Abstract

invasão tumoral e metástases representam uma complexa série de eventos moleculares que prenuncia um mau prognóstico. A contribuição de vias inflamatórias que medeiam este processo não é bem compreendido. receptores Nod-like (NLRs) da função da imunidade inata como sensores intracelulares de motivos de agentes patogénicos e moléculas perigo. Propomos um papel de NLRs na vigilância do tumor e em linfócitos infiltrantes de tumor de programação (TIL). Neste estudo, foi examinada a jusante serina /treonina e tirosina-quinase RIP2 em um modelo murino de cancro da bexiga. Em ratinhos C57BL6 RIP2-deficientes, maiores tumores MB49 ortotópicos desenvolvido com incidência mais numerosas e mais elevado de metástases, em comparação com controlos do tipo selvagem. Como tal aumento da infiltração, tumor de CD11b

+ Gr1

oi foram observadas células supressoras derivadas mielóides (MDSCs) com concomitante diminuição nas células T e células NK em animais tumorais RIP2 deficiente rolamento utilizando modelos de tumores ortotópicos e subcutâneas. tumores RIP2 deficiente mostraram epitelial-a-mesenquimal transição reforçada, com expressão elevada de

zeb1

,

zeb2

,

torção

, e

caracol

em o microambiente do tumor. Descobrimos que a ausência de RIP2 desempenha um papel intrínseco na promoção do desenvolvimento de MDSCs granulócitos por um efeito autócrina e parácrina de expressão (G-CSF) granulocytic fator estimulante de colônias. Nossos resultados sugerem que as vias NLR pode ser uma modalidade nova para programar TIL e as metástases tumorais influência

Citation:. Zhang H, Chin AI (2014) Papel do RIP2 em Desenvolvimento de Tumor infiltrantes MDSCs e do cancro de bexiga metástase. PLoS ONE 9 (4): e94793. doi: 10.1371 /journal.pone.0094793

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de novembro de 2013; Aceito: 20 de março de 2014; Publicação: 14 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang, Chin. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Associação Americana of Cancer Research Carreira de Desenvolvimento Award 10-20-14, Broad Stem Cell Research Center Scholars em Translational Medicine Program, Prémio Desenvolvimento PARAR Cancer Research Carreira, Becton Dickinson Biosciences Research Grant (AI Chin) Fundação Perkins. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o contexto do microambiente do tumor imune pode ser preditivo de fase do tumor, a sobrevivência específico do cancro, assim como a resposta à quimioterapia [1] – [3]. Em certas malignidades, a presença de infiltração + linfócitos T

CD8 correlaciona-se com a melhoria dos resultados, ao passo que infiltrado de células B, células CD4

+ linfócitos T, e reguladores negativos, incluindo células derivadas de mielóides supressão (MDSCs) e células T reguladoras ( Tregs) correlacionar negativamente com a sobrevivência [4]. Essas observações ressaltam a importância na definição de caminhos essenciais para a programação da composição dos linfócitos infiltram no tumor (TIL), como a modulação seletiva do microambiente do tumor imune representa uma modalidade terapêutica emergente.

receptores de reconhecimento de padrões, como o Toll- prototypic como receptor família (TLR) e intracelulares motivos de domínio de oligomerização (NOD) -como receptor de ligação de nucleotídeos (NLR) da família reconhecem conservados em patógenos, bem como moléculas endógenas liberadas pelas células danificadas [5]. Activação destas vias de sinalização inicia respostas imune inata e adaptativa, e pode promover a reparação e regeneração tecidual. Nós previamente implicado TLR3 em um modelo murino de vigilância de tumores do cancro da próstata crítico na programação da infiltração de linfócitos T e células NK, com supressão da expansão Treg [6]. No cancro da bexiga, a eficácia da modulação imune é realçado pelo uso de Bacillus Calmette Guerin intravesical, que promove um influxo de macrófagos e neutrófilos, no microambiente tumoral mediada em parte por TLR2 e 4 [7], [8].

-interagindo receptor de proteína 2 (RIP2), uma serina-treonina e tirosina-quinase a jusante e comum para Nod1 e Nod2, activa os factores de transcrição tais como NF-kB e MAP quinases através da sua actividade de quinase, bem como através do recrutamento de E3 ubiquitina ligase [9] – [14]. vias dependentes de RIP2 surgiram como crítico na detecção de patógenos diversos que variam de

Listeria monocytogenes

,

Staphylococcus aureus

, e

Legionella pneumophila

para

Escherichia coli

bem como na mediação de doenças inflamatórias tais como encefalomielite autoimune [15] – [17]. Além disso, polimorfismos de Nod2 têm sido associados com a susceptibilidade a doença de Crohn, enquanto polimorfismos de RIP2 têm sido associados com lúpus eritematoso sistémico [18], [19]. A capacidade de mediar NLRs vigilância de tumores não foi investigada até à data. Aqui, postulamos que RIP2 podem mediar a vigilância câncer de bexiga e explorar o seu papel utilizando um modelo de cancro da bexiga ortotópica e subcutânea murino. Mostramos que com tumor RIP2 deficientes preconceitos ratos diferenciação mielóide para a linhagem MDSC e desempenha um papel intrínseco no desenvolvimento do CD11b

+ Ly6G

+ Ly6C

lo população MDSC granulocytic. Nossos resultados são os primeiros a implicar RIP2 e NLRs na vigilância do tumor e sua importância na programação do microambiente do tumor imunológico. A via NLR pode representar uma oportunidade terapêutica na modulação da imunidade do câncer para evitar a invasão de tumores e metástases.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com a política de Serviço de Saúde Pública no cuidado humano e Uso de Animais de laboratório e Regulamentos Lei USDA protecção animal através de um UCLA Institutional animal Care e do Comitê Use o protocolo nº 2010-023-11C aprovado.

