Abstract

Fundo

Os níveis circulantes de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) amplamente foram utilizados como biomarcador para atividade angiogênica no câncer. Para este efeito, foram utilizadas medidas não-padronizados em plasma e soro, sem correção para a liberação de VEGF artificial por plaquetas ativadas

ex vivo

. Nossa hipótese é que “verdadeiros” circulantes (c) os níveis de VEGF, na maioria dos pacientes com câncer são baixos e sem relação com carga câncer ou angiogênese tumoral.

Metodologia

Nós determinamos os níveis de VEGF em PECT, um meio que contém inibidores de ativação plaquetária, no plasma citrato, e em plaquetas isoladas em 16 indivíduos saudáveis, 18 pacientes com câncer de não-renais metastático (não-RCC) e 12 pacientes com carcinoma de células renais (RCC). Em pacientes não-RCC, os níveis circulantes de VEGF no plasma eram baixos e semelhante aos níveis de VEGF nos controles se ativação plaquetária foi minimizada durante o processo de colheita por meio de PECT. No plasma de citrato, os níveis de VEGF foram elevados em pacientes não-RCC, mas esta poderia ser explicada por uma combinação do aumento da activação das plaquetas, durante a colheita de sangue, e por um aumento de duas vezes no teor de VEGF de plaquetas individuais (controlos: 3,4 UI /10

6, non-RCC: 6,2 UI /10

6 plaquetas, p = 0,001). Em contraste, os níveis cVEGF em pacientes com CCR foram elevados (plasma PECT: 64 pg /ml vs. 21 pg /ml, RCC vs. não-RCC, p 0,0001), e não relacionada com a concentração de plaquetas VEGF

conclusões

Nossas descobertas sugerem que “verdadeiros” livremente níveis cVEGF não são elevados na maioria dos pacientes com câncer. Reportados anteriormente elevados níveis de VEGF no plasma no cancro parece ser devido à liberação artificial de plaquetas ativadas, que no câncer têm um maior conteúdo de VEGF, durante o procedimento de colheita de sangue. Apenas em pacientes com CCR, que se caracteriza por excessiva produção de VEGF, devido a um defeito genético específico, foram cVEGF níveis elevados. Esta observação pode ser relacionado com um sucesso limitado e selectiva de agentes anti-VEGF, tal como bevacizumab e sorafenib, como monoterapia no CCR em comparação com outras formas de cancro

citação:. Niers TMH, Richel DJ, Meijers JCM, Schlingemann RO (2011) Fator de Crescimento endotelial Vascular na Circulation em pacientes com câncer não pode ser um biomarcador relevante. PLoS ONE 6 (5): e19873. doi: 10.1371 /journal.pone.0019873

editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 15 Abril de 2010; Aceito: 19 de abril de 2011; Publicado em: 26 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Niers et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

fator de crescimento endotelial

Vascular (VEGF) é a principal. regulador de angiogénese em tumores [1] – [3]. Ele é liberado por células cancerosas, células de hipóxia e plaquetas ativadas e leucócitos [4] – [8]. As células alvo de VEGF são principalmente as células endoteliais vasculares nas quais tenha poderosos efeitos mitogénicos via receptores de elevada afinidade Flt-1 e KDR /[9] do Flk-1, [10]. Como o VEGF é um péptido difusível solúvel secretada por tumores, foram propostos os seus níveis na circulação de modo a reflectir a actividade angiogénica de tumores malignos. Por isso, nos últimos anos, os níveis de VEGF e outros fatores angiogênicos em circulação têm sido amplamente estudados como marcadores substitutos da atividade angiogênica e prognóstico em pacientes com câncer, para a resposta ao tratamento e monitoramento para a detecção de recidiva precoce [11].

para esta finalidade, foram utilizados os níveis de VEGF determinados no soro ou plasma. No entanto, o soro contém níveis elevados de VEGF devido à libertação por plaquetas activadas durante a coagulação [5] – [7]. Portanto, VEGF no soro, que se correlacionam estreitamente com plaquetas de sangue contar [12], não refletem a concentração circulante real de VEGF in vivo. Em citrato ou plasma com EDTA, em que menos de activação de plaquetas e a libertação de VEGF subsequente é esperado que no soro, os níveis de VEGF foram encontrados para ser ainda mais elevados em doentes com cancro do que em controlos e esta foi interpretado como um reflexo de níveis mais elevados de VEGF na circulação e maior atividade angiogênico [13] – [15]. Mas também por esses autores libertação artificial de VEGF a partir de plaquetas, ou comportamento alterado de plaquetas em pacientes com câncer, não foi excluída como uma fonte de aumento dos níveis de VEGF nas amostras de plasma.

