Abstract

Durante as duas últimas décadas, as proteases de superfície celular que pertencem ao tipo II protease transmembranar serina (TTSP) da família surgiram como importante enzimas no degradome mamíferos, desempenhando papéis críticos na biologia epitelial, regulação da homeostase metabólica e câncer. vias respiratórias humanas tripsina protease 5 (HATL5) é um dos poucos membros da família que permanece descaracterizada. Aqui demonstramos que HATL5 é uma protease serina que activa cataliticamente é inibida pela dois inibidores de serina-protease do tipo Kunitz, factor de crescimento de hepatócitos inibidor de activador (HAI) -1 e 2, bem como por SERPINA1. Full-length HATL5 está localizada na superfície celular de células de mamíferos cultivadas tal como demonstrado por microscopia confocal. HATL5 exibe um perfil de expressão de tecido relativamente restrito, com ambos transcrição e proteínas presentes no colo do útero, do esófago, e cavidade oral. A análise imunohistoquímica revelou um padrão de expressão onde HATL5 está localizada na superfície celular de células epiteliais diferenciadas no epitélio escamoso estratificado de todos os três destes tecidos. Curiosamente, HATL5 é significativamente diminuída em carcinomas cervicais, esofágicas, e cabeça e pescoço, em comparação com o tecido normal. Análise de matrizes de tecido de cancro do colo do útero e esôfago demonstraram que as células epiteliais escamosas perdem a expressão da proteína HATL5 mediante transformação maligna

Citation:. Miller GS, Zoratti GL, Murray AS, Bergum C, Tanabe LM, lista K ( 2014) HATL5: uma superfície celular Serina Protease diferencialmente expressos em cancros epiteliais. PLoS ONE 9 (2): e87675. doi: 10.1371 /journal.pone.0087675

editor: Claudia Daniela ANDL, da Universidade Vanderbilt, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Outubro, 2013; Aceito: 28 de dezembro de 2013; Publicação: 03 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Miller et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos start-up de Wayne Escola Estadual de Medicina e Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o tipo II proteases transmembrana serina são divididos em quatro subfamílias filogeneticamente distintas: a tripsina (HAT) vias respiratórias humanas /diferencialmente expressos em gene carcinoma espinocelular (DESC) subfamília, hepsina /transmembrana protease serina (hepsina /TMPRSS) da subfamília, subfamília matriptase, e a subfamília corin. HATL5 pertence à subfamília HAT /DESC juntamente com HAT, DESC1, TMPRSS11A e HAT-like 4 [1] -. HATL5 (HATL-5, como HAT-5) é codificada pelo gene TMPRSS11b localizado dentro de um único agrupamento de genes compreendendo todos os genes HAT /DESC em ambos os ratinhos e seres humanos [4]. Todos os membros da subfamília HAT /DESC são constituída por uma região haste com uma única proteína de ouriço-do-mar o esperma, enteropeptidase, agrina de domínio (MAR), e um domínio de protease de serina C-terminal. Há um extenso corpo de literatura documentando papéis críticos dos membros da hepsina /TMPRSS, matriptase e subfamílias Corin em processos fisiológicos e patológicos. papéis cruciais para estas TTSPs têm sido descritos em diversas áreas, e incluem o desenvolvimento epitelial e homeostase, metabolismo do ferro, audição, a digestão, a regulação da pressão sanguínea, bem como infecção virai, inflamação, e oncogénese [3] [5], [6]. Comparativamente poucos estudos que caracterizam as propriedades bioquímicas do chapéu da subfamília /DESC e /ou a explorar as suas funções fisiológicas têm sido publicados. CHAPÉU foi reportado como tendo actividade fibrinogenolítica, para modular o receptor de uroquinase, e para activar o receptor activado de protease (PAR) 2 [7] [8], [9] [10], [11]. Além disso, pode CHAPÉU uncoat viriões de reovírus para promover a infecção em cultura celular e cliva a glicoproteína de superfície, hemaglutinina (HA), do vírus da gripe [12] [13], [14]. Recentemente, um estudo utilizando a ablação genética de TMPRSS11A e HAT em ratinhos demonstraram que as duas proteases são dispensáveis ​​para o desenvolvimento, a saúde geral, e a sobrevivência a longo prazo, na ausência de desafios externos ou défices genéticas adicionais [15].

