Abstract

Fundo

Electrotaxis é o movimento de células aderentes vivendo em resposta a uma corrente contínua (DC) do campo elétrico (EF) da força fisiológica. células de câncer de pulmão humanos altamente metastáticas, CL1-5, exibem a migração direcional e orientação sob dcEFs. Para entender a resposta transcricional de células CL1-5 a um dcEF, análise de microarray foi realizada neste estudo.

Metodologia /Principais Achados

Um grande chip de campo elétrico (LEFC) foi projetado, fabricado e utilizado neste estudo. CL1-5 células foram tratadas com a força de EF 0mV /mm (o grupo de controlo) e 300 mV /mm (o grupo tratado com EF) durante duas horas. As vias de sinalização que envolvem os genes que expressavam de forma diferente entre os dois grupos foram reveladas. Mostrou-se que os genes regulados por EF altamente correlacionada com a junção aderente, ARN de telomerase regulação do gene componente, e junção estanque. Alguns genes up-regulamentados, como

ACVR1B

e

CTTN

, e alguns sub-regulada genes tais como

PTEN

, são conhecidos por ser positiva e negativamente correlacionada com a migração de células , respectivamente. As interacções proteína-proteína de aderentes genes regulados por EF-associado junção sugerido que o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) de receptores e receptores de efrina podem participar na detecção de estímulos eléctricos extracelulares. Observou-se ainda que as proteínas da membrana celular codifica uma elevada percentagem de genes regulados significativamente, sugerindo que dcEF pode influenciar diretamente a atividade das proteínas da membrana celular na transdução de sinal.

Conclusões /Significado

Neste estudo , alguns dos genes regulados por EF têm sido relatados como sendo essencial ao passo que outros são novos para electrotaxis. Nosso resultado confirma que a regulação da expressão do gene está envolvida no mecanismo de resposta electrotactic

Citation:. Huang CW, Chen HY, Yen MH, Chen JJW, Jovem TH, Cheng JY (2011) Gene Expression of Human Linha Cell Lung Cancer CL1-5 em resposta a um corrente Eléctrica campo. PLoS ONE 6 (10): e25928. doi: 10.1371 /journal.pone.0025928

editor: Eshel Ben-Jacob, Universidade de Tel Aviv, Israel

Recebido: 16 de fevereiro de 2011; Aceito: 13 de setembro de 2011; Publicação: 05 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é parcialmente financiado pelo Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (https://web1.nsc.gov.tw/) (Contrato nº. 98-2113-M-001-013-MY2 e 100-2113-M-001 -014 -MY3 ). Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Electrotaxis, também conhecido como galvanotaxis, é o movimento de organismos ou células em resposta a um campo eléctrico (EF). EF fisiológico existe extracelularmente, tais como no tratamento de feridas, a pele de embrião, e condutas de [1], [2]. Também podem existir na interface entre tumores e tecidos normais [3], [4]. Vários tipos de células cancerígenas, tais como células de cancro da próstata, células de cancro da mama e células de cancro do pulmão, são conhecidos para migrar direccionalmente sob dcEF, e o grau de electrotaxis destas células cancerosas tem sido demonstrado que se correlacionam com as suas capacidades metastáticos [5] – [8]. Estar electrotaxis célula é diferente de electroforese celular uma vez que esta última requer o destacamento de células cultivadas a partir do substrato em avanço [9]. Além disso, a força FE para a electroforese de células é de cerca de 100 vezes maior do que para electrotaxis [9]. Além disso, demonstrou-se que a migração direccional de células foi causada pelo EFS mas eventos não induziu-EF, tais como fluxos de electro-osmótico [10].