O objetivo deste estudo foi investigar a possibilidade de que a libertação de VEGF artificial por meio de plaquetas é a principal fonte de VEGF em amostras de plasma, e que os níveis circulantes de VEGF em pacientes com cancro são baixos e ainda relacionada com cancro ou de carga actividade angiogénica. Para este efeito, determinou-se os níveis plasmáticos de VEGF, com ou sem a inibição da activação de plaquetas, e quantificada libertação de VEGF a partir de plaquetas in vitro, em pessoas de controlo sem cancro, doentes com doentes com carcinoma de células não-renais metastático e pacientes com carcinoma de células renais metastático.

Materiais e Métodos

pacientes e voluntários

Foram obtidos do sangue venoso de 16 voluntários saudáveis ​​(controles) e de 30 pacientes com câncer, separados em dois grupos de pacientes: 18 pacientes com pacientes metastáticos não RCC (non-RCC) e 12 com RCC metastático (RCC). RCC foi caracterizada por uma elevada produção de VEGF intra-tumoral por mutações no gene supressor de tumor de von Hippel-Lindau com consequente actividade ilimitado do factor de hipóxia indutível 1α (HIF1α) causando alta VEGF transcrição [16] – [20].

Nós investigamos os níveis de VEGF no plasma de citrato, plasma PECT e nas plaquetas. As características dos voluntários e pacientes são os seguintes: controles saudáveis ​​(controles) idade média, 53 [48-60]; pacientes com câncer (Non-RCC-grupo); idade média, 62 [57-72]; com cancro do pâncreas (7), cholangio (3), Papilli de Vater (2), o esófago (1), cólon e do recto (2), melanoma (1), do ovário (1), peito (1). RCC (RCC-grupo) idade média, 60 [56-65]; com os seguintes grupos de prognóstico: 5 pobre-risco, risco intermediário 5 e 2 de risco favorável, de acordo com Motzer [21]. Todos os pacientes de câncer tinham doença metastática. Para discriminar entre ativação plaquetária in vivo e artificial na ativação plaquetária in vitro durante a colheita de plasma, β-TG e PF4 foram medidos em todas as amostras. As amostras de sangue utilizados neste estudo foram derivadas de pacientes com CCR incluído no 43-9006 estudo BAYER (aprovado pela Comissão de Ética Médica (METC 05-262), Academic Medical Center, Universidade de Amesterdão), os pacientes não-RCC não incluídos em um estudo específico, e os voluntários. De todos os voluntários e pacientes separar consentimento informado por escrito foi obtido para as determinações de colheita amostra de sangue e de biomarcadores angiogênese.

preparações Plasma

Para efeito de comparação com a coleta de plasma de citrato padrão, utilizamos um método para (no máximo) evitar artificial ex vivo ativação plaquetária pela coleta de sangue sem torniquete e colheita em um meio contendo uma mistura de anticoagulantes à qual prostaglandina e

1 e teofilina foi adicionado (médio PECT). Além disso, utilizou-se uma importante ferramenta para discriminar entre ativação plaquetária in vivo e artificial na ativação plaquetária in vitro, as medições ou seja, de 4 níveis (PF4) β-Tromboglobulina (β-TG) e fator de plaquetas. Collection em PECT plasma e uso concomitante de marcadores de ativação plaquetária deve fornecer uma estimativa precisa dos níveis circulantes de VEGF in vivo.

De cada paciente ou voluntário de sangue venoso foi tirada com uma microperfuser (1 mm de diâmetro, Microflex , Vycon, Ecouen, França) e dividido em diferentes tubos. (polipropileno) tubos de colheita de sangue de plástico foram preenchidos com 400 uL de uma solução contendo: E prostaglandina

1 (94 nM), Na

2CO

3 (0,63 mM), EDTA (90 mM) e theophylin ( 10 mM) (PECT-forma). As amostras de sangue (4 ml) foram recolhidas nestes tubos Pect em um sistema aberto, gota a gota sem o uso de um torniquete para (máximo) evitar a ativação plaquetária ex vivo. O sangue recolhido em tubos Pect foi imediatamente colocado em gelo (em contraste com as amostras de sangue de citrato e EDTA que foram mantidos à temperatura ambiente). PECT plasma empobrecido em plaquetas foi preparado por centrifugação durante 60 min a 1700 g a 4 ° C dentro de 1 hora após a sua recolha.