neste estudo, foi realizada uma análise de caracterização e expressão bioquímica de HATL5. O ADNc de comprimento completo HATL5 dirige a expressão de uma proteína de 60 kDa N-glicosilada que se localize à superfície da célula de células de mamíferos. O domínio de serina-protease HATL5 purificado activado hidrolisa substratos peptídicos sintéticos, e é inibida por membros de duas famílias de inibidores de serina-protease diferentes: o tipo de Kunitz; HAI-1, HAI-2 e aprotinina, eo membro da família serpin; SERPINA1. HATL5 localização de proteínas é notavelmente semelhante nos três tecidos diferentes analisados: cervix, esófago, e mucosa oral. Assim, HATL5 é detectada principalmente na superfície de células epiteliais no estes epitélio escamoso estratificado. Durante carcinogénese, a expressão da protease da superfície celular é largamente reduzido, e em muitos casos, não detectável nas células de carcinoma escamoso.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

A uso de matrizes de parafina de tecido humano foi aprovado de acordo com as diretrizes institucionais do Estado Wayne University Institutional Review Board Administration (# 2013-43).

clonagem e expressão de Full-length HATL5 humano

ARN esofágica humano foi obtido a partir de Biochain (Newark, CA). A síntese da primeira cadeia de ADNc foi realizada com oligo (dT) utilizando um kit de iniciadores RETROscript de acordo com as instruções do fabricante (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). primers específicos de genes foram projetados para full-length HATL5 humana usando a sequência depositada em

Homo sapiens

transmembrana protease, 11B serina, mRNA, GenBank # BC126195.1. Os iniciadores 5′-GCCACCATGTAC AGGCACGGCATATC-3 ‘GAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3 e 5’-‘ (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) foram utilizados para amplificar o ADNc, utilizando uma alta-fidelidade Platinum®Taq polimerase que foi então inserido pcDNA 3,1 /V5-His TOPO® TA (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) em quadro com um C-terminal HIS-tag e V-5 epitopo. As construções foram verificados por sequenciação (ABI Prism 3730 DNA Analyzer, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). A transfecção de células HEK293 e células COS-7 (ATCC, Manassas, VA) foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). A transfecção foi realizada com o DNA do plasmídeo 4.0 ug de comprimento completo contendo HATL5. As células foram lisadas utilizando um tampão RIPA: NaCl 150 mM, 50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, e cocktail inibidor de protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e clarificados por centrifugação a 12.000 x g a 4 ° C °. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um kit de Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Waltham, MA). As amostras de proteínas foram separadas por SDS-PAGE utilizando géis 4-12% de Bis-Tris NuPAGE (Life Technologies, Grand Island, NY), sob condições redutoras e analisadas por western blotting utilizando um anticorpo monoclonal de rato primária V-5 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) e um anticorpo conjugado com fosfatase alcalina secundário anti-ratinho de cabra (Millipore, Billerica, MA).

clonagem e expressão de Human HATL5 Serina Protease Domain-forma Pro

A humano de proteases serina HATL5 (SP) de domínio foi clonado no plasmídeo pSecTag2a (Life Technologies, Grand Island, NY) para expressão e análise em cultura de células de mamífero. HATL5 sequência do domínio de protease de serina a partir do comprimento total humano HATL5-V5-His plasmídeo foi amplificado por PCR usando os seguintes iniciadores: 5′-CCAAGGATCCATGTTGTGGGAGACAAGTAGCCAAC-3 ‘e 5′-CCAAGCGGCCGCGAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3’. O fragmento de PCR resultante foi clonado no vector pSecTag2a entre os locais BamHI e NotI, utilizando técnicas padrão. A transfecção de células CHO (ATCC, Manassas, VA), extracção da proteína e análise por Western blot foi realizada tal como descrito acima. Um anticorpo anti-myc monoclonal de ratinho (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) foi utilizado para detecção por transferência de Western.

