Abstract
Fundo
A interação de produtos químicos ambientais e seus metabolitos com macromoléculas biológicas podem resultar em efeitos citotóxicos e genotóxicos. 4-Aminobifenilo (4-PAF) e várias outras arilaminas relacionados foram mostrados como tendo relação causal envolvido na indução de cancros humanos da bexiga urinária. Os efeitos genotóxicos e cancerígenos de 4-ABP são exibidas apenas quando é metabolicamente convertido para um eletrófilo reativo, os íons nitrenium ar�icos, que, posteriormente, se liga ao DNA e induzir lesões. Embora vários estudos têm relatado a formação de adutos 4-ABP-DNA, não extenso trabalho tem sido feito para investigar a imunogenicidade de DNA 4-ABP-modificado e seu possível envolvimento na geração de anticorpos em pacientes com câncer de bexiga.
Metodologia /Principais achados
O DNA humano foi modificado por N-hidroxi-4-acetylaminobiphenyl (
N
OH-AABP), um metabólito reativo de 4-ABP. perturbações estruturais
N
-OH-AABP ADN modificada foram avaliadas pela radiação ultravioleta, de fluorescência e espectroscopia de dicróico circular, bem como por electroforese em gel de agarose. Genotoxicidade do
N
OH-AABP modificado DNA foi determinado por ensaio cometa. cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) análise de amostras de ADN nativas e modificadas confirmaram a formação de
N
– (desoxiguanosina-8-il) -4-aminobifenilo (dg-C8-4ABP)
N
OH-AABP danificado DNA. Os anticorpos induzidos contra experimentalmente
N
-OH-AABP-DNA modificado exibiu muito melhor reconhecimento do ADN isolado a partir de pacientes de cancro da bexiga, em comparação com o ADN obtido a partir de indivíduos saudáveis, em ELISA de ligação competitiva.
Conclusões /Significado
Este trabalho mostra partilha epitopo entre o DNA isolado de pacientes com cancro da bexiga e do
N
DNA OH-AABP modificado implicando o papel de 4-ABP metabólitos no DNA danos e antigénico neo-epitopo de geração que pode levar à indução de anticorpos em doentes com cancro da bexiga
citação:. Shahab L, Moinuddin, Ahmad S, K Dixit, Habib S, Alam K, et al. (2013) Genotóxico Efeito da
N
-Hidroxi-4-Acetylaminobiphenyl no DNA humano: implicações no cancro da bexiga. PLoS ONE 8 (1): e53205. doi: 10.1371 /journal.pone.0053205
editor: Rizwan Hasan Khan, Aligarh Muslim University, Índia |
Recebido: 31 Julho, 2012; Aceito: 26 de novembro de 2012; Publicação: 31 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Shahab et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pela ICMR conceder nenhuma. Immuno 18/11/18/2008-ECD-I (que agora está concluída) e os fundos da Universidade (Aligarh Universidade muçulmana). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O DNA de células expostas a um químico cancerígeno quase sempre contém um conjunto de estruturalmente diversos adutos cancerígeno de nucleotídeo [1]. Suspeita-se que misreplication misrepair ou de um subconjunto destes aductos dá origem a mutações, que por sua vez podem ser os precursores genéticos do fenótipo do cancro. Um tal agente cancerígeno se 4-aminobif enilo, uma amina aromática. Estes são capazes de induzir uma variedade de efeitos tóxicos, incluindo o cancro e met-hemoglobinemia [2]. 4-ABP é um contaminante ambiental e ocupacional gerado principalmente da fumaça do cigarro, a combustão de combustíveis fósseis e de indústrias de borracha, carvão, têxteis e impressão [3] – [5]. 4-PAF tem sido demonstrado ser um importante agente etiológico de cancro da bexiga humano, e também um potente agente cancerígeno bexiga em animais experimentais [6], [7]. resíduos 4-ABP foram relatados na hemoglobina e no ADN isolado a partir de bexiga de fumadores [8], [9]; potencialmente implicando 4-ABP na etiologia do cancro da bexiga. A estrutura química da ABP-4 e do seu metabolito fisiológica,
N
-OH-AABP, é colocada como a Figura 1A
electroforese em gel de agarose nativo e
