Abstract

Fundo

publicações recentes sugerem que a iniciação neoplásica e crescimento são dependentes de um pequeno subconjunto de células, as células-tronco do câncer denominado (CSCs). Anaplásico da tiróide Carcinoma (ATC) é um tumor sólido muito agressivo com mau prognóstico, caracterizado pela alta desdiferenciação. A existência de CSCs podem explicar a heterogeneidade das lesões ATC. CD133 foi identificado como um marcador de células-tronco para tecidos normais e cancerosos, embora a sua função biológica permanece desconhecida.

Metodologia /principais conclusões

linhas celulares ATC ARO, KAT-4, KAT-18 e FRO foram analisadas para a expressão CD133. Citometria de fluxo mostrou CD133

células pos apenas em ARO e KAT-4 (64 ± 9% e 57 ± 12%, respectivamente). Estes dados foram confirmados por qRT-PCR e imunocitoquímica. ARO e KAT-4 também foram positivos para o marcador fetal fibronectina oncofetal e negativo para específicos de tirócito marcadores de diferenciação tireoglobulina, tireoperoxidase e sódio /symporter iodeto. ARO /CD133

células pos ordenadas apresentaram maior proliferação, auto-renovação, capacidade de formação de colónia em comparação com ARO /CD133

neg. Além disso, a ARO /CD133

pos mostrou níveis de factor de transcrição da tiróide TTF-1 semelhante à linha de células da tiróide fetal de TAD-2, enquanto que a expressão em ARO /CD133

NEG foi insignificante. A expressão do marcador de células estaminais Oct-4 detectado por RT-PCR e citometria de fluxo foi marcadamente maior em ARO /CD133

pos em comparação com ARO /CD133

células NEG. Os marcadores de células-tronco c-KIT e Thy-1 foram negativas. Sensibilidade a agentes de quimioterapia foi investigado, mostrando notável resistência à apoptose induzida por quimioterapia em ARO /CD133

pos quando comparado com ARO /CD133

células Neg.

Conclusões /Significado

descrevemos CD133

células pos em linhas celulares ATC. ARO /CD133

células pos apresentam-tronco características semelhantes a células – como a alta proliferação, capacidade de auto-renovação, expressão de OCT-4 – e são caracterizados por uma maior resistência à quimioterapia. A positividade simultânea para o fator específico tireóide TTF-1 e onfFN sugerem que eles podem representar células estaminais-como câncer de tireóide putativos. Nossos

in vitro

descobertas podem fornecer novas perspectivas para novas abordagens terapêuticas

Citation:. Zito G, Richiusa P, Bommarito A, Carissimi E, Russo L, Coppola A, et al. (2008)

In Vitro

Identificação e Caracterização de CD133

Cancro pos Stem Cells-Like em linhas de células anaplásico da tiróide Carcinoma. PLoS ONE 3 (10): e3544. doi: 10.1371 /journal.pone.0003544

editor: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center e Instituto de Pesquisas Beckman, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de abril de 2008; Aceito: 06 de outubro de 2008; Publicado: October 28, 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Zito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações do Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) 60% (CG)

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma da tiróide anaplásico (ATC) é um dos tumores endócrinos mais agressivos com características morfológicas de neoplasia indiferenciada. Os pacientes com ATC têm um mau prognóstico com um tempo de sobrevida média de 2-6 meses. Cirurgia, radioterapia e quimioterapia não melhorar a taxa de sobrevivência [1].

Recentemente, foram identificadas células-tronco adultas na glândula tireóide humanos [2]. Estas células expressam diversos marcadores específicos, tais como o factor de transcrição nuclear Oct-4 (também conhecida como OCT-3, oct-3/4) e os marcadores da endoderme GATA-4 e HNF4α [2] -. [4]

