Sumário
fibroblastos associados ao câncer (CAF) desempenham um papel crucial na regulação da progressão do câncer, mas o determinante molecular que governa o papel regulador tumor da CAF permanece desconhecida. Usando um modelo de melanoma de ratinho, em que as células de melanoma exógenos foram enxertados sobre a pele de duas linhas de ratinhos, onde a activação genética ou inactivação de Notch1 sinalização especificamente ocorre em fibroblastos do estroma hospedeiro natural, nós demonstramos que a atividade da via de Notch1 poderia determinar o indutor de tumores ou -supressora de tumor no fenótipo CAF. CAF transportando elevada atividade Notch1 significativamente inibiu o crescimento do melanoma e invasão, enquanto aqueles com um Notch1 nula promovido invasão melanoma. Estes resultados identificam a via de Notch1 como um determinante molecular que controla o papel regulador da CAF no crescimento da pele melanoma e invasão, revelando Notch1 sinalização como um potencial alvo terapêutico para melanoma e potencialmente outros tumores sólidos
Citation:. Shao H , Kong R, Ferrari ML, Radtke F, Capobianco AJ, Liu ZJ (2015) Notch1 Pathway atividade determina o papel regulador do câncer-associados fibroblastos em processo de crescimento de melanoma e Invasão. PLoS ONE 10 (11): e0142815. doi: 10.1371 /journal.pone.0142815
editor: Claudia Daniela ANDL, da Universidade Vanderbilt, Estados Unidos
Recebido: 18 Agosto, 2015; Aceito: 27 de outubro de 2015; Publicação: 12 de novembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Shao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award # 09BN-11), Associação do cancro das mulheres e fundos internos da Universidade de Miami a Z .. Liu
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
CAF são fibroblastos estromais que residem dentro e nas imediações da massa tumoral. Eles são provenientes principalmente de fibroblastos quiescentes locais ativados e recrutou circulam células-tronco mesenquimais da medula óssea (MSC) [1,2]. CAF estão envolvidos na regulação da progressão do tumor, recolhendo factores solúveis, matriz extracelular (ECM) [3] e os exossomas [4]. A sua contribuição para neoplasias primárias e secundárias [5,6], bem como tomar parte na resistência aos medicamentos e recorrência do tumor [7,8] fazer CAF alvos potenciais para intervenções terapêuticas no microambiente do tumor (TME). Apesar das evidências extensa apoiando o papel de regulação tumor crucial da CAF, como o papel é determinado permanece um mistério. Nós e outros previamente observado que a atividade da via Notch1 é inversamente correlacionada com a de fibroblastos. atividade da via Notch é baixa em fibroblastos proliferam, enquanto a alta em fibroblastos quiescentes [9]. Perda de
Notch1
em fibroblastos de rato embrionárias (MEF) resultou em taxa de crescimento celular e motilidade mais rápido, enquanto que o crescimento celular retardada activação Notch1 e motilidade dos fibroblastos humanos [9]. Consistentemente, a activação induzida Notch paragem do ciclo celular e apoptose em MEF [10]. Em modelos de xenoenxerto de tumor de ratinho, fibroblastos dérmicos humanos experimentais co-implantado que transportam uma elevada actividade de Notch1 inibiu o crescimento do melanoma e angiogénese [11], demonstrando que a activação de Notch1 confere um fenótipo do tumor-supressor sobre CAF experimental. Estes resultados sugerem um papel crucial para a sinalização Notch no governo função de fibroblastos. No entanto, os fibroblastos examinados nesses estudos anteriores não são reais ou CAF natural. Aqui utilizamos modelos novos de mouse para explorar o papel da Notch1 sinalização para determinar o papel regulador do hospedeiro natural da CAF no crescimento de melanoma e invasão.
Materiais e Métodos
Ratos
Notch1
loxP /loxP
ratos foram descritos [12].
ROSA
LSL-N1IC + /+
(# 008159) e
FSP1
.