O mecanismo de electrotaxis tem sido explorado por mais de 10 anos. Várias proteínas e genes importantes são relatados para ser envolvido. Sabe-se que a EF fisiológico redistribui do factor de crescimento epidérmico (EGFR receptores), levando à polarização catódica e a activação da proteína cinase de EGFR por mitogénio-activado (MAPK) [11] de sinalização, [12]. sinalização do EGFR é essencial para a migração EF-dirigida de células [6] do cancro da mama. Além disso, o AMP cíclico (AMPc) e dependente de cAMP de proteína quinase A mediar a migração direccional de queratinócitos humanos em uma dcEF [13], [14]. Beta-4 integrina em conjunto com o factor de crescimento epidérmico (EGF) também mediar as electrotaxis de queratinócitos humanos através de uma via de sinalização dependente de Rac [15]. sinais elétricos de controle cicatrização de feridas através de fosfatidilinositol-3-OH-quinase (PI3K) -γ e fosfatase e homólogo angiotensina (PTEN) [16]. A estimulação EF desencadeia a activação de Src e a sinalização de inositol-fosfolípido, que polariza no sentido da migração celular epitelial [16]. Em

Xenopus

neurônios espinhais embrionárias, GTPases Cdc42, Rac e Rho mediar o crescimento cone de direção em um EF fisiológica através da regulação espaço-temporal da atividade GTPase e seus efetores [17], [18]. A migração guiada-EF dos neurónios do hipocampo do rato é mediada pela activação da proteína cinase Rho-associado (pedra) e PI3K [19]. Além disso, a direcção da migração induzida por EF de

Dictyostelium

células é ligado por cGMP e fosfatidilinositol sinalização [20]. Também está relatado que os iões de cálcio desempenham um papel importante na migração dirigida de

Dictyostelium

células e as células semelhantes a osteoblastos [21], [22], sugerindo que a via de sinalização de cálcio podem participar na electrotaxis.

a maioria dos estudos explorando o mecanismo de electrotaxis estão focados em genes específicos, proteínas e percursos de sinalização. A expressão gênica profiling global poderia ser uma abordagem para revelar toda a vista do mecanismo. microarray de DNA é uma tecnologia bem conhecida para criação de perfis de expressão gênica em todo o genoma. Recentemente, a análise de micro-arranjo para electrotaxis estudo foi realizado em fibroblastos dérmicos humanos e queratinócitos epidérmicos [23], [24]. Em fibroblastos dérmicos humanos, os genes regulados por EF estão associadas com vias de sinalização celulares, incluindo TGF-β, G-proteínas, e inibição da apoptose [23]. Em queratinócitos epidérmicos humanos, os genes regulados por EF são mostrados a se correlacionar com quimiocina, apoptose, JAK-STAT, Wnt, e G-proteína de activação da MAPK vias de sinalização [24]. Até agora, não há nenhum trabalho de pesquisa discutir o efeito global da EF na expressão genética das células cancerosas.

invasão de células de tumores e metástases são as principais causas, resultando na alta mortalidade de pacientes com câncer de pulmão em cinco anos. Invasão é o passo mais importante no processo de metástase, e ocorre através da interacção entre as células tumorais e o ambiente circundante. Células de adenocarcinoma do pulmão humano, CL1-5, que é um sub-linha derivada de CL1-0, tem invasividade mais elevada do que CL1-0 [25]. No nosso estudo anterior, mostrámos que CL1-5 células migram para o ânodo e oriente perpendicularmente à direcção do dcEF. Em contraste, CL1-0 não mostraram resposta electrotactic óbvio [8]. Uma vez que a correlação positiva entre a capacidade metastática e a resposta electrotactic foi observado no nível de célula de movimento, que é importante continuar a investigar a influência do EF fisiológico sobre a expressão do gene. Neste trabalho, as células altamente metastáticas CL1-5 foram examinados usando DNA microarray. Através da análise dos genes regulados por EF e suas vias de sinalização correspondentes, podemos entender mais sobre o papel da EF fisiológico na metástase do tumor.

Para o estudo electrotaxis, temos projetado e fabricado um campo elétrico microfluídico chip (CEF) que fornece dcEF uniforme na cultura de células micro-câmara de [8]. A espessura do micro-câmara é apenas de 70 ^ m e, portanto, o aquecimento por efeito de Joule pode ser omitido [8]. A limitação do CEF é que a região de cultura de células é demasiado pequena para proporcionar células suficientes para análise de microarray no experimento de uma só vez. Portanto, um grande chip de campo elétrico (LEFC) fornecendo dcEF uniforme foi projetado e fabricado neste trabalho para a coleta de amostra (Figura 1).

O LEFC teve de ligar buracos para o meio de entrada /saída e o sal agar pontes. As células foram cultivadas no micro-câmara (região cultura da célula). A largura, comprimento e espessura do micro-câmara foram 24 milímetros, 75 milímetros e 70 mm, respectivamente.