Ratos

RIP2 ratinhos deficientes em retrocruzadas com um /6 fundo C57BL durante 10 gerações foram genotipados como descrito anteriormente [10]. pareados por idade C57BL /6 (Jackson Laboratories) foram utilizados como controlos. Seis a ratinhos fêmea de idade de 8 semanas foram usados ​​para as experiências. Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos de acordo com protocolos do Comitê de Pesquisa Animal UCLA.

cultura celular

MB49 linhas celulares (presente de Tim Ratliff) foram derivadas de carcinomas uroteliais induzido por carcinógenos em C57BL6 ratos e mantida a 37 ° C com 5% de CO

2 em DMEM (Cellgro), suplementado com FBS a 10% (Omega Scientific) e 1% de penicilina e estreptomicina [20].

modelos de tumores

para a implantação do tumor intravesical, ratinhos fêmea foram sedados, cateterizada com um cateter de calibre 24 (BD Biosciences), e instilado com 10 ug de poli-L-lisina (Sigma) em 100 ul durante 30 minutos antes da drenagem e instilação de 2 × 10

6 MB49 células em 100 ul durante 60 minutos, [21], [22]. Os ratinhos foram sacrificados 12 dias após a inoculação do tumor, e a bexiga e órgãos internos foram examinados. Bexiga, pulmões e rins, foram fixados em formalina ou incorporado em OCT para a coloração por H E ou imunofluorescência [23]. metástases pulmonares e renais foram determinados grosseiramente e por microscopia de luz de H E seções em um único corte coronal representativa. Para os desafios tumor subcutâneo, 5 × 10

5 MB49 células foram implantadas subcutaneamente nos flancos de ratinhos com crescimento de tumor monitorizados em dias alternados. Após o sacrifício dos ratinhos 14 dias após a inoculação do tumor, os tumores foram colhidos, pesados ​​e dissociado para análise.

A imuno-histoquímica e imunofluorescência

A imunofluorescência foi realizada em secções de tecido congelado OCT-incorporados. As secções foram bloqueadas com soro de cabra a 10% e 10% de BSA em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, incubou-se com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, depois lavadas e incubadas com anticorpo secundário Al-448 ou Al-466 de cabra anti-rato (Invitrogen ) em 1:800 diluição. A imuno-histoquímica foi realizada em secções de tumores embebidos em parafina e fixados em formalina. Os cortes foram sujeitos a solução desmascaramento antigénio aquecida durante 30 minutos, extinguiu-se em 0,3% de dióxido de hidrogénio em PBS durante 15 minutos, bloqueou-se com soro de cabra a 10% e 10% de BSA em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, em seguida, incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, incubadas com o anticorpo secundário anti-rato de cabra biotinilado a 1:800 diluição durante 30 minutos à temperatura ambiente, e desenvolvidos utilizando o kit ABC (Vector Labs). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina. As secções foram montadas com Vectorshield e analisadas por microscopia de fluorescência ou de luz (Zeiss). Anticorpos incluem CD11b (M1 /70, R D Systems), CD4 (RM4-5, BioLegend), CD8 (53,6-7, R D Systems), CD49b (DX-5, BioLegend), Foxp3 (FJK-16, eBioscience), Ly6G (RB6-BC5, eBioscience), Ly6C (AL-21, BD Biosciences), da e-caderina (MAB7481, R D Systems), N-caderina (H-63, Santa Cruz Biotechnology), e fosfo- IκBα (Ser 32/36, # 9246, Cell Signaling).

array de citocinas

Uma matriz de citocinas inflamatórias comparando soro de tipo selvagem e ratinhos RIP2 deficientes implantados com células MB49 intravesical foi realizada como descrito (ARY006, R D Systems).

análise de citometria de fluxo

suspensões de célula única preparados a partir de baços, dissociado células tumorais ou células diferenciadas da medula óssea foram analisadas por citometria de fluxo. Os anticorpos, incluindo CD4 (RM-4), CD8 (53-67), NK1.1 (PK-136), B220 (RA3-6B2), CD11b (M1 /70), CD45.2 (104), Gr1 (RB6- 8C5), Ly-6G (1A8), e Ly-6C (AL21) foram obtidos da BD Biosciences. A aquisição de dados foi realizada com um FACS LSRII (BD Biosciences) e analisados ​​utilizando FlowJo.

derivadas da medula óssea a diferenciação mielóide

BM células-derivadas foram obtidos por lavagem de fémures e tíbias de ratinhos C57BL /6 do tipo selvagem e RIP2

– /- ratos. Após a lise dos glóbulos vermelhos com tampão ACK, as células restantes foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10% e 20% L929 meio condicionado por células. Após incubação durante 24 horas, as células não aderentes foram colhidas e plaqueadas a 2 x 10

5 células /ml em DMEM suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 10 mM de HEPES, piruvato de sódio 1 mM, 1% de penicilina e estreptomicina, e completada utilizando 20% L929 com 40 ng /ml de G-CSF (BioLegend), 40 ng /mL de GM-CSF (Invitrogen), ou em combinação. As culturas foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 3 dias. No Dia 3, foi adicionado meio fresco com citocinas adequadas. No dia 4 células cultivadas foram colhidas por FACS.

O isolamento de células do sistema imunológico que se infiltram no tumor

O tecido tumoral foi picada em PBS com tesoura estéril para aproximadamente 1 peças mm e digeridas em 0,25% de colagenase IV em DMEM suplementado com FBS a 10% a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 3 horas [24]. As suspensões de células foram filtradas através de um filtro de 70