Cre
+/- camundongos
(# 012641) foram adquiridos da The Jackson Lab (Bar Harbor, ME). Todos estes ratos têm um fundo C57BL6. O ganho de função Notch1 (GOF
Notch1:.
FSP1
Cre
+/-
;
ROSA
LSL-N1IC + /+
) e perda de função Notch1 (LOF
Notch1:.
FSP1
Cre
+ /-
; + /+) linhas
Notch1
LoxP /LoxP foram gerados pelo cruzamento de
ROSA
LSL-N1IC + /+ Comprar e
Notch1
loxP /loxP + /+
com
FSP1
.
Cre
+/-
ratos, e, posteriormente, cruzando
FSP1
Cre
+/-
;.
ROSA
LSL-N1IC +/-
com
ROSA
LSL-N1IC + /+
ratos e
FSP1
.
Cre
+/-
;
Notch1
loxP /loxP +/- com
Notch1
loxP /loxP + /+
ratos, respectivamente. GOF
ctrl (
FSP1
Cre
– /-
;. ROSA
LSL-N1IC + /+) e LOF
ctrl (
FSP1
Cre
– /-
;. Notch1
LoxP /LoxP + /+ ) ratos foram utilizados como controle. Os murganhos foram mantidos nas instalações animais do DVR, sob condições padrão. Os ratinhos foram anestesiados para todos os procedimentos cirúrgicos por mistura de cetamina /xilazina (100/10 mg /kg, IP), e procedimentos de imagem pela inalação de 3% de gás isoflurano, e sacrificados em câmara de CO2. Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade de Miami aprovado todos os procedimentos com animais.
modelo de pele Rato de melanoma
murino células de melanoma, B16-F10 (ATCC
®, CRL-67345
TM), estavelmente transduzidas com luciferase 2 (Luc2) /lentivírus, foram cultivadas com DMEM completo. Para experiências de enxerto de tumor, 5 x 10
5 células
+ /B16-F10 Luc2 suspensas em 0,1 ml de solução salina foram inoculados (
s
.
c
.
)
na pele dorsal de 6 semanas de idade GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl e 8 semanas de idade LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratos. B-16-F10 são derivadas de rato C57BL6 e pode ser xenoenxertado em ratinhos GOF, LOF e de controlo criados e que tem um fundo C57BL6. Os ratinhos foram sacrificados na semana 3 depois da enxertia. tumores ressecados foram ponderados. crescimento de melanoma foi avaliado com base no peso do tumor e positividade do Ki67 marcador de proliferação celular medido por imunofluorescência em células tumorais, enquanto melanoma invasão local foi avaliada por avaliação histológica de secções de tecido de melanoma ressecado.
Histologia, imunofluorescência (IF) Western Blot
H E e SE foram realizadas como descrito [11]. Anticorpos reconhecem activado Notch1, Hes1, Ki67, Luc (ab8925, ab71559, ab15580, ab81823, Abcam, Cambridge, MA), Hey-1, e FSP1 (GTX42614, GTX89197, GeneTex, Irvine, CA). Os núcleos foram coradas com DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Quantificações são médios ± desvio padrão (SD) de contagens de 5 campo de energia baixa (LPF) por amostra de tumor para a H E coloração e 5 campo de alta potência (HPF) por seção e 5 secções /tumor para a coloração IF. Para Western blot, as amostras de tecido de pele foram homogeneizados num tampão RIPA (50 mM de Tris-Cl, 150 mM de cloreto de sódio a 1,0% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, pH 8,0, EDTA 1 mM e cocktail inibidor de protease ( Roche)). A suspensão de tecido foi girado a 4 ° C durante 30 min. Os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação a 13.000 rpm durante 15 min. A concentração de proteína foi determinada utilizando Pierce
TM Kit BCA Protein Assay (# 23225). Western blot foi realizada tal como descrito [11]. Expressão de N1 mutante
IC (muN1
IC, 59Kd) e supressão de Notch1 na pele do rato foram detectadas por dois anticorpos diferentes anti-Notch1, respectivamente (ab8925 e ab52627, Abcam).
bioluminescência imagens de IVIS
D-luciferina foi injetado intraperitonealmente 15 minutos antes da imagiologia (150 mg /kg). De corpo inteiro de ratos anestesiados foram digitalizados usando IVIS 200B (PerkinElmer, Waltham, MA) com uma captura de 1 minuto, binning médio. sinal de bioluminescência foi quantificada e registada como emissão de luz total dentro da região de interesse (fotões /s).