Clonagem e Expressão do HATL5 Activo Serina Protease Domínio

Pichia pastoris

O domínio de protease serina activa HATL5 humano foi produzido em levedura usando um Kit de Pichia Expression (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Para a clonagem no vector pPIC9, HATL5 sequência de serina-protease do pcDNA 3.1 V5 /HIS /TOPO plasmídeo humano-HATL5 foi mutado para remover um local Xhol utilizando o local de mudança rápida Agilent II ™ kit de mutagénese dirigida (Agilent Technologies, Inc. de Santa Clara, CA). Os iniciadores para a mutagénese foram: 5′-gccaggtgtctatactcgggtgacttcttatcgcaattgg-3 ‘e 5′-ccaattgcgataagaagtcacccgagtatagacacctggc-3’. A mutagénese resultou num único ponto de mutação sinónimo, reproduzindo deste modo a sequência de aminoácidos nativa. A seguir à mutagénese, o domínio de protease de serina HATL5 humana foi amplificado e clonado no vector pPIC9 nos locais XhoI e NotI, utilizando os iniciadores 5′-tctctcgagaaaagaattgtgaatggaaaaagctccc-3 ‘e 5′-attcgcggccgctcagagtccagtcttgg-3’. A clonagem resultou em HATL5 serina activada sequência do domínio de protease (Ile-Val-Asn) a ser inserida imediatamente após um local de clivagem por KEX2 Leu-Glu-Lys-Arg codificado pelo vector. A Leu-Glu-Lys-Arg-Ile-Val-Asn é clivada entre Arg e lie pela protease KEX2 de levedura, que é uma protease transmembranar localiza-se no Golgi, render um domínio de serina-protease secretada HATL5 activado. Expressão de matriptase domínio da protease da serina activa no

Pichia pastoris

foi realizada em paralelo, tal como descrito [19]. A transformação foi realizada em TOP-10 de células competentes (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) e pPIC9-HATL5 clones positivos foram isolados e amplificados utilizando técnicas padrão. Para a transformação de

Pichia pastoris

, 40 ug de pPIC9-humano-HATL5, pPIC9-matriptase, pPIC9 vazio vector foi digerido com Sall, e purificado por extracção com fenol-clorofórmio. A electroporação do plasmídeo linearizado para a estirpe de levedura G-S115 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY), foi realizada a 1,5 kV usando 0,2 cm cuvetes (BioRad, Hercules, CA) numa BTX-Transporator Plus (Harvard Apparatus Holliston, MA). A expressão de proteases recombinantes nos meios condicionados a partir de clones de levedura individuais foi analisada por SDS-PAGE e transferência de Western utilizando um anticorpo de coelho anti-TMPRSS11b (Abcam, Cambridge, MA) ou um anticorpo anti-matriptase de coelho (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) . proteínas HATL5 matriptase e foram purificados por cromatografia de permuta aniónica utilizando uma coluna HiTrap Q HP (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) como descrito [16].

cromogénico proteinase Ensaios

Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços num volume total de reacção de 100 uL, utilizando 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,01% de Tween-20, 0,01% de BSA para a diluição de todas as amostras. 5 nM purificado HATL5 ou matriptase de serina-protease de domínio recombinante activa foi incubada a 37 ° C durante 60 min com 100 | iM do péptido sintético G-1720 Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Bachem, Bubendorf, Suíça) no ausência ou presença (inibidor e substrato adicionado concomitantemente) de HAI-1 (60 nM) (R D, Minneapolis, MN), HAI-2 (40 nM) (R D, Minneapolis, MN), aprotinina (2 uM) , leupeptina (20 | iM), benzamidina (2 mM), ou SERPINA1 (60 nM) (todos da Thermo Scientific, Waltham, MA). Alterações da absorvância a 405 nm foram monitorados utilizando um leitor de placas Pro Magellan NanoQuant Infinito M200 (Tecan US, Inc., Morrisville, NC).