a ligação entre as células-tronco e câncer tem sido sugerido em vários tecidos, onde as células cancerosas são supostamente derivados de progenitores imaturos ou as células-tronco [5]. cancro de células estaminais (CSCs) foram encontrados em leucemia [6], glioblastoma [7], da mama [8], próstata [9], gástrica [10], do pulmão [11], e do cólon [12] cancro. Estas células, que representam apenas uma pequena população dentro da massa do tumor, possuem a capacidade simultânea de auto-renovação e diferenciação em outros citotipos [13]. O fenótipo haste semelhante provou ser capaz de resistir a terapias convencionais, conduzindo assim a recidiva da doença, mesmo quando a lesão primária foi erradicada [14], [15]. Até à data, no entanto, não há estudos têm definitivamente indicaram que as células-tronco são responsáveis ​​pela carcinogênese da tiróide. No entanto, o padrão de crescimento rápido e raridade de ATC se assemelha a natureza das células estaminais. Apenas um estudo descreveu uma população muito pequena, denominado população lado, enriquecida de células-tronco entre linhas celulares de cancro da tiróide [16]. Além disso, a hipótese de carcinogénese células fetais, em que as células cancerosas são derivados a partir de restos de células fetais da tiróide em vez de tireócitos adultos, foi proposto [17].

Vários marcadores foram identificados para a caracterização de CSCs. CD133 humano, um homólogo de antigénio altamente conservada de rato Prominin-1, foi originalmente identificada numa subpopulação de células CD34

+ células hematopoiéticas derivadas de fígado fetal humano e medula óssea [18] – [19]. CD133 foi utilizado para a identificação e isolamento de uma população CSC putativo a partir de vários cancros humanos [20], [21]. Além disso, foi mostrado a expressão de CD133

CSCs pos no carcinoma hepatocelular (HCC) para conferir chemoresistance

in vitro

[14]. No entanto, sua função biológica permanece desconhecida. O factor de transcrio Oct-4 é considerada um regulador principal da pluripotência de células estaminais e as capacidades de auto-renovação embrionários humanos [22]. Curiosamente, essas propriedades de células-tronco são atribuídos a OCT-4A, uma variante de splicing do gene OCT-4 localizado no núcleo [23], [24].

O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão de marcadores de células-tronco putativos em linhas celulares estabelecidas humanos ATC, tais como ARO, KAT-4, KAT-18 e FRO. Identificamos CD133

células pos em ARO e linhas celulares KAT-4. Este subconjunto foi caracterizado por maior

in-vitro

proliferação e auto-renovação e formadoras de colônia capacidade. ARO /CD133

pos foram mais resistentes do que ARO /CD133

células neg a apoptose induzida por quimioterapia. Além disso, ARO /CD133

células pos expressa o fator de transcrição thyroblast específica TTF-1 e o marcador de células-tronco OCT-4, enquanto eles eram negativos para os marcadores de células-tronco c-Kit e THY-1.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e condições de cultura

linhas celulares ATC Humano ARO, KAT-4, KAT-18 lá e para cá foram gentilmente cedido pelo Prof. A. Fusco, Universidade de Nápoles , Itália. Durante a fase de expansão e para células de ensaio auto-renovação foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS). Para todas as outras experiências, as células foram cultivadas em meio RPMI1640 isento de soro (SFM), suplementado com o Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF, 20 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e factor de crescimento epidérmico (EGF, 20 ng /ml;. Sigma-Aldrich) [25]

Citometria de fluxo

A expressão de marcadores de células tronco CD133, Oct-4, c-kit e Thy-1 foi avaliada por fluxo citometria (FACSCalibur, Becton Dickinson, San José, CA, EUA). Para a análise de CD133, as células foram tratadas primeiro com reagente de bloqueio FcR (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e em seguida incubou-se no escuro a 4 ° C durante 10 minutos com ficoeritrina (PE) -conjugated rato IgG2b anti-humano CD133 /2 (clone 293C3, Miltenyi Biotec). Para co-coloração com c-Kit e Thy-1, as células foram subsequentemente incubadas com IgG1 monoclonal anti-humano c-KIT e Thy-1 anticorpos anti-humanos IgG1 (Chemicon International, Temecula, CA, EUA) a 4 ° C durante 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS e depois incubadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated policlonal de cabra anti-ratinho, a 4 ° C durante 30 minutos. Para a coloração com Oct-4, as células foram fixadas e permeabilizadas com o kit Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então incubadas com anticorpo monoclonal IgG2b de rato oct-3 anti-humano /4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) a 4 ° C durante 30 minutos, lavadas duas vezes com PBS e incubadas com ficoeritrina (PE) policlonal -conjugated de cabra anti-ratinho, a 4 ° C durante 30 minutos. O anticorpo primário reconhece a isoforma OCT-4A da proteína (aa 1-134).