Lentivírus e transdução de células
Luc2
+ /vetor lentiviral foi construído por inserção
Luc2
cDNA em
pLenti6
(Invitrogene) vector. Produção de lentivírus e transdução de células foram realizadas como descrito [13].
A análise estatística
Os dados foram analisados estatisticamente por meio de Student bicaudal
t
-teste e expressou como a média ± DP. Os valores são consideradas estatisticamente significativas quando
p Art 0,05
Resultados
activação Notch1 na CAF suprime o crescimento do melanoma
A expressão da proteína específica do fibroblasto. -1 (FSP1, também chamado S100A4) é geralmente restrito aos fibroblastos [14,15].
FSP1
.
Cre
ratos foram usados com sucesso para criar alelos nulos em fibroblastos para o tipo TGF receptores II [16], os receptores EP4 [17], e PTEN [18]. Criamos a 1
st par de GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl ratos. GOF
camundongos Notch1 eram viáveis até empregadas em melanoma experimentos de enxerto de pele no prazo de dois meses. Sua aparência corporal e tecido da pele histologia, incluindo derme, onde os fibroblastos da pele residem, principalmente, parecia normal (S1A Fig).
Para examinar o papel da CAF com alta atividade Notch1 na regulação do crescimento melanoma, 5 x 10
5 Luc2 células + /B16-F10 foram inoculados na pele de GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl ratos. Neste modelo, os componentes celulares de todo o estroma tumoral, incluindo CAF, são compostos de células hospedeiras naturais. metástase de tumor foi monitorado por todo o corpo IVIS digitalização na semana 3 inoculações pós tumorais. tumores de pele foram ressecados, pesados e submetidos à análise imuno-histoquímica após a digitalização IVIS.
Se a coloração de secções de pele retratado confinado e expressão elevada de N1
IC em núcleos de FSP1
+ fibroblastos de GOF
camundongos Notch1 em comparação com GOF
ctrl camundongos (Fig 1A), mas não em células musculares pele adjacentes (autofluorescência nomeadamente células musculares apresentou ainda há sinais nucleares eram detectáveis). Da mesma forma, expressão Hey1 foi aumentada em núcleos de FSP1
+ fibroblastos da pele de ratos GOF
Notch1 em relação ao GOF
ctrl ratos (S1B FIG). Além disso, a expressão da proteína N1
IC mutante codificado-transgene (muN1
IC: PEST domínio truncado N1
IC, 59 Kd, (
ROSA
LSL -N1IC + /+
, The Jackson Lab: # 008159)) em pele de ratos GOF
Notch1 foi confirmada por Western blot (Fig 1B). Estes resultados demonstraram expressão específica Cre-mediada eficiente da N1
IC e ativação da via Notch em fibroblastos da pele.
A. Imagens representativas mostram expressão de N1
IC em núcleos (pontas de seta apontada) de FSP1
+ fibroblastos da pele de GOF
Notch1 vs. GOF
ctrl ratos. B. Expressão do transgene codificado-muN1
IC (59 Kd) na pele de GOF
Notch1 ratinhos foi detectada por transferência Western. p-actina foi utilizado como controlo de carga. crescimento C. O melanoma é retardado em GOF
camundongos Notch1 (n = 8 /grupo). Cinco imagens representativas de ressecado tumores /grupo são exibidos. D. substancialmente menos Ki67
+ células tumorais (Luc2
+) por HPF no melanoma de GOF
Notch1 de GOF
ctrl ratos. atividade E. proliferativa das células de melanoma (Ki67
+) é particularmente baixo na área (marcado) adjacente à CAF (FSP1
+) em GOF
Notch1 ratos. Quantificações são contagens de 5 HPF por seção e 5 secções /tumor. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de Student bicaudal
t
-teste e expressos como a média ± SD.