A desglicosilação de HATL5

Proteínas em lisados ​​ou meios condicionados preparada tal como indicado acima foram desglicosilada utilizando um Kit de desglicosilação proteína enzimática, de acordo com as instruções do fabricante (Sigma, St. Louis, MO).

a imunocitoquímica

imagiologia da superfície celular foi realizada utilizando células HEK293 ou COS -7 células transfectadas com o comprimento completo HATL5-V5 humano. As células foram semeadas em lamelas revestidas com rato tipo-2 colagénio (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e deixadas aderir e crescer durante 36 h, altura em que, o meio foi removido e as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. HATL5-V5 foi detectada utilizando um anticorpo monoclonal anti-V5 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, Nova Iorque) ou um anticorpo de controlo de isotipo (Sigma, St. Louis, MO) e um AlexaFlour-568-conjugado de cabra anti-ratinho secundário anticorpo (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). A coloração celular foi fotografada por microscopia confocal usando uma Leica TCS SP2 confocal do microscópio (Leica, Buffalo Grove, IL):

Bioinformática Análise

O banco de dados microarray Oncomine (http:. //www.oncomine. org) [17] foi utilizado para realizar uma meta-análise da expressão do humano

TMPRSS11b

em quatro estudos sobre o transcriptoma em carcinomas do colo do útero, esôfago e de cabeça e pescoço, em comparação com os tecidos normais de controle (Tabela S1).

As amostras de tecido e imuno-histoquímica

O “CR802”, “ES482”, e “T271” cervical, esôfago, e matrizes de tecido de cancro orais, incluindo normal ou câncer normal adjacente tecido, foram obtidos a partir de US Biomax, Inc. (Rockville, MD).

matrizes de tecido foram desparafinadas com xileno e hidratadas com soluções de etanol graduadas. A recuperação de antígenos foi realizada utilizando tampão de citrato, pH reduzido (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). As matrizes foram bloqueadas com soro normal de cavalo a 2,5% (Vector Laboratories, Burlingame, CA) em PBS, e imunocoradas durante a noite a 4 ° C com 4 ug /ml de coelho anti-humano TMPRSS11b /HATL5 (Sigma, St. Louis, MO). Como um controlo negativo, IgG de coelho não imune (4 ug /ml) (Millipore, Billerica, MA) foi utilizado. Os anticorpos ligados foram visualizados utilizando conjugado com biotina anti-coelho (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e anticorpos secundários, um kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). O 3,3′-diaminobenzidina foi utilizada como substrato (Sigma, St. Louis, MO) e as matrizes foram contrastadas com hematoxilina. Todas as imagens microscópicas foram adquiridos em um Âmbito A.1 Zeiss usando imagem digital.

Avaliação da coloração intensidades e Análise Estatística

Avaliação da intensidade de coloração de esôfago e amostras de tecido cervical foi realizada por um investigador desconhecem a identidade da amostra. Pontuações foram atribuídas com base na intensidade e grau de coloração epitelial em 20x campos microscópicos usando uma escala arbitrária de zero a três, onde 0 = sem coloração positiva em células epiteliais detectado, 1 = algumas células epiteliais coradas fracamente, 2 = algumas células epiteliais manchado moderadamente ou a maioria das células epiteliais coradas fracamente, 3 = algumas células epiteliais fortemente coradas ou a maioria das células epiteliais coradas moderadamente. Dois-atado análise χ2 foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças na frequência de coloração HATL5 entre os grupos. A significância estatística da diferença de HATL5 intensidade de coloração entre os grupos foi determinada pelo teste de Mann-Whitney U bicaudal.