A apoptose foi avaliada por ensaio de caspase 3. As células foram em primeiro lugar fixadas e permeabilizadas com o kit Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então incubadas com anticorpo monoclonal IgG de coelho anti-caspase 3 (BD ​​Pharmingen) à temperatura ambiente durante 20 minutos, lavadas duas vezes com PBS e depois incubadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated IgG de cabra anti-coelho policlonal (Santa Cruz Biotechnology) à temperatura ambiente durante 20 minutos.

Os dados foram analisados ​​com o software CELLQuest Pro (Becton Dickinson Immunocytometry Sistemas, San Jose, CA, EUA). Gating foi implementado com base em perfis de coloração de controlo negativo.

Imunocitoqu�ica

ARO e linhas celulares KAT-4 foram colocadas em lâminas de câmaras (Lab-Tek, Nunc, Inc. Naperville, EUA), permitiu a aderir durante 48 horas e, em seguida, utilizados para imunocitoquímica. As células foram fixadas em 3% H

2O

2 em metanol durante 10 minutos à temperatura ambiente, depois lavou-se duas vezes em PBS, bloqueadas com BSA a 3% e permeabilizadas com PBS contendo 0,1% de Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura do quarto. As células foram incubadas com CD133 de rato anti-humano (IgG1, clone AC133, Miltenyi Biotec) em tampão de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente, em seguida, lavadas com PBS. A expressão foi detectada utilizando anticorpos secundário biotinilado e estreptavidina /peroxidase de rábano. Cromógeno 3-amino-9-etilcarbazol substrato (AEC) foi usado e lâminas foram contrastadas com hematoxilina.

Classificação de ARO /CD133

células pos

células ARO foram tripsinizadas e marcadas com primário CD133-Biotina e Biotina-Microbeads (Indirecto estojo de isolamento de células CD133, Miltenyi Biotec), de acordo com as instruções do fabricante. Após separação magnética, a pureza das células foi avaliada por citometria de fluxo utilizando ficoeritrina (PE) anti-humano -conjugated CD133 /2 (clone 293C3, Miltenyi Biotec).

Isolamento de ARN total, RT-PCR e qRT-PCR

O RNA total foi extraído e purificado a partir de cultura KAT-4, KAT-18, FRO e ARO (indiferenciados, classificado CD133

neg e CD133

pos) linhas celulares utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milão, Itália), incluindo um passo de digestão com DNase I definido. quantidade e qualidade do ARN foi avaliada por espectrofotometria UV. 2 ug de RNA total foram sujeitas a transcrição reversa num volume de 20 ul com os iniciadores oligo dT (Applied Biosystems, Darmstad, Alemanha) e Stratascript RT (Stratagene, Amsterdão, Holanda), de acordo com o protocolo do fabricante. Tireoglobulina (Tg), tireoperoxidase (TPO), sódio /symporter iodeto (NIS), fibronectina oncofetal (onfFN) e OCT-4 expressão foi analisada por reação em cadeia da polimerase (PCR) [26] – [27]. 1 uL de ADN complementar foi adicionado a uma reacção de 50 ul contendo 10 ul 5 × tampão de reacção, 50 mmol /L de MgCl