Resultados

LEFC e EF estimulação

Para construir um EF com a força de 300 mV /mm na região de cultura de células, o fluxo de corrente de 696 uA foi introduzido no LEFC por aplicação da tensão de cerca de 21V sobre os eléctrodos (Figura 2). A energia eléctrica consumida na região da cultura de células foi estimada em P = IV = 15.7mW (696 uA × 75 milímetros × 300 mV /mm). Espera-se que joule-aquecimento pode ser omitido com tal energia elétrica baixa. A simulação computacional do dcEF mostrou uma distribuição uniforme na região de cultura celular (Figura 3). região cultura mais de 85% foi exposto na força FE de 300 +/- 15mV /mm.

Um LEFC foi integrado com um chip aquecedor ITO transparente, dois eléctrodos de Ag /AgCl com solução salina tamponada com fosfato (PBS ) como eletrólito, duas pontes de agar de sal (1,5% agar em PBS), uma bomba de seringa, uma fonte de alimentação DC, um amperímetro e um microscópio invertido.

a força EF ao longo da pontilhada foi mostrado linha (entre as duas setas). área de cultura de mais do que 85% foi exposta à força FE de 300 +/- 15mV /mm.

Na análise de microarray, o RNA total de 20-30 ^ g é necessário para um GeneChip, o que significa que cerca de 10

6 CL1-5 células são necessárias para cada repetição. A região de cultura de células de um LEFC é de 75 × 24 milímetros

2, cerca de 40 vezes maior do que a de um CEF (3 × 15 milímetros

2). Testou-se que CL1-5 células colhidas a partir de um LEFC poderia chegar a 10

6 células por chip. Em outras palavras, um LEFC poderia fornecer suficiente quantidade de RNA total para uma experiência microarray.

via de sinalização análise

Através do teste ANOVA, 1631 conjuntos de sondas de Affymetrix HG-U133 plus2.0 matriz foram identificados com a expressão estatisticamente diferencial entre o grupo controle e do grupo tratado com EF (p 0,05). Entre eles, 431 conjuntos de sondas tinha todas as intensidades de sinal dos dois grupos maiores do que a intensidade média global das seis matrizes (= 66,5, a partir das intensidades de sinal de sonda define 54675 × 3 replica × 2 grupos). Os 431 conjuntos de sondas foram considerados na análise via de sinalização. Os números de acesso desses conjuntos de sondas foram submetidos ao website CRSD, onde a análise de enriquecimento iterativo de todo o genoma foi realizada. As três principais vias de sinalização que mostram correlação significativa com os genes regulados por EF foram adherens junção, gene componente RNA da telomerase

hTerc

regulação da transcrição e junção apertada (Tabela 1).

subcelular localização e análise de função biológica

os genes regulados por EF foram categorizadas com base na localização subcelular dos seus produtos proteicos. O banco de dados de proteínas Swiss-Prot e Ensembl foram referidos. Se uma proteína foi localizada em “membrana celular” mostrado na Swiss-Prot, ou que continha “péptido sinal e o domínio transmembranar” mostrado na Ensembl, foi classificado como uma proteína de membrana de células, neste estudo. Com base na definição, foram consideradas 6545 conjuntos de sondas de matriz HG-U133 Plus2.0 para representar os genes que codificam para proteínas da membrana celular. Aqui nós examinamos os genes regulados de forma significativa com a mudança vezes maior do que 1,5 ou menor do que 1 /1.5 (/o grupo de controlo no grupo tratado com EF). Entre 88 genes que preencheram os critérios, 18 genes foram reconhecidos para codificar a proteína da membrana celular. O percentual é de 18,2% (= 16/88). Para efeito de comparação, foram selecionados aleatoriamente 88 conjuntos de sondas dos conjuntos de sondas de matriz plus2.0 HG-U133 (excluindo os conjuntos de sondas de sequências de controle) e examinou a percentagem de genes que codificam proteínas da membrana celular. O percentual médio de operação 10000-time é de 12%.

