticorpos secundários biotinilados [biotinilado anti-IgG de coelho (BA-10000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA], diluída de 1: 200 em 10% de soro durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por 45 minutos de incubação em StreptABComplex /HRP (K0377 da Dako, Glostrup, Dinamarca). As secções foram novamente lavadas duas vezes com PBS e incubaram-se em Dako líquido DAB + sistema de substrato-cromogénio (K3468) até o desenvolvimento da cor castanha. Isto foi seguido por contracoloração com hematoxilina, desidratação de Meyer, e de montagem, utilizando meio Eukitt. ​​

Cada lâmina foi manchado em cortes seriados e examinados por 2 patologistas. A intensidade da coloração foi pontuada como se segue: 0, negativo; 1+, coloração fraca; 2+, coloração moderada; 3+, coloração forte. Para a análise semi-quantitativa, H-score [26] foi usado neste estudo. Resumidamente, mais do que 500 células tumorais foram contadas em cada caso, e o H-score foi subsequentemente gerado adicionando os valores de percentagens de coloração forte, multiplicado por três percentagem mais de coloração moderada multiplicado por dois percentagem mais de coloração fraca multiplicado por 1. , dando uma possível gama de 0-300. H-score mais de 100 foi observado como alta expressão. Também examinamos expressão TUSC3 na metástases em linfonodos (LN) em 24 casos e comparou as diferenças de expressão TUSC3 entre a lesão primária e metástases em linfonodos. Ki-67 foi marcado na forma de percentagem, isto é, o índice de marcação, independentemente da intensidade da imunocoloração.

as condições de cultura celular

Quinze linhagens de células PC humanas e uma linha de células epiteliais imortalizadas pancreático não-tumorigénico ( HPNE) foram escolhidos para este estudo. Todas as linhas celulares foram obtidos como presentes de laboratório do Dr. Paul J. Chiao no MD Anderson, da Universidade do Texas. ASPC-1, AsPC-1 mu [27], MDA pan28, MDA p28 mu [28], BxPC-3, Colo357, L3.6pl, MiaPaCa-2, PANC-1, PTAC43, PTAC50, PTAC53, PTAC66, e Capan -1 As células foram cultivadas como uma cultura de células em monocamada em meio DMEM contendo 4,5 mg /ml de D-glucose e L-glutamina, suplementado com soro fetal bovino a 10%. HPNE células foram crescidas em Meio D, com uma mistura de M3 e meio DMEM contendo um volume de meio de cultura M3 Base de F (Incell Corp., San Antonio, EUA), três volumes de DMEM isento de glucose, 10% de FBS, 5,5 mM de glucose , 10 ng /ml de EGF, e 50 mg /ml de gentamicina. A linha celular 293T foi cultivada em DMEM completo. HPNE /Kras /p16shRNA e HPDE /Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA eram linhas celulares de cancro do pâncreas (um presente do laboratório do Dr. Paul J. Chiao, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center) por transfecção de plasmídeo relevante para HPNE e celular HPDE respectivamente [29]. Kras /células HPDE /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA foram cultivadas em meio livre de soro de queratinócitos.

proliferação celular e Ensaio clonogénico

Para o ensaio de curva de crescimento celular, as células foram colocadas em placas em 24 poços placas (1 × 10

4 células /poço) em triplicado em meio de crescimento. As células foram contadas no dia 1, 3, e 5. Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média de três experiências independentes. Para testar a clonogenecity das células PC TUSC3 silenciados, tripano exclusão de azul testados TUSC3 knockdown linhas de células viáveis ​​e as células de controlo foram plaqueadas precipitação (100 /poço) numa placa de seis poços e incubadas, em seguida, durante cerca de 10-12 dias a 37 ° C C em 5% de CO

2/5% de ó

2/90% N

2 incubadora. As colónias foram coradas com violeta de cristal a 2%. Um campo de representante para cada experimento foi fotografado em 100 vezes. Pelo menos três ensaios independentes foram realizados em triplicado. Os dados foram apresentados como o valor médio do número de colónias /por campo ± o erro padrão da média de três experiências independentes.