crescimento de melanoma em GOF
camundongos Notch1 foi significativamente retardado em comparação para que, em GOF
ctrl camundongos (Fig 1C). Consistentemente, houve substancialmente menos Ki67
+ células tumorais (Luc2
+) em tecidos de melanoma de GOF
Notch1 do que de GOF
ctrl camundongos (Fig 1D). actividade proliferativa (Ki67 positividade) de células de melanoma foi particularmente fraca quando adjacente a CAF (Figura 1E), sugerindo que a CAF transportando elevada actividade de Notch1 em GOF
ratinhos Notch1 pode libertar factor (es) supressor de tumor. Estes resultados demonstraram que a ativação Notch1 confere um fenótipo tumor-supressor sobre CAF.
activação Notch1 na CAF suprime melanoma invasão
Desde espalhando células de melanoma deve interagir com fibroblastos localizados na derme da pele (e em imediações do melanoma enxertada), fibroblastos pode ter um impacto significativo sobre a divulgação de melanoma. Estudamos ainda mais o efeito da CAF na invasão melanoma e metástase no GOF
Notch1 ratos. Melanoma invasão local foi avaliada por avaliação histológica de secções de tecido de melanoma ressecado. H E coloração de tecidos de melanoma ressecados ilustrado que 83,3% do melanoma tinha invasão local em tecidos da pele adjacentes no GOF
ctrl ratos em comparação com 22,2% no GOF
camundongos Notch1 (Fig 2A). No entanto, digitalização IVIS de todo o corpo e os órgãos colhidos, incluindo o pulmão, fígado, baço, rim e fémur, não deu sinais luminescentes mensuráveis (dados não mostrados), o que sugere que nenhuma metástase distante ocorreu na altura da nossa ensaio. IF revelou que CAF na cápsula do tumor apresentaram atividade proliferativa mais baixo (menos Ki67
+ /FSP1
+ células) em GOF
Notch1 que em GOF
ctrl camundongos (Fig 2B 2C). Estes dados indicam que a CAF em GOF
Notch1 ratos são menos favoráveis à invasão melanoma.
A.
Esquerda
: diminuição da invasão do tumor em GOF
Notch1 comparação com GOF
ctrl ratos.
direita: dois representante H E as imagens das secções de tumor (n = 8 /grupo). linhas tracejadas indicam limites do tumor. As setas apontam para invadir as células tumorais. Percentagem de invasão é baseada nos resultados de H E coloração em campos de baixa potência (LPF) de cada seção tumor. B. Os fibroblastos da cápsula de melanoma têm atividade proliferativa mais baixo (menos Ki67
+ /FSP1
+ células) em GOF
Notch1 que em GOF
ctrl ratos. C. Quantificação de Ki67
+ fibroblastos /HPF na cápsula melanoma de GOF
Notch1 (barra preta) vs. GOF
CTRL (barra branca) camundongos. Os resultados são contagens de 5 HPF por seção e 5 secções /tumor. Os dados foram analisados usando
t
-teste e expressos como a média ± SD.
O Null
Notch1
no CAF não afeta o crescimento do melanoma de Student bicaudal
Para estudar o papel da CAF com nulo Notch1 na regulação do crescimento melanoma e invasão, criamos as
nd par de LOF
Notch1 vs. LOF ratos 2
ctrl. camundongos LOF
Notch1 também eram viáveis ao longo das experiências de enxerto de pele melanoma e sua aparência corporal e tecido da pele histologia apareceu normal (S2A Fig).