Resultados

Sequência de Aminoácidos e de domínio Estrutura de HATL5

a análise da sequência de aminoácidos da protease HATL5 humano putativo revelou oito potenciais locais de N-glicosilação; cinco dos quais estão localizados no domínio de serina protease (Fig. 1A e B). O domínio catalítico da HATL5 rato contém os essencial de serina-protease resíduos tríade catalítica, H

225, D

270, S

366, eo substrato de ligação resíduos de bolso, D

360, S

386 e G

388. O motivo SWG no domínio catalítico é conservada em todos os membros do chapéu da subfamília /DESC e está previsto para ser localizada na parte superior da bolsa de ligação ao substrato, o posicionamento da ligação peptídica do substrato com a orientação correcta (S

386WG em HATL5). activação proteolítica de HATL5 está prevista para ocorrer dentro de um motivo (K

184IVNG) na junção da pró e domínios catalíticos. Estes resultados sugerem que o gene da

TMPRSS11b

provável codifica uma protease serina funcional

sequência de ácido (A) Amino de HATL5 humana (UniProtKB /Swiss-Prot: Q86T26.3).. Os resíduos de aminoácidos que codificam o domínio transmembranar estão sublinhadas. A região com homologia com proteínas do esperma ouriço-do-mar, enteropeptidase, domínios (SEA) AGRIN é indicado por uma caixa de linha sólida eo domínio serina-protease tipo tripsina é indicado com uma caixa de linha tracejada. O catalisador resíduos Sua

225 (H), Asp

270 (D), e Sor

366 (S) são indicados por quadrados. Potenciais locais de N-glicosilação são indicados por círculos. O local de clivagem de activação está indicado com uma seta, e os dois resíduos de cisteína previsto para formar uma ponte dissulfureto que liga a região da haste para o domínio de serina-protease após clivagem de activação estão indicados com triângulos. (B) Representação esquemática da arquitectura do domínio previsto de HATL5. TM = domínio transmembranar, MAR = locais de N-glicosilação Mar proteína ouriço do esperma, Enteropeptidase, domínio Agrin, n indica previsto, o local de clivagem de activação está indicado com uma seta, e SS representa a ponte de dissulfureto ligando as domínios de protease SEA e serina [31 ].

HATL5 fica a 60 kDa glicosilada Protein

Para caracterizar a proteína HATL5 codificada pelo gene

TMRSS11b

, o cDNA humano de comprimento total foi gerada por PCR de alta fidelidade utilizando uma biblioteca de ADNc humano esófago. O cDNA foi sequenciado, para confirmar ser idêntica à sequência de ADNc previsto, e foi inserido num plasmídeo de expressão de mamífero que forneceu a proteína expressa com um V5-His epitopo no terminal C (Fig. 2A, em cima). Além disso, um vector de expressão de mamífero contendo o-forma pró do domínio de protease de serina, incluindo 15 aminoácidos a montante do local de activação, e um marcador myc C-terminal foi gerado (Figura 2A, meio), bem como um

Pichia pastoris

vector para a secreção da forma activa clivado do domínio serina-protease (Figura 2A, parte inferior). Após a transfecção do vector de comprimento completo HATL5 em células HEK293, COS-7, ou as células CHO, respectivamente, os lisados ​​celulares foram analisados ​​por SDS-PAGE e Western blot. Em todas as três linhas de células, um produto de proteína de aproximadamente 60 kDa foi detectada (Fig. 2B). Esta massa molecular aparente é significativamente maior do que a massa molecular prevista de 46 kDa, sugerindo que HATL5 está sujeito a modificações pós-translacionais. Para examinar se o HATL5 expressa pode ser modificada pós-translacionalmente por glicosilação, extractos de proteína a partir de células HEK293 transfectadas, células COS-7 ou células CHO foram submetidas a desglicosilação enzimática antes da análise de Western blot. A desglicosilação de HATL5 de comprimento completo levou ao aparecimento de um ~48 espécies kDa que estava presente em extractos de todas as três linhas de células (Fig. 2B). Tomando em consideração que a V5-His acrescenta aproximadamente 5 kDa para a proteína recombinante, a forma desglicosilada de HATL5 de comprimento completo tem uma massa molecular aparente muito perto da massa molecular prevista. Cinco dos oito potenciais locais de N-glicosilação estão localizados no domínio de serina protease. Para determinar se o domínio de protease de serina de HATL5 é glicosilada, a pró-forma de serina-protease secretada por células CHO transfectadas foi tratada com enzimas de desglicosilação e analisados ​​por transferência de Western. Antes de desglicosilação desta forma tinha uma massa molecular aparente de 45 kDa (Fig. 2C, esquerda). A massa molecular prevista da forma segregada de HATL5 é de 30 kDa, incluindo o marcador myc. Após desglicosilação, a redução da massa molecular aparente, a uma forma de 30 kDa, foi observada. Uma observação semelhante foi feita em cima deglycosylation do domínio não marcado clivada HATL5 ativo de serina-protease secretada por transfectadas