N
. – OH-AABP ADN humano modificado [b]. As amostras de ADN a partir de pistas 2-5 foram tratadas com o aumento da concentração de
N
-OH-AABP. Pista 1: DNA humano nativo; Pista 2: DNA humano nativo com 0,378 mM
N
OH-AABP; Pista 3: DNA humano nativo com 0,757 mM
N
OH-AABP; Pista 4: DNA humano nativo com 1,136 mM
N
OH-AABP; Pista 5: ADN humano nativo com 1.515 mM
N
OH-AABP
Os efeitos genotóxicos e cancerígenos são exibidas quando 4-ABP é metabolicamente convertido para um eletrófilo reativo.. O primeiro passo é
N
-oxida�o de arilaminas e arylacetamides pelo citocromo específico
P
450 (CYP1A2) em tecidos hepáticos [10], seguido de conjugação do
N
função hidroxilo com acetato, sulfato ou glucuronato [11] – [14]. Os derivados eletrofílicos activados de 4-ABP exercem o seu efeito genotóxico através da interação com adutos de DNA formando que têm sido relatados para um papel na carcinogênese da bexiga tanto em animais experimentais [15] – [17] e os seres humanos [18], [19]. adutos de DNA foram também informou sobre a exposição de células da bexiga humanos para
N
OH-ABP,
N
OH-AABP e
N
-OAc-AABP [20 ] – [22]. No entanto, o principal produto de adição (80%) de ADN formado foi identificado como
N
– (Desoxiguanosina-8-il) -4-aminobifenilo (dg-C8-PAF) [19]. Embora os principais lesões do ADN são um resultado da formação covalente aducto, estes metabolitos também provocar lesões oxidativas do ADN produzindo espécies de oxigénio reactivas [23] que, finalmente, geram quebras na cadeia de ADN e modificações de bases, tais como 8-oxo-guanina e produtos relacionados [24] , [25].
O modo de ação de várias substâncias cancerígenas é melhor avaliada por análise de sua genotoxicidade [26]. O presente estudo relata mudanças estruturais no DNA humano por incubação com
N
OH-AABP por 24 h. O ADN modificado foi caracterizado por várias técnicas espectroscópicas, electroforese em gel e estudos de desnaturação térmica. A genotoxicidade do
N
OH-AABP foi verificada através de teste do cometa. Os anticorpos contra a
N
-OH-AABP-ADN foram induzidos em coelhos do sexo feminino e utilizado como uma sonda imunoquímicos para detectar as lesões causadas por metabolitos 4-ABP, no DNA de doentes com cancro da bexiga.
Instrução- Ética
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional JN animal Faculdade de Medicina da AMU, Aligarh, Índia (não permito. 401 /CPCSEA). Amostras de sangue de pacientes e indivíduos saudáveis foram coletados após o consentimento verbal informado.
Materiais e Métodos
N
OH-AABP era de Midwest Research Institute Kansas. O ADN humano da placenta, metilada de albumina de soro bovino (MBSA), brometo de etídio, proteína A-agarose (2,5 ml pré-embaladas coluna), anti-coelho conjugados de fosfatase alcalina IgG, fosfato de p-nitrofenilo, Tween-20, amplificador completa e de Freund; adjuvantes incompletos, Histopaque 1077, baixo ponto de fusão de agarose (IMPA), meio RPMI 1640, Triton-X 100, azul de tripano, e salino tamponado com fosfato (PBS) Ca
2+ e Mg
2+ foram da Sigma Chemical Company , EUA. Poliestireno de microtitulação de fundo plano placas de ELISA foram de Nunc (Dinamarca). Todos os outros produtos químicos e reagentes usados foram de grau analítico mais elevada.
Modificação de ADN de placenta humana
ADN de placenta humana (15 jiM) foi modificada por incubação a 37 ° C durante 24 h com concentrações variáveis (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM e 1,515 mM) de
N
OH-AABP em DMSO. componentes não ligados foram removidos por diálise extensiva contra tampão fosfato de sódio (10 mM, pH 7,4) contendo NaCl 150 mM.
gel de agarose A electroforese
foi observada a mudança no padrão de electroforese de ADN nativo e modificado em 1% de agarose a 30 mA durante 2 horas em tampão TAE (Tris-acetato 40, 2 mM de EDTA, pH 8,0). Os géis foram corados com brometo de etídio e visualizadas sob luz UV.