N1
IC e Hes1 eram indetectáveis em FSP1
+ fibroblastos da pele de LOF
camundongos Notch1 enquanto ligeiramente detectável na pele de LOF
ctrl camundongos (Fig 3A, S2B Fig). N1
IC também foi indetectável em fibroblastos na cápsula melanoma em LOF
camundongos Notch1 (células de melanoma expressam altos níveis de N1
IC conforme relatado anteriormente [13], que serve como um controlo interno para N1
IC expressão), mas marginalmente detectáveis em LOF
ctrl camundongos (Fig 3B). Estes dados indicam o estado inactivado do Notch1 sinalização causada por
Notch1
eliminação em fibroblastos de LOF
camundongos Notch1 vs. status do nível basal de Notch1 sinalização em fibroblastos de LOF
ctrl ratos. Além disso, a análise de transferência de Western validado supressão bem sucedida de Notch1 em fibroblastos da pele de LOF
Notch1 ratinhos. Expressão de full-length de Notch1 (271Kd) não foi detectada em LOF
camundongos Notch1, embora tenha havido ligeira presença de N1
IC (120 kD) (Fig 3C). Os níveis marginais de N1
IC na pele de LOF
ctrl ratos foram atribuídas à presença de N1
IC em não-fibroblastos em tecido da pele.
A. Indetectável vs. expressão N1
IC marginalmente detectáveis em fibroblastos da pele de LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratos. Pontas de seta apontar para coloração nuclear de N1
IC em fibroblastos. B. Undetectable vs. detectável N1
IC, apontado por pontas de seta em fibroblastos em cápsula de melanoma em LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratos. C. indetectável de comprimento completo da proteína de Notch1 (271Kd) e pequena quantidade de N1
IC (120 Kd, que era provavelmente apresentado em não-f ibroblastos) em tecido de pele de LOF
ratinhos Notch1 foi exibido por análise de transferência de Western . p-actina foi utilizado como controlo de carga. crescimento D. Melanoma é comparável em LOF
Notch1 e LOF
ctrl ratos (n = 8 /grupo). Cinco imagens representativas de tumores /grupo são mostrados. E. Números de Ki67
+ células tumorais são comparáveis em LOF
Notch1 (barra preta) e LOF
CTRL (barra branca) camundongos. Quantificações são contagens de 5 HPF por seção e 5 secções /tumor. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de Student bicaudal
t
-teste e expressos como a média ± SD.
Para investigar o papel da CAF com baixa atividade ou nenhuma Notch1 na regulação progressão do melanoma, 5 x 10
5 células
+ /B16-F10 Luc2 foram inoculados (
s
.
c
.) na pele dorsal de 8 semanas de idade LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratos. Melanoma enxerto de pele e medição do crescimento de tumor, invasão e metástase foram realizados de forma idêntica à descrita acima. Os tamanhos dos enxertos de tumores ressecados a partir LOF
Notch1 são comparáveis aos de LOF
Ctrl ratinhos (Figura 3D). Consistentemente, não houve diferença significativa no número de Ki67
+ células tumorais (Luc2
+) dentro dos tecidos de melanoma (Fig 3E) em LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratos. Estes resultados mostraram que a CAF em LOF
camundongos Notch1 tem pouco efeito sobre o crescimento da pele melanoma.
CAF promove invasão melanoma em LOF
Notch1 ratos
Em contraste, melanoma enxertada tinha aumentado taxas de invasão local em Lof
Notch1 (75%) ratos do que nos LOF
Ctrl (30%) murganhos (Figura 4A) como avaliada por avaliação histológica de secções de tecido de tumor ressecado, indicando que a CAF promover a invasão de melanoma em LOF
camundongos Notch1. Consistentemente, os fibroblastos que cercam o tumor no LOF
camundongos Notch1 apresentaram atividade mais forte (mais Ki67
+ /FSP1
+ células) do que no LOF
ctrl camundongos (Fig 4B), sugerindo que a CAF são mais ativo e pode favorecer a invasão melanoma em LOF
camundongos Notch1. Não surpreendentemente, nenhuma metástase distante era detectável em ambos os grupos de ratinhos (dados não mostrados), uma vez que a incidência de metástases espontâneas de células B16 enxertados é muito baixa no modelo de melanoma murino singeneicos. É tipicamente necessário ressecção do tumor primário em ordem para a formação de metástases distantes que ocorra [19]. Alternativamente, pode ser insuficiente para um curso completo de metástase para ser concluída dentro do prazo (de 3 semanas) de nossas experiências. No geral, nossos resultados demonstram que a supressão da
Notch1
em CAF aumenta seu efeito regulador sobre a invasão melanoma.