Pichia pastoris

(massa molecular prevista = 26 kDa), que resultou em um formulário com uma massa molecular aparente de ~28 kDa ( Fig. 2C, à direita). Tomados em conjunto, esta análise demonstra que HATL5 humano é uma glicoproteína de 60 kDa e que um ou mais dos cinco potenciais

N

-Conectado locais de glicosilação no domínio serina-protease são utilizados.

( a) representação esquemática das três proteínas recombinantes diferentes HATL5 gerados para este estudo. V5-H = V5-His epitopo (B) Os lisados ​​de proteína de célula inteira a partir de células HEK293, COS-7, ou de células CHO que expressam de comprimento completo V5-His HATL5 humana etiquetada. (C) meio condicionado de células CHO expressando domínio serina-protease myc-tagged HATL5 ou meios condicionados a partir de

Pichia pastoris

expressar clivada, foram analisados ​​ativa protease HATL5 serina. (B e C) As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e analisados ​​por transferência de Western utilizando anticorpo anti-V5, anti-myc ou anticorpos anti-HATL5 como indicado. Lanes com extratos de proteínas tratadas com enzimas de desglicosilação antes de SDS-PAGE são indicados (+), e extratos não tratadas (-). As setas pretas indicam a posição das formas glicosiladas de HATL5, e as setas abertas indicam a posição das formas desglicosilada.

HATL5 é um cataliticamente activos Protease

Para investigar a enzimática Propriedades de HATL5, o domínio de serina-protease, incluindo o local de clivagem de activação e 15 aminoácidos adicionais a montante do local de clivagem, foi expressa em células CHO (FIG. 2) do meio. A proteína HATL5 foi segregada para o meio como uma única cadeia de pró-enzima. Uma abordagem semelhante anteriormente empregue para matriptase-3 conduziu a uma proteína segregada capaz de sofrer auto-activação tal como evidenciado por um pequeno aumento na mobilidade electroforética e por a sua actividade proteolítica adquirida [18]. A forma segregada de HATL5 não, no entanto, parecem ter propriedades auto-catalítica uma vez que a incubação sob várias condições diferentes (a composição do tampão, temperatura, e tempo) não deu qualquer desvio de mobilidade detectável ou actividade catalítica (dados não mostrados). A fim de expressar HATL5 e medeiam clivagem proteolítica no sítio de activação, o

Pichia pastoris

sistema de expressão foi empregue utilizando a protease de levedura intracelular, KEX2. A serina-protease KEX2 transmembrana pertencente à pro-proteína da família convertase subtilisina-like com especificidade para a clivagem após aminoácidos básicos emparelhados e está localizada no compartimento de Golgi final. Por clonagem do domínio de protease de serina HATL5 no vector Pic9 com a sequência do domínio de serina-protease activa HATL5 (

185IVNG) imediatamente a seguir ao local de clivagem LGKR KEX2 codificada pelo vector, um local de clivagem de fusão romance foi gerado (Fig. 2, fundo ). A sequência é clivada entre LGKRIVNG Arg (R) e Ile (I) por KEX2, render um domínio de serina-protease HATL5 activa secretada. Expressão de matriptase domínio da protease da serina activa no

Pichia pastoris

foi realizada em paralelo, tal como descrito [19]. A presença de HATL5 serina-protease em meio condicionado a partir de