Isolamento de Linfócitos
amostras de sangue heparinizado (2 ml) de dadores saudáveis e doentes foram diluídas adequadamente em Ca
2+ e Mg
2 + livre PBS. Os linfócitos foram isolados a partir de sangue utilizando Histopaque 1077 e as células foram finalmente suspensas em RPMI 1640.
Avaliação da Viabilidade de linfócitos
Os linfócitos foram verificados quanto à sua viabilidade antes do início e após o final do reacção por meio do teste de exclusão com Trypan Blue [27]. A viabilidade das células foi encontrado para ser maior do que 93%.
Tratamento de Linfócitos
Linfócitos (1 × 10
5 células) foram expostas a diferentes concentrações de N-OH-AABP (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM, 1,515 mM) num volume de reacção total de 1 ml e incubou-se a 37 ° C durante 90 min. Após a incubação, a mistura foi centrifugada a 4000 rpm, o sobrenadante rejeitado e os linfócitos sedimentadas foram ressuspensas em 100 ul de PBS (Ca
2+ e Mg
2+ livre) e adicionalmente processado para o ensaio de cometa.
ensaio Cometa
ensaio Cometa foi realizado de acordo com o protocolo dada em uma publicação anterior de nosso laboratório [28].
análise Físico
a análise de fluorescência foi realizada em Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer. As amostras foram excitadas a 325 nm e perfil de emissão foi registrada na faixa de 500 a 700 nm. dicroísmo circular (CD) As medições de nativo e DNA humano modificado foram registados Jasco J-815 espectropolarímetro na gama de comprimentos de onda 220-400 nm. Todas as verificações foram gravados em um intervalo de 1 nm.
Cromatografia Líquida de Alta
análise
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de ADN nativo e modificado foi realizada em sistema de fluxo biológica Duo, BioRad , (EUA) equipado com detector de comprimento de onda de multi UV-visível. A absorvância foi monitorizada a 245 nm. Resumidamente amostra de ADN de 50 uM foi hidrolisado em HCl 0,1 N (1 ml /mg) de ADN a 100 ° C durante 30 minutos (de modo a libertar as bases) e secou-se sob vácuo. As bases foram dissolvidos em 50 ul de tampão de 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 e filtrou-se através de 0,42 uM Milex, syring filtro descartável antes de carregar em C-18, coluna de fase reversa (Supelco, Descoberta 25 cm x 4,6 mm). O eluente era tampão de ácido cítrico 12,5 mM, acetato de sódio 25 mM, 25 ^ M de etilenodiaminotetraacetato (EDTA), pH 5,2 e um caudal de 1 ml /min foi mantida durante todo.
Programa de Imunização
aleatórios produzido, New Zealand White (NZW) coelhas foram imunizados tal como descrito anteriormente [28], [29]. Resumidamente, os coelhos (n = 4; dois para cada ADN nativos e modificados) foram imunizados por via intramuscular em múltiplos locais com 50 ug de antigénios respectivos complexados com BSA metilado na proporção 1:01 (w /w) e emulsionado com um volume igual de adjuvante de Freund adjuvante.
purificação de Anticorpos
Imunoglobulina G (IgG) foi purificada por afinidade a partir de soros imunes pré-imune e em proteína a-agarose da coluna [30]. A homogeneidade da IgG isolado foi verificada em 7,5% SDS-PAGE.
O isolamento de DNA a partir de sangue humano
amostras de sangue
foram coletadas em frascos de EDTA de diferentes pacientes com câncer de bexiga e indivíduos normais e saudáveis. ADN de linfócitos foi isolada de acordo com as instruções do fabricante. 5 ml de sangue foi adicionada a 500 ul de protease de Qiagen e depois tampão AL (6 ml) foi misturado seguido por agitação vigorosa. A mistura foi incubada a 70 ° C durante 10 min e 5 ml de etanol (98%) foi adicionada à amostra e misturou-se invertendo o tubo e agitação vigorosa. A solução foi cuidadosamente transferida para coluna QIAamp Maxi colocada num tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugado a 1850 x g (3000 rpm) durante 3 min. O filtrado foi descartado e 5 ml de tampão AW2 foi adicionado e novamente centrifugado a 4500 x g (5000 rpm) durante 1 min. Mais uma vez foi adicionado 5 ml de tampão AW2 e centrifugado a 4500 x g (5000 rpm) durante 15 min e o filtrado foi descartado. Em seguida, 600 ul de tampão AE foi vertida directamente para a membrana da coluna, que foi depois incubado durante 5 minutos, e centrifugadas a 4500 x g (5000 rpm) durante 2 min. O eluente foi recarregado para a membrana da coluna, incubou-se durante 5 minutos, e centrifugadas a 4500 x g (5000 rpm) durante 5 min. O eluente contendo o ADN foi seco ao ar e dissolvido em PBS, pH 7,4. A pureza ea concentração de preparação de DNA foi determinado por A
260 e
280 medições A.