O sangue também foi recolhido em tubos cheios com citrato e em tubos cheios de EDTA, utilizando um torniquete ( Becton Dickinson VACUTAINERS Systems, Breda, Holanda). As amostras de sangue de citrato foram centrifugadas dentro de 30 minutos durante 15 minutos a 1000 g para obter plasma. sangue com EDTA desenhada do mesmo modo foi utilizado para medir o número total de plaquetas. Para medir o VEGF, PF4 e β-TG dentro das plaquetas, utilizou-se sangue com EDTA, em que as plaquetas foram destruídas por uma combinação de Triton (2% de Triton X-100), ultra-sons durante 15 segundos em gelo (microponta, Branson, amplitude de 50% ) e centrifugação durante 5 minutos a 14,000 rpm numa micro-centrifugadora. PECT plasma empobrecido em plaquetas foi utilizado para medir o VEGF, PF4 e níveis β-TG. plasma de citrato foi utilizado para medir os níveis de VEGF e PF4.

As medições de marcadores de ativação plaquetária e VEGF

concentrações PF4 e β-TG dentro plaquetas são semelhantes e sobre a ativação das plaquetas que são liberados em quantidades semelhantes [22], [23]. Devido folga FP4 a partir de plasma é muito mais rápido do que a p-TG folga (t½ para PF4 é de vários minutos, e para β-TG 100 minutos) [22], [23] um nível normal ou PF4 ligeiramente elevada e alta β-TG nível sugerem na activação de plaquetas in vivo, ao passo que um nível elevado β-TG em combinação com um nível elevado PF4 sugere in vitro (ex vivo) de activação de plaquetas. Todas as amostras foram, por conseguinte, testado para o VEGF, β-TG e PF4 usando disponíveis comercialmente em sanduíche ligados a enzimas ensaios de imunossorvente (ELISA) a partir de Roche (Asserachrom β-TG e Asserachrom PF4; Roche, Mannheim, Alemanha) e R D Systems (Quantikine VEGF ; R . D Systems, Abingdon, UK)

Recuperação de VEGF

Para excluir a possibilidade de que PECT ou médio citrato afeta a medição dos níveis de VEGF por ELISA, concentrações conhecidas de VEGF humano recombinante (padrão fornecido no kit de ensaio) foram adicionados a soro, plasma PECT e amostras de plasma de citrato para produzir as concentrações de VEGF de 250, 62,5, 31,2, 7,8 e 3,9 pg /ml. As amostras foram diluídas com tampão de ensaio e a concentração de VEGF foi determinada por ELISA.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada com o programa de computador SPSS versão 12.0 (SPSS, Gorinchem, Holanda) e com o software GraphPad Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, EUA). VEGF, PF4 e β-TG níveis em voluntários saudáveis ​​e pacientes com câncer foram comparadas pelo teste U de Mann-Whitney (desemparelhados, grupos não-normalmente distribuídos). Os valores são apresentados como mediana e intervalo interquartil [t25-T75].

Resultados

plasma e plaquetas níveis de VEGF

Nos três grupos de pacientes, os níveis de VEGF no plasma citrato ( Figura 1A) foram significativamente maiores do que em PECT plasma (Figura 1B). os níveis de VEGF no plasma de citrato eram significativamente mais elevados em ambos os grupos de doentes de cancro, em comparação com controlos saudáveis, mas no plasma PECT este era apenas o caso de doentes com carcinoma de células renais. O teor de VEGF de plaquetas isoladas, um reservatório bem conhecido para o VEGF, foi duas vezes mais elevada em ambos os grupos de pacientes do cancro do que nos controlos (Tabela 1 e Figura 1C).

a) VEGF-níveis medidos no plasma citrato de pacientes com câncer, em comparação com pessoas saudáveis. B) VEGF-níveis medidos em PECT plasma de pacientes com câncer em comparação com pessoas saudáveis. níveis C) de VEGF medidos em plaquetas de pacientes com câncer em comparação com pessoas saudáveis. As barras representam as medianas.

Em pacientes com CCR, os níveis de VEGF em PECT plasma foram consideravelmente maiores do que em pacientes não-RCC, enquanto que o teor de VEGF plaquetas não foi diferente entre os grupos. os níveis de VEGF no plasma de citrato, plasma PECT, e plaquetas no grupo de pacientes são apresentadas na Tabela 1 e Figura 1. Estas medições não foram afectados pelo tipo de meio utilizado, como recuperação de VEGF foi 100-107% em PECT plasma, 73 % -107% no plasma citrato e 78-100% no soro.