-PCR em tempo real

O ARN total foi extraído das células pela aplicação de TRIzol de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). qualidade e quantidade de ARN foi medida por um espectrofotómetro de ND-2000 (Nanodrop). O ADNc foi sintetizado utilizando o PrimeScript Master Mix RT (Bio-Rad). ADNc (20 ng) foi submetido a PCR em tempo real realizado com reagentes SYBR utilizando o sistema de PCR IQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA). β-actina foi utilizado como o gene de controlo interno. primers específicos foram sintetizados por Sigma-Aldrich e as sequências foram descritos como segue: hTUSC3: iniciador directo: 1275-AGACGGATAATTTGCCTAGTGGG-1297, primer inverso: 1417-AGTGCCATGGTCCAAATCACA-1397. A trama compara o nível de expressão relativa de ARNm em várias linhas celulares de tumor pancreático em comparação com o HPNE celular imortalizada não tumorigénico pancreático epitelial. Cada experimento foi realizado três vezes e cada vez com três repetições.

transdução de Lentivirus

Knockdown de TUSC3 na linha de células de câncer pancreático Colo357 foi realizada mediante a entrega lentiviral usando vector Plko.1 contendo TUSC3 shRNA ( SKU: SR305331, OriGene Technologies, CO EUA), e HEK293T embalagem linha de células.. As células transduzidas foram seleccionadas e mantidas em meio contendo puromicina (3UG /ml).

Matrigel ensaio

50.000 células foram semeadas em triplicado para uma placa de 24 poços com câmaras de Boyden modificada (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). A câmara baixa continha 10% de meio FCS /cultura como quimioatrativo. As células foram incubadas durante 18 horas, coradas com violeta de cristal e contadas sob um microscópio.

imunotransferência

As células foram lisadas com tampão RIPA suplementado com completas comprimidos do cocktail inibidor da protease (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha ) e PhosSTOP fosfatase Inibidor Tablets Cocktail (Roche Diagnostics). Após incubação durante 10 minutos sobre gelo, os lisados ​​celulares foram clarificados por centrifugação a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C, e a concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford absorvância (Sigma Aldrich). Quantidades iguais de lisados ​​de proteína (40 �) foram separadas por SDS-PAGE, transferidas em membranas de PVDF (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido), incubadas com o anticorpo primário e a peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anticorpos secundários e detectado com aprimorado sistema de detecção de quimiluminescência (Pierce ECL Western Blotting Substrato, Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). foram usados ​​seguintes anticorpos e diluições: p-actina (1: 500, SC-1616, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), TUSC3 (1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, UK).

animais e ortotópico implante de células tumor pancreático

ratos nus

Balb /C foram adquiridos a partir da Área de Produção animal da Cancer Research Cancer Institute Frederick e Desenvolvimento Centro Nacional (Frederick, MD). Os ratos foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos, em instalações aprovadas pela Associação Americana de Acreditação do Laboratório Animal Care e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de Agricultura, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos atuais, e os Institutos Nacionais de Saúde. Os ratinhos foram utilizados em conformidade com as orientações institucionais quando eles tinham 8 a 12 semanas de idade.

Para produzir tumores pancreáticos, TUSC3 silenciados células PC foram colhidas de culturas subconfluentes por uma breve exposição a 0,25% de tripsina e 0,02% de EDTA . A tripsinização foi parada com meio contendo soro fetal bovino a 10%, e as células foram lavadas uma vez em meio isento de soro e ressuspensas em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS). Apenas foram utilizadas as suspensões que consiste em células individuais com maior do que 90% de viabilidade para as injecções. Um milhão de células em suspensão em 50 uL de HBSS foram injectados no pâncreas de ratinhos nus, como descrito anteriormente. Os ratinhos foram mortos após 5 semanas de injecção e autopsiados. O tamanho eo peso das metástases hepáticas foram registrados.

A análise estatística

Todos os cálculos estatísticos foram realizados usando o software Graph Prism 5.0 (San Diego, CA, EUA). regressão de Cox foi realizada com SPSS versão 19.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). A comparação das médias de dados com distribuição normal foi utilizado o teste t de Estudantes caso contrário o teste não paramétrico de Mann-Whitney foi aplicada ou como indicado. Foram considerados estatisticamente significativos valores de p igual ou menor que 0,05. Todos os gráficos de barras são retratados usando médias e desvios-padrão como barras de erro, salvo indicação contrária.