2, 1 de dNTPs ul, iniciadores sentido e anti-50 pmol e 0,5 U de Taq DNA polimerase ouro. As reacções foram realizadas a 95 ° C durante 10 minutos; 35 ciclos a 95 ° C durante 45 segundos, 55 ° C durante 45 segundos (iniciador específico) e 72 ° C durante 45 segundos, seguidos de uma extensão a 72 ° C durante 7 minutos e terminação, a 4 ° C. sequências de par de iniciadores, o ADNc tamanhos dos fragmentos e temperaturas de recozimento foram as seguintes: Tg (762 pb): 5′-CTTCGAGTACCAGGTTGATGCC-3 ‘e 5′-GGTGGTTTCAGTGAAGGTGGAA-3′ (55 ° C), a TPO (593 pb): 5’ TGTGTCCAACGTGTTCTCCACAG-3 ‘e 5′-AAGACGTGGCTGTTCTCCCAC-3′ (55 ° C), NIS (179 pb): 5’-CTATGGCCTCAAGTTCCTCT-3 ‘e 5′-TCGTGGCTACAATGTACTGC-3′ (57 ° C), onfFN (215 pb) : 5’-TCTTCATGGACCAGAGATCT-3 ‘e 5′-TATGGTCTTGGCTATGCCT-3′ (55 ° C), Oct-4 (456 pb): 5’-AGCCCTCATTTCACCAGGCC-3 ‘e 5′-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3′ (63 ° C) , β-actina (439 pb): 5’-GATGACCCAGATGACCCAGATCATGTTTG-3 ‘e 5′-AGGCTGGAAGAGTGCCTCA-3′ (55 ° C). Para a análise Oct-4, nTERA2 ADNc (controlo positivo) foi gentilmente fornecido pelo Dr. S. Liedtke, Universidade de Dusseldorf, Alemanha. Para onfFN e TTF-1, 2-TAD cDNA foi usado como controlo positivo. CD133 e TTF-1 expressão foi analisada por PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) em amostras individuais. Um total de 2 ^ g foram utilizados para medir os níveis de ARNm em relação à expressão de p-actina de ARNm. iniciadores e sondas de PCR foram adquiridos de Qiagen (Quantitect Primer Prominin1 e TTF1). Todas as reacções foram realizadas num volume final de 20 ul com 2 ul de ADNc molde usando um LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). A análise dos dados foi realizada com QBASE navegador que emprega um modelo de quantificação relativa Δ-CT com correcção eficiência da PCR e normalização gene de referência único (β-actina: 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3 ‘, 5′-e AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’) [28] .

In Vitro

Cultura e celular Ensaio de Proliferação de ARO /CD133

células pos

Após o isolamento, ARO /CD133

pos e ARO /CD133

neg células foram cultivadas imediatamente em SFM suplementado com bFGF e EGF numa atmosfera de 5% de CO

2 a 37 ° C.

a proliferação celular foi avaliada por ensaio colorimétrico utilizando 3- (4,5- -Dimethylthiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) e kit BrdU (colorimétrica) (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). Para o ensaio de MTT, classificados ARO /CD133

ARO pos e /CD133

neg células foram plaqueadas numa placa de 96 poços em 100 ul SFM /poço e cultivadas até 72 horas. As células foram incubadas durante 4 horas a 37 ° C com MTT; Após a incubação, o meio foi removido e as células foram tratadas com DMSO, durante 5 minutos. A viabilidade foi avaliada pelo espectro de absorção de UV a 550 nm com Leitora Modelo 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA).

Para o ensaio BrdU, classificado ARO /CD133

pos e ARO /CD133

NEG foram plaqueadas numa placa de 96 poços em 100 ul SFM /poço e cultivadas até 144 horas. A viabilidade foi avaliada pelo espectro de absorção no UV a 450 nm com leitor de microplacas modelo 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, EUA).

auto-renovação de ensaio de ARO /CD133

células pos

Ordenado ARO /CD133

células pos foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% FBS. expressão CD133 foi detectada por citometria de fluxo, nos dias 0, 4, 8 e 11. Ao mesmo pontos de tempo a apoptose foi avaliada por anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante.

ensaio de formação de colónias de ARO /CD133

células pos

Ordenado ARO /CD133

pos e ARO /CD133

células neg foram cultivadas em placas de 6 poços em SFM metilcelulose (meio básico HSC-CFU, Miltenyi Biotec). As placas foram mantidas a 37 ° C num incubador humidif içado, durante 2 semanas. O número de colónias foi avaliada por contagem microscópica.