ELISA
A ligação específica de anticorpos foi apurado em ensaio de ligação competitiva [31]. A percentagem de inibição foi calculada a partir da fórmula indicada:.
A percentagem de inibição = 1- (A
inibida /A
desinibida) × 100
Resultados e Discussão
o padrão de gel (Figura 1B) mostra um aumento na mobilidade de ADN modificada com o aumento da concentração de
N
-OH-AABP (pistas 2-5). A mobilidade máxima foi observada com 1.515 mM
N
OH-AABP; e qualquer outro aumento na sua concentração resultou na perda completa da estrutura do DNA. O aumento da mobilidade do N-OH-AABP tratada ADN pode ser devido à geração de quebras de cadeia simples que pode resultar na formação de ADN de tamanho pequeno tendo mobilidade mais rápida em comparação com o ADN nativo da pista 1. Uma perda na fluorescência de ADN também foi observada como uma função do aumento da concentração de
N
-OH-AABP. Isto aponta mais uma vez para o danos na estrutura helicoidal do ADN.
A electroforese em gel de uma única célula (SCGE) ou ensaio de cometa é um método muito sensível para a avaliação de danos no ADN. Durante a electroforese o DNA danificado migra do núcleo em direcção ao ânodo, formando uma forma de um “cometa” com uma cabeça (núcleo da célula com ADN intacto) e uma cauda (ADN relaxado e quebrado). Portanto, o ensaio de cometa pode ser usado para testar a genotoxicidade de agentes carcinogénicos em células cultivadas incluindo linfócitos humanos isolados de fresco. Neste estudo utilizamos o cometa-ensaio para analisar os danos ao DNA de linfócitos humanos mediante tratamento
N
OH-AABP. As imagens de cometa, mediante o tratamento de linfócitos com diferentes concentrações de
N
-OH-AABP, são apresentados na Figura 2. Um cometa com uma cauda é indicativo de danos ao DNA em electroforese em gel de célula única. Os nossos resultados claramente estabelecida danos no DNA após tratamento com 1,515 mM de
N
-OH-AABP, como evidente a partir da formação de cauda distinto da cabeça difusa (Figura 2E). Observou-se que com concentrações crescentes de
N
-OH-AABP, o ADN por cento em cauda também aumentou. Na concentração de 0,378 mM de
N
-OH-AABP, 19% do DNA foi encontrado em cauda. No entanto, a 0,757 mM e 1,136 mM de
N
-OH-AABP a percentagem de ADN da cauda aumentou para 27% e 58%, respectivamente. Ele ainda aumentada para 89% em 1.515 mM
N
OH-AABP. Os parâmetros de danos no DNA, ou seja, momento de cauda de oliva (OTM) e comprimento da cauda também foram medidos e considerados de ser aumentada significativamente com 1.515 mM
N
OH-AABP, em comparação com 0,378 mM, 0,757 mM e 1,136 mM
N
OH-AABP. Um aumento marcado no OTM (94%) foi observado nos linfócitos tratados com 1,515 mM de
N
-OH-AABP quando comparado com o controlo não tratados (linfócitos). Além disso, um aumento substancial do comprimento da cauda foi também registado. Verificou-se ser 72% superior ao do controlo não tratado de linfócitos. Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 1.
Todos os linfócitos foram tratadas durante 24 horas a 37 ° C.
Numa publicação anterior, observou-se 62% de hipercromicidade a 260 nm no espectro de absorção UV de
N
-OH-AABP modificado DNA humano [32]. A hipercromicidade observada representa a exposição dos grupos cromóforos como um resultado da geração de quebras da cadeia e de dissociação de ligações de hidrogénio no caso de ADN modificado.