Resultados

expressão TUSC3 em amostras clínicas

Na análise imunohistoquímica, TUSC3 está ausente em estroma de pâncreas células, mas quase todas as células epiteliais do ducto pancreático, células acinares e ilhotas mostrou imuno (Fig 1A e 1C). Avaliou-se a correlação entre os dados de expressão e parâmetros clínicos, incluindo a idade do paciente, sexo, tamanho do tumor, localização, grau, classificação do tumor primário (PT), metástases em linfonodos (PN), metástases à distância (PM). TUSC3 expressão foi observada em vários graus em células de carcinoma pancreático em citoplasma (Fig 1B e 1C). TUSC3 foi detectada em 38/117 (32,48%) pT amostras com H-Score 83,42 ± 2.882, em 14/58 (24,14%) pN amostras com H-Score 66,81 ± 4,265, e em 4/11 (36,36%) espécimes pM com H-score 79,55 ± 7,818. A expressão de TUSC3 é drasticamente diminuída em linfonodos metastáticos em comparação com as amostras de tumor primário emparelhado (H-score: p 0,001). (Figura 1D)

(A) expressão TUSC3 em tecidos pancreáticos não neoplásicas (acinares , duto e ilhotas). (B) a expressão TUSC3 em células de câncer de pâncreas. (C) a expressão Baixa TUSC3 em células de câncer de pâncreas em comparação com ilhotas. (D) Comparação de coloração TUSC3 em PC primário e metástases LN (teste-t emparelhado, p 0,001, n = 58). ampliação original × 200.

Diminuição da expressão TUSC3 está associado a maior estadiamento TNM patológico e mau prognóstico

No geral, 69 do sexo masculino e 48 pacientes do sexo feminino com PC foram incluídos neste estudo de coorte. A média de idade no momento do diagnóstico foi de 64,6 ± 10,3 anos. A sobrevida média foi de 19 meses (intervalo: 3-78 meses). O estágio do tumor é definido como T

1 N

0M

0 em 8 pacientes (6,84%), T

2 N

0M

0 em 20 pacientes (17,09%), T

3N

0M

0 em 24 pacientes (20,51%), T

1 N

1M

0 em 9 pacientes (7,69%), T

2 N

1M

0 em 18 pacientes (15,38%), t

3N

1 milhão

0 em 21 pacientes (17,95%), T

4 N

0M

0 em 2 pacientes (1,71 %), t

4N

1 milhão

0 em 4 pacientes (3,42%), T

2-3N

0M

1 em cada 5 pacientes (4,27%) e T

1-4N

1M

1 em cada 6 pacientes (5,13%). 101 pacientes receberam quimioterapia, incluindo 75 pacientes que receberam quimioterapia adjuvante, e 26 pacientes que receberam quimioterapia paliativa. Para 11 doentes com metástases hepáticas descoberto durante a operação, todas as lesões metastáticas visíveis foram removidos com sucesso.

A relação entre o nível de expressão TUSC3 e características clinicopatológicas de pacientes com PC é mostrado na Tabela 1. A baixa expressão TUSC3 foi associada a maior o tamanho do tumor (p = 0,039), maior nível de CA 19-9 no soro (p = 0,034), permeação mais linfática (p = 0,031) e maior Ki-67 índice de marcação (p 0,001)