Quimioterápicos

ARO /CD133

pos e CD133

células neg foram cultivadas em SFM suplementado com bFGF (20 ng /ml ) e EGF (20 ng /ml) com ou sem cisplatina (5, 10, 15 e 20 uM; Pharma, Áustria), doxorrubicina (0,5, 1, 1,5 e 2 uM; Ebewe Pharma, Áustria), etoposido (10, 30 , a 100 m; Teva Pharma, Holanda). A percentagem de viabilidade ARO /CD133

CD133

células neg pos e foi avaliada em 24, 48 e 72 horas de ensaio de MTT e às 48, 96 e 120 horas de ensaio BrdU.

Para apoptose avaliação, ARO /CD133

pos e CD133

neg células foram cultivadas em placas de 6 poços e tratadas com a maior concentração de cada droga (20 uM cisplatina, 2 uM de doxorrubicina e 100 uM etoposido) até 120 horas. avaliação apoptose (caspase 3 ensaio) foi avaliada por citometria de fluxo, como descrito acima.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada com SPSS v. 11 software para Windows. Os dados são expressos como média ± DP. As comparações estatísticas foram baseadas em testes não paramétricos e significância estatística foi definido em p 0,05. Para as experiências com chemoterapics, diferenças na viabilidade de linhas celulares ATC foram calculados com o teste de Mann-Whitney; p de tendência com diferentes concentrações de drogas foi calculada com a W de teste de Kendall.

Resultados

Identificação de CD133

células pos em linhas celulares ATC

A fim de identificar CSCs em linhas celulares ATC, analisamos a expressão de CD133 por citometria de fluxo em ARO, KAT-4, KAT-18 e FRO (Fig 1A). ARO e KAT-4 mostrou uma positividade média de 64 ± 9% e 57 ± 12%, respectivamente; KAT-18 e FRO foram negativos. Os resultados foram confirmados por qRT-PCR (Fig. 1B). CD133

células pos em linhas celulares foram caracterizadas pela ARO localização citoplasmática e polarizada do antigénio sobre a superfície apical das células (Fig. 1C). O estado indiferenciado de linhas celulares ATC foi confirmada em PCR pela presença de onfFN [26] e a ausência de marcadores específicos da diferenciação tirócito Tg, TPO e NIS [27] (Fig. 2A e B).

(a) a citometria de fluxo análise de CD133 em ARO, KAT-4, KAT-18, e linhas celulares FRO. linhas pretas representam coloração positiva para CD133, linhas cinzentas mostram controlo negativo com o anticorpo isotipo. Os dados são representativos de três experiências independentes. (B) Análise de expressão de CD133 em linhas celulares ATC por qRT-PCR. Os dados estão representados como a mudança de dobragem (escala relativa), considerando Imunocitoquímica KAT-18 = 1. (C) de CD133 na linha celular ARO. As setas indicam a localização apical e polarizada de CD133 (20 × ampliação).

A expressão de genes específicos da tireóide (Tg, TPO, NIS) (A) e marcador fetal onfFN (B) em ARO, KAT- 4 e tiróide normal por RT-PCR. linha celular de TAD-2 foi utilizado como controlo positivo para ARNm onfFN. β-actina foi utilizada como controlo interno em ambas as experiências. pares bp = base.

C

ell cultura de ARO /CD133

células pos ordenadas

eficiência da ordenada ARO /CD133

pos células foi avaliada por análise FACS, que mostra 90% de positividade CD133 (Fig. 3A). Após o isolamento, ARO /CD133

células pos, cultivadas em SFM suplementado com bFGF e EGF, cresceu como, células esféricas individuais, não aderentes. Depois de alguns dias, ARO /CD133

células pos começou a formar grupos que aumentaram progressivamente em número e tamanho, apesar de não formar folículos. Pelo contrário, a ARO /CD133

células NEG dificilmente agregados em agregados (Fig. 3B).

(A) Pureza de ARO /CD133

pos células após célula magnética triagem avaliada por citometria de fluxo. (B) Características da ordenada ARO /CD133

pos e ARO /CD133

neg nos dias 0, 3 e 10 de cultura. ARO /CD133

células pos formados grupos que aumentaram em tamanho horas extras.