Nem ADN nativo nem a sua forma modificada de fluorescência tem a sua própria e, portanto, um fluoróforo extrínseca , brometo de etídio, foi utilizado para a espectroscopia de fluorescência de ADN e a sua
N
forma OH-AABP-modificado. Nativo e
N
-OH-AABP modificado ADN foram incubados com brometo de etídio durante 30 min e o perfil de emissão foi registada usando comprimento de onda de excitação (325 nm) de brometo de etídio (Figura 3A). Uma redução de 43,17% na intensidade de fluorescência de ADN modificada, em comparação com a sua forma nativa, significa perturbações na estrutura de ADN de dupla hélice, como um resultado de
N
-OH-AABP modificação.
Os espectros de emissão de fluorescência de ADN nativa humana (—) e DNA humano modificado com 1,515 mM de
N
-OH-AABP (-) [a]. espectros dicróico circular de DNA humano nativo (-) e
N
OH-AABP modificado DNA humano (—-) [b]
As mudanças na estrutura do DNA foram. avaliada por medições de elipticidade. O
N
-OH-AABP ADN modificado exibiu um desvio de 5 nm (275-280 nm) no sinal de CD juntamente com um aumento da elipticidade 5,57-9,27 MDEG (Figura 3B), indicando alterações estruturais em a molécula de ADN. O aumento da elipticidade corresponde a uma perda de 39,9% na estrutura de ADN após modificação. Esta perda estrutural pode ser devido a desempilhar de bases de ADN, como resultado da destabilização da hélice. As perturbações estruturais sugerem desdobramento de DNA, pode ser devido à geração de rupturas dos filamentos individuais.
Figura 4A e 4B mostram cromatogramas de HPLC representativos de amostras de ácido hidrolisado de nativo e
N
-OH- AABP modificado DNA humano, respectivamente. picos bem definidos no tempo de retenção 4,467 min, 7,332 min e 8.727 mínimo foram observadas no DNA humano nativo. No entanto, no caso de ADN modificado estes picos deslocado para 4,631 min, 7,443 min e 9,164 min, respectivamente, sugerindo a modificação das bases de ADN. O pico extra a um tempo de retenção de 22,029 minutos no hidrolisado ácido de ADN modificada é característica de dG-c8-4-PAF aducto, um marcador conhecido para ADN danificado por 4-PAF e
N
-OH- AABP [33]. A identificação da DG-c8-4-ABP aduto está de acordo com os relatórios publicados sobre ADN adutos com arilaminas em animais experimentais [15] – [17]. Similares de ADN adutos foram relatados nas amostras de biópsia de bexiga humana [18], [19].
cromatograma HPLC Representante do hidrolisado ácido de
N
OH-AABP modificado DNA humano [b].
coelhas imunizadas com
N
OH-AABP modificado DNA humano apresentaram resposta humoral vigorosa induzir anticorpos específicos título elevado de imunogénio. Os anticorpos induzidos experimentalmente foram utilizados como uma sonda para detectar imunoquímico
N
-OH-AABP ou arilaminas relacionados com lesões induzidas no ADN genómico de pacientes com cancro da bexiga. O padrão de ligação do DNA isolado de pacientes com câncer de bexiga foi bastante revelador no ensaio de inibição competitiva. A inibição da anti-
OH AABP DNA-IgG N por DNA de linfócitos de pacientes com cancro da bexiga foi gravado na faixa de 60,5% a 77,6%. Enquanto, a inibição causada por ADN de linfócitos de indivíduos saudáveis normais foi bastante baixa (Tabela 2). Significativamente elevado reconhecimento do DNA de linfócitos de pacientes com cancro da bexiga pelos anticorpos induzida experimentalmente contra
N
DNA OH-AABP modificado é um indicador claro de partilha epitopo entre o DNA genômico de pacientes com câncer de bexiga e do DNA humano modificado
in vitro
pelo
N
OH-AABP. Isso leva à conclusão de que
N
OH-AABP ou uma arilamina relacionada, gera neo-epítopos na molécula de DNA que são reconhecidos como ‘
alien’ ou
não auto
pelo sistema imunológico, resultando na geração de auto-anticorpos em pacientes com câncer de bexiga. Significativamente elevado nível de reconhecimento do ADN genómico de pacientes com câncer de bexiga, os anticorpos induzidos experimentalmente contra
N
OH-AABP modificado DNA humano é uma evidência para o envolvimento das bases modificadas e regiões de fita simples na patogênese da doença .
Agradecimentos
os autores agradecem o apoio de infra-estrutura da instalação de DST-FIST do Departamento.