Para. investigar se a nível de expressão da proteína TUSC3 e outros fatores clínico-patológicos estão associados com a evolução clínica de pacientes com PC, os modelos de risco proporcional uni e multivariada de Cox para CSS (Cancer específico Survival) e RFS (recorrência sobrevida livre) foram calculados. Entre os 117 pacientes, a morte ocorreu em 62 de 79 (78,5%) pacientes com baixo nível de proteína TUSC3 e em 22 dos 38 (57,9%) pacientes com nível de expressão de proteína de alta TUSC3 (P 0,021). Fig 2A mostra as curvas de Kaplan-Meier para CSS e revela que o baixo nível de TUSC3 é um fator preditivo de mau prognóstico em pacientes de PC (p = 0,0416, teste log-rank). Entre os 117 pacientes, a recidiva ocorreu em 69 de 79 (87,3%) pacientes com baixo nível de proteína TUSC3 e em 24 dos 38 (63,2%) pacientes com nível de expressão de proteína de alta TUSC3 (p 0,0001). Fig 2B mostra as curvas de Kaplan-Meier para a RFS e revela que o baixo nível de TUSC3 é um fator preditivo de maior risco de recorrência em pacientes de PC (p = 0,0043, teste log-rank).

coloração imuno-histoquímica de TUSC3 é associado à sobrevida global (A) e sobrevida livre de recorrência (B) ressecção pós curativa de câncer pancreático

A análise univariada estágio de alta tumor identificada (fase I + II vs III vs IV P 0,001)., nível CA 19-9 sérico elevado (CA 19-9 300IU /ml vs CA199≥00IU /ml, p = 0,034), sem a administração de quimioterapia (quimioterapia contra nenhum tratamento, p = 0,025), e diminuição do nível de expressão TUSC3 (p = 0,015) como mau prognóstico fatores para a RFS neste estudo de coorte. E esses fatores também são preditivos de sobrevida global pobres neste grupo. Sexo, idade ao diagnóstico e grau do tumor não foram significativamente associados com a evolução clínica (Tabela 2).

Para determinar o valor prognóstico independente do TUSC3 para CSS e RFS, uma análise multivariada usando uma Cox proporcional modelo de risco foi realizada. Na análise multivariada, que incluiu a idade, o grau do tumor, estágio do tumor, a administração da quimioterapia, o nível de CA 19-9 no soro e nível de expressão TUSC3, identificamos o estágio do tumor, a administração de quimioterapia, e baixo nível de expressão da proteína TUSC3 como fatores prognósticos independentes para CSS e RFS ( expressão TUSC3 para RFS, p = 0,020; expressão TUSC3 para CSS, p = 0,027, Tabela 2)

expressão TUSC3 é diminuído em linhas celulares de cancro do pâncreas mediados por NF-kB

para caracterizar.

in vitro

função da TUSC3, temos primeiro examinaram a expressão TUSC3 de diferentes linhas celulares de cancro do pâncreas. PCR em tempo real revelou TUSC3 foi diminuída ao nível de ARNm em todas as 11 linhas celulares de tumor pancreático testadas (Figura 3A). Transferência Western revelou que também estava deprimido ao nível da proteína nestas linhas celulares (Fig 3B).

TUSC3 é diminuída em linhas celulares de cancro do pâncreas, tanto a nível do mRNA (A) e o nível de proteína (B).

Para explorar se a expressão TUSC3 está correlacionada com a actividade de NF-kB, foi examinada a expressão TUSC3 tanto ao nível do ARN e o nível da proteína em três pares de linhas celulares de cancro do pâncreas com diferente actividade de NF-kB. AsPC-1 mu é uma célula filha fabricado por Paul J. et al Chiao por transfecção IκBαM (S32,36A) na linha celular de cancro pancreático parental AsPC-1, resultando numa linha de células de tumor com a diminuição da actividade de NF-kB e diminuiu fígado potencial de metástases [27]. Neste par de modelo de células, demonstrou-se que a expressão de TUSC3 AsPC-1 mu é maior do que a de AsPC-1 (Figura 4A), sugerindo que TUSC3 é regulada pela actividade de NF-kB. O mesmo padrão de expressão encontra-se em um outro par de linhas celulares, MDA p28 e p28 mu MDA (Fig 4B). MDA p28 mu é uma linha de células filha também produziu no laboratório do Dr. Paul J. Chiao por transfecção de mu IκBαM (S32, 36A) Iκ em linha de células MDA p28, resultando atenuada atividade NF-kB e suprimidas metástase hepática (dados não publicados). expressão TUSC3 é reforçada no MDA p28 mu comparação com MDA p28. L3.6pl é uma linha de célula filha com muito mais potencial de metástases do fígado a partir de injecções consecutivas de Colo357 parental em ratinhos nus. Foi demonstrado anteriormente que L3.6pl exibe maior actividade de NF-kB do que Colo357 [30]. E interessante, a expressão TUSC3 é maior do que em Colo357 em L3.6pl tanto no nível de ARNm e de proteína (Figura 4C). Todas estas três pares de linhas celulares pareceu mostram o mesmo padrão de expressão em TUSC3 relevância para a actividade de NF-kB que implica que TUSC3 está negativamente correlacionada com a actividade de NF-kB.