A.
Esquerda: Aumento da invasão melanoma em pele de LOF
Notch1 vs. LOF
ctrl ratos (n = 8 /grupo).
direita: dois representante H E as imagens de secções de tumor por grupo são exibidos. linhas tracejadas indicam limites do tumor. As setas apontam para invadir as células tumorais. Percentagem de invasão é baseada nos resultados de H E coloração em LPF de cada seção tumor. B. Null Notch1 CAF que cercam tumores apresentam maior atividade proliferativa como mais Ki67
+ /FSP1
+ células são detectáveis no LOF
Notch1 que em LOF
ctrl ratos. C. Quantificação de Ki67
+ fibroblastos /HPF na cápsula melanoma da LOF
Notch1 (barra preta) vs. LOF
CTRL (barra branca) camundongos. Quantificações são contagens de 5 HPF por seção e 5 secções /tumor. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de Student bicaudal
t
-teste e expressos como a média ± SD.
Discussão
células Alongamento B16-F10 na pele de GOF
camundongos Notch1
Notch1 e LOF oferecer modelos de melanoma murino singeneicos exclusivos para decifrar papel de Notch1 sinalização no governo função de regulação de tumor da CAF no TME em que toda a componentes celulares do estroma tumoral são compostas de células hospedeiras naturais . Nossos resultados definidos Notch1 sinalização como um interruptor molecular controlar a função de regulação de tumor da CAF. Ligando este interruptor molecular ON e OFF podem inversamente conferir propriedades tumor-supressores e promotores de tumor na CAF. Por isso, a sinalização de Notch pode ser manipulado para implementar a terapia dirigida a sinalização de Notch para o melanoma, e potencialmente outros tumores sólidos. Abre-se, assim, um novo caminho para atingir TME por qualquer reprogramação e convertendo CAF de “promotores de tumor” para “supressores de tumor ‘através da activação terapêutico de Notch1 caminho ou explorar directamente Notch mediador a jusante (s), ou seja, WISP1 [11]. Embora existam inúmeras opções para ativação de Notch1 via em CAF, como o uso de terapia genética abordagem ou método de edição genoma novela, CRISPR /Cas9 ou CRISPR /Cpf1, introduzir
N1
IC
, ou aplicando via de Notch composto activador, o qual pode ser identificado através de um método semelhante high-throughput screening [20], a activação de Notch1 sinalização especificamente no CAF, enquanto não aumentando ao mesmo tempo a actividade Notch em células de melanoma, representam um desafio terapêutico, tal como a função biológica da sinalização Notch é dependente do contexto celular [21], e alta actividade Notch é oncogénica ao melanoma [13]. Não está claro como a sinalização Notch é regulados diferencialmente em células CAF e melanoma em um único microambiente. Também fica claro se Notch /ligantes participar na comunicação célula-célula entre as células de fibroblastos-melanoma. Uma vez que uma fracção significativa de CAF no tecido do tumor são derivados a partir de células estaminais mesenquimais (MSC), uma estratégia alternativa é desenvolver terapias à base de células por entrega direccionada de células terapêuticas, ou seja, autólogas fibroblastos derivadas de MSC pré-concebido ‘
ex vivo
‘, quer realizar alta atividade Notch1 utilizando métodos descritos acima ou sobre-expressar WISP1, no tecido tumoral. Os fibroblastos que expressam actividade de alta Notch tendem a sofrer paragem do ciclo celular [9,10]. Este personagem faz MSCD-SF carregando alta atividade Notch mais atraente como células terapêuticas, porque eles não vão expandir irresistivelmente após a sua homing ao tecido do tumor e, eventualmente, são apuradas pelas células imunes. Portanto, eles podem ser repetidamente aplicado aos pacientes para aumentar a eficácia terapêutica.