In vitro

plaquetas activação

Devido à sua baixa meia-vida in vivo, PF4 níveis As amostras de sangue são uma medida da activação das plaquetas ex vivo artificial. Em nosso estudo, em ambos os controles saudáveis ​​e pacientes com câncer concentrações PF4 foram 50-100 vezes mais elevados no plasma citrato padrão (coletadas com torniquete) do que em PECT plasma (colhido sem torniquete) (Tabela 2). Isto demonstra que o grau de activação ex vivo das plaquetas artificial é altamente dependente do método de extracção, e que a activação de plaquetas em artificial PECT plasma é baixa e em amostras de plasma de citrato é alta.

Como plaquetária activação está associada com a libertação de VEGF, VEGF Pect níveis de plasma provavelmente reflectem os níveis circulantes de VEGF, ao passo que os níveis aumentados de VEGF no plasma de citrato são na sua maioria causadas por ex vivo de activação de plaquetas. Esta possibilidade é fortemente apoiada pela correlação significativa que observamos entre os níveis PF4 e VEGF em amostras de plasma de citrato individuais (Figura 2).

VEGF e PF4 medida no plasma citrato significativamente correlacionada (r = 0,457, p = 0,008 ).

em PECT plasma, encontramos duas vezes maiores valores PF4 em pacientes com câncer em comparação com controles saudáveis. Isto indica que as plaquetas de doentes com cancro são mais propensos a se tornarem activados. No entanto, um aumento da concentração PF4 em plaquetas individuais de doentes de cancro também podem ter contribuído para o aumento da concentração de FP4 no plasma PECT (Figura 3).

A) β-TG e PF4 PECT medido em plasma de doentes com cancro comparado com os controlos. B) β-TG e PF4 medida em plaquetas de pacientes com câncer em comparação aos controles. As barras representam as medianas.

Um elevado nível β-TG em combinação com um baixo nível de FP4 no plasma PECT é uma indicação da activação de plaquetas in vivo. Não fomos capazes de demonstrar tal na ativação plaquetária vivo em nossos pacientes com câncer, como β-TG em PECT plasma não mostraram um aumento independente do aumento da PF4.

Discussão

O nosso estudo demonstra que “verdadeiras” níveis circulantes de VEGF, tal como determinado por medições em PECT plasma, são baixos na maior parte dos pacientes com cancro metastático e que não diferem significativamente dos níveis circulantes de VEGF nos controlos. Os níveis elevados de VEGF em amostras de plasma de citrato de correlacionar com o PF4, um marcador de activação de plaquetas ex vivo, sugerindo que a libertação de VEGF a partir de plaquetas durante o procedimento de colheita é responsável pelos níveis de VEGF nestas amostras. Além disso, observou-se que as plaquetas individuais em pacientes com câncer têm um conteúdo de duas vezes mais elevada de VEGF em comparação com controles saudáveis. Os nossos resultados mostram que os níveis de VEGF em amostras de sangue são altamente dependentes do método de recolha do conteúdo de plaquetas e o VEGF, e questionar a relevância de ‘circulante’ VEGF como um biomarcador. Nossos resultados não descartam que artificialmente elevados níveis de VEGF em amostras de plasma de citrato, como uma medida combinada de activatibility plaquetas eo conteúdo VEGF de plaquetas, não poderia ser um marcador substituto significativa de certos aspectos da biologia do tumor.

A marcada aumento nos níveis plasmáticos de VEGF tem sido observado em vários tipos de cancro empregando vários métodos de recolha e determinação [11]. Um número de estudos relatou uma correlação entre a contagem de plaquetas e soro de VEGF [24], [25], e os níveis mais elevados de VEGF por soro de plaquetas em doentes com cancro [26], [27]. Isto está de acordo com os nossos achados e a função conhecida de plaquetas como um importante reservatório para o VEGF. VEGF derivado de plaquetas pode ter um papel patológico importante no cancro devido a trombina induz a activação de plaquetas e a libertação local subsequente de VEGF, indução da permeabilidade vascular, activação de células endoteliais e a angiogénese, a promoção da coagulação e disseminação do cancro [4], [28] – [30 ].

no presente estudo, avaliou-se dois métodos diferentes de coleta de plasma para a medição de VEGF em controles saudáveis ​​e pacientes com câncer. O impacto da utilização de um meio de recolha e de torniquete (citrato contra PECT) sobre os níveis de VEGF foi demonstrada em controlos saudáveis ​​e doentes com cancro. Não foram detectadas diferenças significativas nos níveis de VEGF PECT entre controles saudáveis ​​e pacientes com câncer não RCC.