(A), AsPC-1 e AsPC -1 mu com deprimida atividade de NF-kB. (B) p28 MDA e MDA p28 mu com deprimida atividade NF-kB. (C) Colo357 e a linha celular L3.6pl filha com melhorada actividade de NF-kB. Para cada figura, gráfico da esquerda representa resultado RT-PCR, gráfico da direita representa Western blot para TUSC3.

Diminuição TUSC3 promove a proliferação celular, migração e invasão

Para estudar a função supressora de tumor de TUSC3, shRNAs foram projetados para knockdown a expressão de TUSC3 em

in vitro

modelo de cancro pancreático. Como uma linha celular parental de uma célula filha altamente metastático com actividades de NF-kB comparáveis, Colo357 foi escolhida para a experiência seguinte. Tanto o ARNm e os níveis de proteína foram detectadas para confirmar a eficiência de silenciamento (Figura 5A e 5B). Investigou-se o efeito de silenciamento TUSC3 sobre a proliferação celular, a formação de colónias, migração e invasão condições. Notavelmente, Após 72 horas de cultura, as células TUSC3 silenciados ganhou uma vantagem de sobrevivência significativa em contraste com controles (Fig 5C e 5D). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011). Mais e maiores colônias formadas por TUSC3 células tumorais silenciados (Fig 5E e 5F). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). Em seguida, com base ensaio de Matrigel foi utilizado para analisar os efeitos de TUSC3 knockdown sobre a migração e a matriz extracelular (ECM) a invasão de células de cancro do pâncreas. Com 10% de FCS como atractivo, TUSC3 silenciados células mostraram aumento da migração e invasão através da membrana inserção em contraste com as células de controlo (FIG 5G, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 precipitação p 0,0001 Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 precipitação p 0,0001; Fig 5H e 5I, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001)). Um ensaio de cicatrização da ferida ainda apoiado nestes resultados, o que mostra o aumento da migração e consequente fecho melhorado da monocamada epitelial das células em condições de soro baixo (5% de FCS), após 18 horas (Fig 5J).

(A, B ) TUSC3 eficaz é batido para baixo nas linhas de células Colo357 representados por (a) RT-PCR e (B) Western blot. (C, D) Proliferação é reforçada com TUSC3 knockdown, conta o número de células são significativamente diferentes em 72 horas (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011) (D). (E, F) Formação de Colónias é reforçada com TSUC3 knockdown (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (G) Teste de Migração (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (H, I) Invasion Test (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (J) teste de cicatrização de feridas mostraram fechamento mais rápido da lacuna na TUSC3 células silenciados. Todos os experimentos foram realizados três vezes com figuras representativas mostrados como acima.

Diminuição TUSC3 promove metástase hepática em ortotópico modelo de camundongos implantados

Para explorar ainda mais o efeito de TUSC3 no PC metástase, que injetado TUSC3 silenciados células tumorais ortotopicamente no pâncreas em ratos pelados e modelos animais estabelecidos. Cinco semanas após a injecção das células Colo357 Colo357 e shRNA2 shRNA3, todos os ratinhos ficaram doentes e foram sacrificados. A partir das imagens que aparentemente pode ver a metástase hepática de TUSC3 silenciados tumor é maior do que o controle de um (Fig 6A). Em seguida, as metástases hepáticas foram ponderados e comparados com t-texto, Colo357 shRNA2 vs Colo357 Scramble (p = 0,0444), Colo357 shRNA3 vs Colo357 Scramble (p = 0,0443). Tomados em conjunto, TUSC3 células exibiram fenótipo mais agressivo com mais metástases no fígado aparecendo depois os ratinhos foram sacrificados silenciados. Foi realizada IHC, bem como RT-PCR para comparar o nível TUSC3 entre o foco primário e as lesões metastáticas a partir das amostras modelo ortotópico injectados. Em comparação com amostras de ratos injectados com linhas celulares TUSC3 mexidos, os de TUSC3 shRNA2 e TUSC3 shRNA3 mostram diminuição dos níveis de TUSC3 tanto expressão com IHC (S1 Fig) ea nível mRNA (S2 Fig).