Ao contrário dos efeitos inibitórios da CAF em GOF
camundongos Notch1 tanto no crescimento melanoma e invasão, CAF no LOF
camundongos Notch1 promover locais invasão, mas não o crescimento da pele de melanoma. O mecanismo para esses efeitos distintos de CAF em GOF
camundongos Notch1 vs. ratos Notch1 LOF
permanece obscuro. Possivelmente, as propriedades de crescimento e invasão de melanoma são reguladas por diferentes fatores solúveis e pistas microambiente criado pela CAF. Supressão de
Notch1
em CAF pode resultar em mudança de um conjunto de fatores solúveis e pistas microambiente, que preferencialmente ou suficientemente afeta invasão melanoma, mas não a propriedade de crescimento. Por outro lado, fatores solúveis e pistas microambiente criado pela CAF, que determinam propriedade crescimento de melanoma, podem não ser exatamente invertida entre GOF
Notch1 e LOF
Notch1 ratos. A via de Notch1 é hiper-activado através da expressão de N1
mutante IC na CAF de GOF
Notch1 ratos, que é diferente do canônica, induzida pelo ligando de activação de Notch1, onde a exclusão de Notch1 pode inversamente espelho. Isto poderia explicar porque CAF no GOF
camundongos crescimento de melanoma retardado Notch1, enquanto CAF no LOF ratos
Notch1 não promover o crescimento do melanoma. Alternativamente, outras isoformas Notch pode compensar a perda de Notch1 na CAF de LOF
camundongos Notch1. Futuros estudos são necessários para analisar os perfis completos de fatores solúveis e pistas microambiente determinados por diferentes CAF (CAF de GOF
camundongos Notch1 vs. CAF de GOF
camundongos Ctrl e CAF de LOF
camundongos Notch1 vs. CAF de LOF
Ctrl ratos).
Outra interessante, descoberta ainda não explicada é as taxas de invasão espontâneas distintas de células B16-F10 enxertadas sobre GOF
Ctrl (83,3%) vs. LOF
Ctrl ( 30%) ratos, possivelmente devido aos diferentes origens genéticas de duas linhagens de camundongos. fibroblastos MSC derivadas destas duas linhagens de camundongos de controle também exibem diferentes fenótipos de regulação tumorais
in vitro
. Fibroblastos de GOF
camundongos Ctrl células de melanoma induzidos para formar esferóides enquanto as da LOF
camundongos Ctrl não (observação não publicada).
Em resumo, descobrimos o caminho Notch1 como um determinante molecular que controla o papel regulador da CAF no crescimento de melanoma e invasão. O nosso estudo evidencia a via de Notch1 como um alvo terapêutico potencial para ser manipulado para reprogramar e converter CAF para actuar como supressores de tumores. Estes achados justificam o estudo futuro para elucidar os mecanismos moleculares para o papel de regulação do tumor determinada-Notch1 na CAF.
Informações de Apoio
S1 Fig.
A, representativas de aparência imagens de GOFNotch1 e GOFCtrl. histologia tecido da pele parece normal, como examinado por H E na semana 6. B, a expressão elevada de Hey1 em fibroblastos da pele de ratos GOFNotch1 em comparação com camundongos GOFCtrl. Pontas de seta apontam para Hey1 nuclear localizada em fibroblastos. Anticorpo reconhece Ei-1 foi comprado de GeneTex (GTX42614)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0142815.s001
(PDF)
S2 Fig.
A, representativas de aparência imagens de LOFNotch1 e LOFCtrl. histologia do tecido da pele parece normal, tal como examinado por H E na semana 6. B, expressão HES1 é indetectável em fibroblastos localizados na cápsula de melanoma em ratinhos LOFNotch1 mas ligeiramente detectável a cápsula de ratinhos LOFCtrl melanoma. Pontas de seta apontam para HES1 nuclear localizada em fibroblastos. Anticorpo reconhece Hes1 foi comprado de Abcam (ab71559)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0142815.s002
(PDF)
Reconhecimentos
Agradecemos ao Dr. Omaida C . Velazquez (Universidade de Miami) para colaborações útil, consultas e discussões.