Pichia pastoris

clones transfectados com o vector Pic9-HATL5 foi confirmada por Western blotting utilizando um anticorpo anti-HATL5 (Fig. 3A, esquerda). Nenhum sinal foi detectado no meio condicionado de clones transfectados com o vector vazio Pic9 ou o vector Pic9-matriptase. Da mesma forma, o anticorpo anti-matriptase detectado o domínio de protease de serina matriptase secretada no meio condicionado de células transfectadas com o vector Pic9-matriptase (Fig. 3A, à direita) e não a partir de clones transfectados com o vector de expressão Pic9-HATL5 ou o vector Pic9 sem inserção de protease. A actividade catalítica de HATL5 e matriptase, respectivamente, foi confirmada utilizando a protease serina substrato cromogénico peptidolytic Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Fig. 3B). O meio condicionado a partir de células transfectadas com vector vazio Pic9 foi incluído como um controlo negativo para assegurar a ausência de interferência proteases de levedura segregadas.

(a) Amostras de meio condicionado a partir de

Pichia pastoris

clones transfectados com qualquer o vector de expressão sem inserção de protease (vector), com HATL5 ADNc de domínio de serina-protease (HATL5 # 1 e # 2) ou domínio matriptase de serina-protease de ADNc foram analisadas por western blotting utilizando um anticorpo anti-HATL5 (painel da esquerda) ou um anti-matriptase anticorpo (painel da direita). Os cargos de HATL5 (ponta de seta aberta) e do domínio serina-protease matriptase (cabeça de seta preta) são indicados. (B) As amostras dos meios condicionados descritos em (A) foram incubadas a 37 ° C durante 60 min com o péptido cromogénico sintético Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA foi gravado (100 uM) e a absorvância a 405 nm (C) 5 nM purificada HATL5 recombinante activa (barras brancas) ou matriptase (barras pretas) de domínio de protease de serina foi incubada a 37 ° C durante 60 min com o péptido cromogénico sintético MeOSuc-Glu-Val-Lys-Met-pNA (100 uM ) na ausência ou na presença (inibidor e substrato adicionado concomitantemente) de HAI-1 (60 nM), HAI-2 (40 nM), aprotinina (2 uM), leupeptina (20 | iM), benzamidina (2 mM), ou SERPINA1 (60 nM). As actividades enzimáticas para cada enzima são descritos em relação à actividade quando não foi adicionado inibidor.

O efeito de vários inibidores de serina-protease sobre a actividade hidrolítica da HATL5 domínio serina-protease purificada em direcção Suc-Ala-Ala- Pro-Arg-pNA também foi analisado, utilizando novamente matriptase como um TTSP referência bem caracterizado (Fig. 3C). HATL5 actividade foi reduzida pelos inibidores de moléculas genéricas de proteases de serina, leupeptina e benzamidina. a inibição completa foi alcançada com o polipéptido globular, inibidor de protease de Kunitz tipo serina, aprotinina (inibidor da tripsina pancreática bovina). O tipo de inibidores de protease de serina de Kunitz macromoleculares, factor de crescimento de hepatócitos inibidor de activador (HAI) -1 e 2, anteriormente têm sido mostrados para inibir vários membros da família, incluindo TTSP matriptase, matriptase-2, HAT, hepsina e TMPRSS13 [20] [21 ], [22] [23] [24] [25] [26] [27]. HAI HAI-1 e-2 inibiu a actividade de HATL5 por 50% e 75%, respectivamente. Além disso, HATL5 foi inibida por um membro da superfamília serpina, SERPINA1 (α

1-1-antitripsina).