A categorização dos 88 genes significativamente regulados foi mostrado na Tabela 2 (up-regulada) e Tabela 3 (regulada). Para além dos genes que codificam para proteínas da membrana celular, os outros foram categorizadas com base no “componente celular” na Swiss-Prot. Além disso, os genes listados na Tabela 2 e na Tabela 3 foram analisadas com a sua função biológica de acordo com a anotação Gene ontologia (Figura 4). O resultado da análise de microarray foi parcialmente validado por em tempo real de RT-PCR. Os 20 genes seleccionados mostrou correlação positiva entre o tempo real de RT-PCR e os resultados da análise de microarray em sua mudança de expressão (Tabela 2 e 3).

Os genes regulados significativamente listados na Tabela 2 (sobre-regulada) e Tabela 3 (down-regulamentado) foram classificados com sua função biológica de acordo com a anotação Gene Ontology. expressão

Gene de genes electrotaxis-relacionados relatados /proteínas

Nós também analisou os resultados da análise microarray dos genes que foram relatados para ser correlacionada com electrotaxis. Entre as 1631 conjuntos de sondas identificadas por ANOVA, aqueles que têm todas as intensidades acima do nível do fundo (isto é, maior do que a mediana global) em pelo menos um dos dois grupos foram considerados. A expressão de proteínas /electrotaxis relacionadas com os genes foi discutido abaixo.

Discussão

estimulação EF

Sob a força EF de 300 mV /mm, o nosso trabalho anterior mostrou que CL1 -5 células têm uma tendência significativa de migração direcional e orientação enquanto as células CL1-0 mover aleatoriamente [8]. células CL1-5 apresentar um movimento quase constante em direcção ao ânodo, imediatamente após a dcEF está ligado. No entanto, a orientação das células CL1-5 não é evidente até exposição de 2 horas no dcEF. O tempo de resposta diferente da migração direcional induzida por EF ea orientação do corpo celular das células CL1-5 sugerem o envolvimento de diferentes vias de sinalização em electrotaxis. Este ponto de vista também é sugerido em um trabalho recente de Hammerick et al [26].

Nós presume que a mudança de expressão gênica associar-se com as duas respostas electrotactic, a migração direcional e a orientação, poderiam ser detectados após o tratamento de 2 horas da dcEF. Assim, no presente estudo, a análise foi realizada por microarranjo CL1-5 células estimuladas por 300 mV /mm durante 2 horas. Os resultados mostraram que vários genes foram regulados de forma significativa. Considerando o alto custo da análise de DNA microarray (cerca de US $ 1.000 × 3 replica × 2 grupos para cada ponto de tempo), começamos escolhendo o período de tempo de 2 horas neste estudo inicial. Para diferenciar ainda mais se o gene regulado foi correlacionada com a migração direccional ou a orientação, análise de microarray de estímulo EF curto prazo (talvez 10 minutos) será prosseguido no nosso trabalho futuro.

Neste estudo, o meio de cultura celular foi substituído por meio DMEM isento de soro antes da dcEF foi aplicado. O soro é um composto complexo que contém diferentes proteínas como factores de crescimento, citoquinas, e factores de fixação. Sob uma dcEF aplicada na câmara de cultura de células, gradiente químico destas proteínas pode ser gerado por electroforese. Portanto, a resposta de células sob o dcEF pode ser afectada por quimiotaxia. Para minimizar os possíveis efeitos do gradiente químico ao investigar a influência de dcEF nas células, o soro foi retirado antecipadamente. O nosso trabalho anterior tem mostrado que a dcEF induz a migração direccional e a orientação das células CL1-5 em meio isento de soro [8]. Os resultados sugerem que o dcEF poderia induzir a resposta electrotactic de células vivas sem estimulação química. Alguns tipos de células diferentes, também mostram uma resposta electrotactic em meio isento de soro, tais como as células da crista neural, neurónios do hipocampo, e as células CHO [27] – [29]

No entanto, as células estão rodeados por uma variedade de. fatores de crescimento e citocinas

in vivo

que também podem desempenhar papéis nos electrotaxis de células. No nosso estudo anterior, as células foram observadas CL1-5 para migrar para o ânodo tanto em [8] e em (Filme S1) meio isento de soro contendo soro sob uma dcEF aplicada. É um importante trabalho futuro, para comparar a expressão de genes regulados por EF em meio contendo soro e que, em meio isento de soro. O efeito concorrente da EF e o gradiente químico pode, assim, ser investigada. Esse trabalho pode nos ajudar a descobrir os fatores de crescimento candidato e citocinas que participam no mecanismo de electrotaxis.

via de sinalização análise

Sob o tratamento da dcEF, observamos a regulação diferencial de seis genes que foram conhecidas por estarem envolvidas na via adherens junção (hsa04520, KEGG) (Tabela 1). Quatro genes

ACVR1B

(1,51 vezes),

FYN

(1,21 vezes),

WASF3

(1,2 vezes), e

ACP1

( 1,18 vezes) mostraram-se-regulada.