(A) aspecto macroscópico dos espécimes de fígado ressecados de camundongos injetados com dois grupos de TUSC3 silenciados PC (Colo357 shRNA2 e Colo357 shRNA3) e controle (Colo357 Scramble). Grandes metástases hepáticas são visíveis no grupo Colo357 shRNA2 e Colo357 shRNA3. (B) As metástases hepáticas foram ponderados e comparadas pelo teste t.

Discussão

O estudo atual mostra que a expressão TUSC3 é diminuído em câncer amostras primárias pancreáticas e sua infra-regulação é prognóstico de mau resultado a longo prazo.

In vitro

estudo linha de células e

in vivo

modelo animal fornece evidências diretas sugerindo seu papel da função supressora de tumor na iniciação do câncer de pâncreas e progressão. Além disso, o estudo revela expressão TUSC3 é diminuída com melhorada actividade de NF-kB, indicativo de um novo modelo de regulação para esta molécula.

Embora tenha sido relatado TUSC3 ARNm é diminuída em amostras de cancro de pâncreas em comparação com o não vizinha -cancerous tecido, e perda recorrente de 8p22, que contém gene TUSC3 é encontrado no cancro pancreático [17, 18], nenhum estudo anterior já detectada a expressão de proteína ao nível TUSC3 na doença. Este é, de facto, absolutamente necessário, uma vez que a proteína é o executor real do gene e a informação genética. Neste estudo, não apenas detectado ARNm TUSC3 utilizando linhas de células, mas também detectada a sua expressão em nível de proteína com imuno-histoquímica em amostras clínicas e de Western blotting em linhas celulares. Os resultados são consistentes e confirmou que TUSC3 é dramaticamente deprimido em cancro do pâncreas, tanto em amostras primárias e em linhas de células de tumor, tanto ao nível do mRNA e o nível de proteína. Mais interessante, TUSC3 teve correlação inversa com a actividade de NF-kB, pelo menos, em algumas linhagens de células tumorais pancreáticas e é, em consistência com os diferentes graus de malignidade. IκBαM-transf AsPC-1 mu e MDA p28 mu são menos maligno com atenuada atividade NF-kB, e sua expressão TUSC3 é aumentada. É de salientar que esta relação negativa também é encontrada em um outro par de linhas celulares, para os quais a linha de célula filha foi adquirida através de injecções consecutivas de linha celular parental em ratinhos nus em vez de por manipulação transfecção. Todos estes resultados sugerem expressão TUSC3 pode ser regulada pela actividade de NF-kB, pelo menos em algumas linhas celulares tumorais. Anteriormente, TUSC3 infra-regulação tem sido demonstrada devido ao apagamento homozigotos e heterozigotos no câncer de próstata, a hipermetilação do promotor no cancro do ovário [25]. Embora ele é freqüentemente encontrado para ser apagado no câncer de pâncreas [16-18], nossos resultados sugerem um romance regulação da transcrição para esta molécula nesta entidade câncer. É possível que mecanismos TUSC3 sub-regulação pode variar de acordo com diferentes tipos de tumores. Por exemplo, estudos iniciais mostraram TUSC3 não é hipermetilado no carcinoma colorectal [31], no entanto hipermetilação é o principal mecanismo para TUSC3 infra-regulação no câncer de ovário e até mesmo carrega um valor prognóstico [25]. É também possível que a expressão TUSC3 pode ser regulada por diferentes meios, mesmo no mesmo tipo de tumor dependendo de diferentes pacientes ou linhas celulares. Ele não descarta outro mecanismo possível de regulação, tais como silenciamento micro-RNA mediada.