HATL5 está localizado na superfície celular de células cultivadas e escamoso estratificado Epitélio

Análise da sequência da proteína HATL5 revelou a presença de um único domínio transmembranar, indicando que a proteína HATL5, semelhante ao previamente caracterizado membros da família TTSP, pode estar localizado na superfície da célula. Para investigar a localização subcelular de HATL5, células HEK293 que expressam o comprimento total da protease marcaram-V5 foram analisados ​​por imunocitoquímica fluorescente. células transfectadas Nonpermeabilized coradas com um anticorpo anti-V5 primário e um anticorpo secundário conjugado com 568 AlexaFluor foram analisadas por microscopia de fluorescência confocal. células HEK293 transfectadas exibido um sinal fluorescente vermelha intensa que foi confinada à membrana do plasma (fig. 4A, painel da esquerda). Quando os anticorpos primários foram substituídos com IgG não-imune, nenhuma coloração detectável foi observada (Fig. 4A, painel da direita). Uma coloração da membrana semelhante foi observado numa experiência paralela utilizando células COS-7 transfectadas células (dados não apresentados).

(A) Micrografias de análise fluorescente confocal que mostram a expressão de superfície celular em exemplos representativos de células HEK293 transientemente transfectadas com um full-length plasmídeo de expressão HATL5-V5 humano. Nonpermeabilized células foram incubadas com um anticorpo anti-V5 (painel da esquerda) ou um anticorpo de controlo não-imune (painel da direita), seguido por incubação com 568 AlexaFluor-anticorpos secundários marcados e coloração de Hoechst para visualizar núcleos (azul; os dois painéis). As células foram visualizadas por microscopia confocal de fluorescência em 543 nm (AlexaFluor 568) e 405 nm, comprimentos de onda de excitação (Hoechst). imagens fundidas obtidas nos dois comprimentos de onda de excitação são mostrados. barras de tamanho são 100 mm. (B) Expressão de HATL5 (painel superior) ou GAPDH (painel inferior) mensagem por análise de RT-PCR de ARNm extraído de órgãos inteiros de rato. (C) Análise imunohistoquímica da expressão HATL5 em tecidos humanos normais. HATL5 proteína foi detectada com um anticorpo de coelho anti-HATL5 em musoca esofágica (C1, D1), mucosa cervical (E), mucosa oral (língua) (F) e na epiglote (parte da laringe supraglótica) (L). Os anticorpos primários foram substituídos com IgG de coelho não imune em secções seriadas de todas as amostras e não foi observada coloração significativa (pontas de setas em C2, D2 e ​​não mostrado). coloração epitelial forte (pontas de seta) é detectada em células epiteliais escamosas, apicais no esófago normal (C1, D1), colo do útero normal (E), e a língua (F) sem coloração significativa no compartimento do mesenquimais (indicado com asteriscos). Em grande ampliação, proteína HATL5 é claramente localizada na superfície celular de células epiteliais apical (cabeça da seta) no D1. No epiglote (L) coloração é observado em células do epitélio escamoso suprabasais além das células apicais. Epi = epitélio normal. Tamanho proíbe a todos os painéis; 50? M.

Para determinar a expressão de HATL5 em tecidos, a análise de RT-PCR foi realizada em ARN total extraído a partir de uma série de tecidos de ratinho adulto (Fig. 4B). Esta análise revelou que HATL5 exibe um perfil de expressão tecido relativamente restrito, com mRNA detectados em 4 dos 19 tecidos analisados: esôfago, colo do útero, língua e testículos. Uma característica comum entre o esôfago, colo do útero, e língua é que os forros das mucosas destes tecidos todos conter epitélio escamoso estratificado. Isto levou-nos a examinar a distribuição e localização celular de proteínas HATL5 nestes tecidos por imuno-histoquímica (IHQ). As secções representativas de esofágico normal, do colo do útero, e cabeça e pescoço (língua e na epiglote) mucosa são mostrados na Figura 4C. Usando secções em série, as lâminas foram sondadas com uma proteína anti-coelho ou HATL5 utilizados como controlos negativos, onde o anticorpo primário foi substituído com IgG de coelho não imune (Fig. 4C e dados não mostrados). Em todos os três tipos de tecidos uma forte coloração epitelial é detectada nas células escamosas apicais sem coloração significativa nas submucosas ou mesenquimais compartimentos. HATL5 proteína está localizada principalmente nas superfícies celulares das células escamosas maiores. Esta localização na superfície celular está de acordo com a distribuição esperada da topologia de membrana prevista da HATL5 ancorado.