ACVR1B

(receptor de activina A, tipo IB) codifica um receptor de activina de tipo I, que é um receptor transmembranar de serina /treonina-quinase e é essencial para a sinalização. sinalização do receptor de activina regula a adesão de células epiteliais da próstata e está associado com a metástase do cancro da próstata [30]. A tirosina proteína quinase Fyn (codificada pelo

Fyn, FYN

oncogene relacionado com

SRC

,

FGR

,

SIM

) é um membro da Src cinases da família que são importantes para a adesão celular mediada pela integrina e migração [31]. Activação de Fyn promove a migração de células de carcinoma escamoso [32].

WASF3

(WAS família de proteínas, membro 3), também conhecido como

Wave3

, codifica um membro proteína da família WAVE que medeia a reorganização da actina e movimento celular. Tem sido relatado que Wave3, que é regulado a jusante de PI3K, concentra-se no lamelip�ios na vanguarda e medeia a migração de células e formação de lamelip�ios [33].

A expressão de

PVRL1

( 1 /1,97 vezes) e

ACTG1

(1 /1,05 vezes) foram mostrados para ser suprimidos pelo dcEF aplicada.

PVRL1

(Poliovírus receptor-related 1), também chamado

Nectin-1 |, codifica para uma proteína de adesão célula-célula independente de cálcio. Nectin-1 desempenha um papel na organização de junções aderentes de células epiteliais e endoteliais [34], [35].

ACTG1

(Actin, gama 1) codifica uma actina citoplasmática encontrada em células nonmuscle. Actins são bem conhecidos por estarem envolvidos em vários tipos de motilidade celular, e manutenção do citoesqueleto. O dcEF aplicado aumentou a expressão de

ACVR1B

,

FYN

, e

WASF3

, o que poderia, por sua vez aumentar a migração de CL1-5. Foi sugerido que a EF-reduzida aderência (

PVRL1

↓) contribuiu para a mobilidade melhorada. A supressão de

ATCG1

foi menor em comparação com a alteração de outros genes. Tem sido demonstrado que a taxa de migração de CL1-5 é reforçada quando se aplica uma dcEF à região de cultura de células [8].

investigada a relação entre os produtos proteicos destes genes de seis. A ferramenta analítica MetaCore (GeneGo) foi aplicado para construir as redes de interação proteína-proteína directa ou indirecta. As interacções e a localização subcelular das proteínas foram mostrados na Figura 5. Observou-se que Fyn, ACP1, e c-Src tem interacção directa com os receptores de dois tipos de receptores, derivado de plaquetas factores de crescimento (PDGF) e receptores de efrina [36 ] – [43].

C-Src

foi demonstrado ser 1,3 vezes supra-regulados por dcEF neste estudo. receptores de PDGF tem sido implicado para ser activado por forças físicas que alteram a conformação do receptor [44]. As redes sugerido que os receptores de PDGF pode ser estimulada pela dcEF e, em seguida, activado Fyn, c-Src e c-Abl, que influenciou a activação de Wave3 [45] – [47]. O Wave3 activada posteriormente regulamentada a reorganização do citoesqueleto de actina e, portanto, influenciou a morfologia celular e motilidade [48]. Os resultados também sugerem que os receptores de efrina-A e os receptores de efrina-B pode desempenhar um papel na conversão dos estímulos eléctricos em sinais biológicos. No entanto, a mudança de expressão do gene não foi observado em receptores de PDGF, receptores de efrina, e c-Abl neste estudo. O nível de expressão e o papel destas proteínas na electrotaxis precisa ser mais investigada.