Em pacientes com CCR, os níveis PECT VEGF foram significativamente maiores em comparação aos controles, sugerindo que nesses pacientes VEGF é realmente elevada no circulação. RCC é caracterizada por uma elevada produção de VEGF intra-tumoral por mutações homozigóticas no gene supressor de tumor de von Hippel-Lindau com consequente actividade ilimitado do factor de 1α hipóxia indutível (HIF1α) causando alta VEGF transcrição [20] – [26]. Em muitos destes pacientes, as outras células do corpo são heterozigóticos para a mutação de VHL. Estes aspectos genéticos podem explicar por que pacientes com CCR têm diferentes níveis circulantes de VEGF do que os pacientes não RCC estudados.

Nossos resultados estão em linha com o sucesso seletiva de anti-VEGF abordagens no tratamento da RCC em comparação com outros tipos de cancro [31]. Com efeito, o bevacizumab (Avastin; Genentech, South San Francisco, CA), um anticorpo que se liga a todas as isoformas de cVEGF humano [32] produziu um prolongamento significativo do tempo para a progressão da doença em comparação com placebo em doentes com RCC [33]. Isto em contraste com a maioria dos outros tipos de tumores, em que o bevacizumab é ou não eficaz ou em que a eficácia anti-tumoral significativa apenas quando utilizado em combinação com a quimioterapia, em vez do que em monoterapia (actuando mais como quimioterapia-potenciador) [34]. A explicação simples para a atividade clinicamente relevante do bevacizumab em monoterapia na RCC podem ser os papéis específicos de sinalização hipóxica defeituoso e VEGF superexpressão na patogênese desses tumores.

Foi observado que in vitro a ativação plaquetária durante a coleta procedimento contribui para os níveis de VEGF no plasma de citrato mais elevados. Isto foi demonstrado pela elevada libertação de PF4 de plaquetas em comparação com citrato PECT de plasma, e a correlação positiva significativa entre os níveis de PF4 e VEGF em amostras de plasma de citrato individuais. Os níveis de duas vezes mais altos de PF4 em PECT plasma em doentes com cancro, em comparação com os controlos sugerem que também com o método de recolha óptima alguma activação das plaquetas ainda ocorrer, mas o mais importante esta mostra que as plaquetas em doentes com cancro tornam-se mais facilmente activada de plaquetas a partir de controlos saudáveis .

de acordo com outros estudos que demonstraram que o conteúdo VEGF plaquetas é maior em pacientes com câncer [26], [27], [35]. À luz das nossas descobertas em PECT plasma, isto sugere que a libertação ex vivo do VEGF em plaquetas é alterada em doentes com cancro, devido a tanto um aumento no teor de VEGF de plaquetas, bem como a um activatibility mais elevado de plaquetas em doentes com cancro. Um teor mais elevado de VEGF de plaquetas podem ser originários de aumento da carga na medula óssea ou resultar de uma função de VEGF eliminadora de plaquetas [6], [35], [36]. Tal função de eliminação iria servir para retirar o excesso de VEGF, produzida localmente em tecidos de tumor, a partir da circulação. É notável que, em ambos os grupos de pacientes do aumento do teor de VEGF de plaquetas foi cerca de duas vezes em relação aos controles, apesar dos níveis de VEGF muito mais elevados no plasma PECT de pacientes com CCR. Portanto, se as plaquetas realmente tem uma função de limpeza para VEGF, na RCC esta função de eliminação parece falhar devido à produção excessivamente elevada VEGF, levando a que circula VEGF. Além disso, em contraste com o VEGF circulante livre, o conteúdo de VEGF dentro de plaquetas pode ser um biomarcador potencial interessante significativa para o VEGF e /ou atividade da angiogénese em pacientes com cancro, que necessita de estudos posteriores.

Em conclusão, os níveis de VEGF são livres baixa ou ausente na circulação na maior parte dos pacientes com cancro, com a excepção de carcinoma de células renais, um tipo de cancro com a produção de VEGF excessivo devido a um defeito genético específico. os níveis de citrato de VEGF não reflectem os níveis reais de VEGF que circulam, mas são o resultado de activação de plaquetas ex vivo e libertação subsequente a partir de plaquetas de VEGF, que têm um maior conteúdo de VEGF em doentes com cancro. Elevados níveis de VEGF citrato em pacientes com câncer, que têm sido amplamente utilizadas como um biomarcador da angiogênese do tumor, são causadas por artefatos e comportamento de plaquetas alterada associada com a doença sistêmica.

Reconhecimentos

Estamos em dívida à Sra MA Weijne e Sra WF Kopatz de ajuda e de cooperação; Professor Dr. H. R. Büller pela leitura crítica deste manuscrito antes da apresentação, e para os pacientes e voluntários incluídos no estudo por sua confiança e apoio.