O diagrama mostrou que o EF-regulada Fyn, ACP1, e c-Src pode interagir directamente com os dois tipos de receptores de membrana, receptores de PDGF e receptores de efrina. seta verde: efeito positivo; seta vermelha: efeito negativo; seta cinza:. efeito não especificado

Vários genes EF-regulados foram envolvidos na regulação da transcrição do gene componente RNA da telomerase

hTerc

(h_terc, BioCarta), que codifica o componente de RNA de telomerase humana. O componente de ARN serve como molde para a repetição do telómero [49]. Através do tratamento da EF, observou-se que

NFYA

(fator de transcrição nuclear Y, alfa) e

NFYC

(fator de transcrição nuclear Y, gama) foram regulados negativamente com 1 /1.16- dobrar e 1 /1,27 vezes, respectivamente.

NFYA

e

NFYC

codificam duas subunidades de uma proteína NF-Y complexo trimérico, que é um ativador da

hTerc

gene. A infra-regulação da

NFYA

e

NFYC

sugeriu que a expressão de

hTerc

pode diminuir devido à dcEF aplicada. Desde que não há nenhuma sonda definido para o

hTerc

gene em HG-U133 mais 2,0 array, a expressão deste gene não foi mostrado no resultado microarray.

A aplicação do dcEF para CL1 -5 células também alterou a expressão de genes importantes envolvidos na via apertado junção (hsa04530, KEGG). Quatro genes correlacionados

F11R

(1,52 vezes),

CTTN

(1,51 vezes),

RAB13

(1,25 vezes), e

EPB41

(1,23 vezes), revelou ser sobre-reguladas.

F11R

gene (receptor de F11), também chamado de junção molécula de adesão-A (JAM-A), é um regulador importante do conjunto de junção apertado e migração de células [50].

CTTN

gene (cortactina) codifica uma cortactina proteína que regula as interações entre os componentes das junções do tipo aderente. Ele organiza as estruturas do citoesqueleto e adesão celular de células epiteliais e de carcinoma. Muitos estudos têm documentado um papel para cortactina na promoção da motilidade celular e invasão de câncer [51].

RAB13

gene (RAS membro da família do oncogene) codifica uma das pequenas trifosfatases guanosina (GTPases) da subfamília RAB, que é conhecido para localizar a junção estanque. Esta proteína tem mostrado desempenhar um papel crítico na regulação tanto da estrutura e função das junções apertadas em células epiteliais polarizadas [52]. Rab13 proteína também é mostrada para ser activada durante o espalhamento celular epitelial-o processo que inclui os primeiros passos de carcinoma invasão /metástase [53]. O gene

EPB41

(banda de proteína da membrana do eritrócito 4.1) codifica uma das proteínas chamadas 4.1 4.1R. As proteínas da família 4.1 são componentes do citoesqueleto cortical subjacente à membrana celular. Eles contribuem para a organização da polaridade celular, adesão e motilidade. Eles também afectar o transporte através da membrana e a resposta aos factores de crescimento [54]. Por outro lado,

PTEN

(1 /1,19 vezes) e

ACTG1

(1 /1,05 vezes) mostraram ser regulados negativamente.

PTEN

é identificada como um supressor tumoral e codifica um fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 3 (PtdIns (3,4,5) P3) – fosfatase. PTEN sub-regula os níveis intracelulares de PtdIns (3,4,5) P3 e assim regula negativamente a via PI3K /Akt. Sob a dcEF aplicada, PtdIns (3,4,5) P3 foi relatado para ser polarizado para o bordo de ataque de células HL60 diferenciadas que migram para o cátodo [16]. Sabe-se que PTEN inibe a migração celular, espalhamento, e adesões focais [55]. Em resumo,

F11R

,

CTTN

,

RAB13

,

EPB41

,

PTEN

e

ACTG1

foram conhecida por mediar a motilidade celular e /ou organização do citoesqueleto, sugerindo que eles podem desempenhar um papel na resposta electrotactic de CL1-5.

as monocamadas confluentes de células CL1-5 puderam ser observadas depois da incubação durante a noite (~20hrs ) na câmara de cultura de LEFC. Relata-se que o desenvolvimento de vedações eléctricas de alta resistência tem 48 horas de galvanização para atingir o estado estacionário em formação junção apertado [56]. Uma vez que os genes associados a junção apertados foram observados para ser EF-regulada, inferiu-se que a dcEF pode influenciar a formação da junção apertado durante o período de estimulação. Assim, examinámos ainda mais a expressão do gene de outros componentes importantes de junção apertadas, tais como as proteínas de transmembrana e occludins claudinas, e a família ZO citoplasmática. No entanto, não foi observada diferença significativa entre o grupo controle e do grupo tratado com EF. Os resultados sugerem que dcEF pode influenciar a montagem junção apertado através da regulação JAM-A, em vez de occludins, claudinas, e familiares ZO no nível de transcrição.

Para resumir, EF podem influenciar o movimento de CL1-5 por regulando a junção aderente e junção apertado no nível de transcrição. Muitos destes genes regulados em duas vias de sinalização são conhecidos para correlacionar a migração celular. Exceto para

PTEN

e

ACTG1

, a maioria dos genes não foram relatados para ser ainda EF-correlacionados.

Localização subcelular análise

Um conhecido mecanismo de electrotaxis é que os receptores de membrana sob a redistribuir dcEF aplicada e provocar a sinalização assimétrica da célula [1]. Propõe-se também que FE podem ser transduzidas em sinais mecânicos por o binário mecânico exercendo sobre as glicoproteínas sobre a membrana celular [57]. Uma vez que as proteínas da membrana de células pode ser influenciada directamente pela dcEF, gostaríamos de investigar a sua proporção em produtos dos genes regulados pela EF. foram observados para codificar a proteína de membrana de células cerca de 18,2% dos genes regulados de forma significativa (1 /1,5 vezes a mudança ; 1,5 ou 66,5) é maior do que a do grupo tratado com EF (48,7 em média com todas as repetições 66,5).

Beta-4 integrina, codificadas por

ITGB4

, está associada com alfa-6 de integrina ser um receptor para as lamininas. Tem sido relatado que o beta-4 integrina e EGF coordenadamente regular a migração direccional mediada por EF através Rac1 em queratinócitos humanos [15]. A partir do resultado da análise microarray, não vimos a regulação da

EGF

,

ITGB4

, e

Rac1

sob a dcEF. No entanto,

ITGB5

que codifica beta-5 integrina, outro membro da família das integrinas, mostrou significativo aumento da regulação pela dcEF (1,55 vezes, Tabela 2). Beta-5 da integrina está associada com alfa-V integrina ser um receptor para as fibronectinas. Tem sido relatado que a interferência RNA knockdown de beta-5 expressão integrina reduz a migração de células

in vitro

e metástase

in vivo

[60]. Nosso resultado sugeriu a correlação positiva entre o aumento da regulação do

ITGB5

ea migração aumentada de células CL1-5 sob a dcEF aplicada.

Rac e Cdc42 são GTPases que regulam a formação lamellipodia e filopódios , respectivamente. Eles têm sido propostos para dominar a direcção dos cones de crescimento cathodally em

Xenopus

neurônios espinhais embrionárias. Também tem sido mostrado que RhoA, cuja activação conduz ao colapso do cone de crescimento, eleva anodally nos cones de crescimento tratados com EF [17], [18]. proteínas Rho regular o conjunto dinâmico de componentes do citoesqueleto por vários processos fisiológicos, incluindo a motilidade celular. Eles são conhecidos por estar envolvidos na transformação celular e metástase do cancro. Em nossa análise microarray, nós não ver a mudança expressão de

Rac

,

Cdc42

, e

RhoA

sob a dcEF. No entanto,

DOCK9

, que codifica um factor de troca do nucleótido guanina-específico (GEF) que reconhece e activa Cdc42, foi demonstrado que é sobre-regulada por 1,94 vezes (Tabela 2) [61]. Além disso,

RhoJ

, que codifica outro membro da família Rho, parecia ser sobre-regulada pelo tratamento EF (adesão # BC025770). Para

RhoJ

, a intensidade do sinal do grupo tratado com EF (todas as repetições 66,5, 91,4, em média) é maior do que a do grupo de controlo (todas as repetições 66.5, 32.4, em média). Recentemente, RhoJ é encontrado para regular positivamente a motilidade endotelial e formação de túbulos [62].

migração guiada por EF de neurônios do hipocampo de ratos é mediada pela ativação da ROCK e PI3K.