In vitro ensaio de proliferação celular

, auto-renovação e capacidade de formação de colónia de ARO /CD133

células pos

A proliferação foi avaliada por MTT e BrdU. ARO /CD133

células pos mostrou

in vitro

aumento da proliferação em comparação com ARO /CD133

células neg tanto com MTT em 48-72 horas e BrdU em 72-144 horas (p = 0,028 e p≤0.001, respectivamente) (Fig. 4A e B). No que se refere a caspase 3, a citometria de fluxo mostrou a apoptose espontânea em SFM, que variou, após 144 horas de 0,5 a 2% para /CD133

células pos ARO e 3,4 a 8,8% para ARO /CD133

células NEG (dados não mostrando). renovação auto também foi avaliado (Fig. 4C). expressão CD133 em ARO /CD133

células pos inicialmente diminuiu de 90% no dia 0 a 46% no dia 8, e manteve um estado estacionário até ao dia 11. A diminuição na CD133 de horas extras expressão não foi causado por morte celular ( 2%, dados não mostrados). Em vez disso, a proliferação celular continuou durante todo o período de cultura, sugerindo que ARO /CD133

células pos são caracterizados pela capacidade de divisão assimétrica (ou seja, produção de duas células-filhas, uma CD133

pos e um CD133

neg). ensaio de formação de colónia confirmou a alta capacidade de auto-renovação das ARO /CD133

pos, em comparação com ARO /CD133

células NEG. Na verdade, a ARO /CD133

pos células foram capazes de formar um maior número de colónias de tumor (p = 0,028) (Fig. 4d e 4e).

(A) ensaio de proliferação celular (MTT). A linha pontilhada representa ARO /CD133

células NEG, linha contínua representa ARO /CD133

células POS. Os dados são expressos como valores médios ± DP e são representativos de quatro experiências independentes. p 0,03. (B) ensaio de proliferação celular (BrdU). A linha pontilhada representa ARO /CD133

células NEG, linha contínua representa ARO /CD133

células POS. Os dados são expressos como valores médios ± DP e são representativos de quatro experiências independentes. p≤0.001. (C) a capacidade de auto-renovação da ARO /CD133

células POS. linha preta representa o número de ARO /CD133

células pos avaliados por citometria de fluxo. A linha a tracejado representa a viabilidade das células avaliadas pelo ensaio de MTT. (D) ensaio de formação de colónias em meio de metilcelulose de ordenada ARO /CD133

CD133

células NEG (40 × ampliação) (E) Número de colónias de ARO /CD133

pos e CD133 pos e

neg células após 15 dias de incubação (p 0,03).

tratamento de ARO /CD133

pos e CD133

células neg com drogas quimioterápicas

sensibilidade da droga foi avaliada pelo ensaio de MTT e BrdU. ARO /CD133

ARO /CD133

células neg pos e foram incubadas com diferentes concentrações de doxorrubicina, cisplatina e etoposídeo. ARO /CD133

células pos mostrou uma resistência ao medicamento notável para os três agentes comparação com ARO /CD133

células neg durante todo o período de cultura (p ≤ 0,05 para MTT e p≤0.001 para BrdU, respectivamente). Uma experiência representativa após 48 horas de cada tratamento é mostrada na Fig. 5A-F. Consistentemente com estes resultados, a apoptose avaliada pela caspase 3 atividade mostraram uma ativação dramática na ARO /CD133

neg em comparação com ARO /CD133

células pos em todos os pontos analisados ​​(Figura 6A, representativos de três experiências independentes com doxorrubicina ). Histogramas no ponto de tempo de 72 horas são mostradas na Figura 6B. Resultados semelhantes foram obtidos com as outras drogas utilizadas (dados não apresentados).

(A) análise de MTT depois de 48 horas de cultura na presença de 0,5, 1, 1,5 e 2 uM de doxorrubicina (B) após 48 horas na presença de 5, 10, 15 e 20 uM cisplatina (C) depois de 48 horas na presença de 10, 30 e 100 uM de etoposido. Os dados são expressos como valores médios ± desvio padrão e são representativos de três experiências independentes (p £ 0,05). (D) (E) (F) representam análises de BrdU nas mesmas condições de A, B, C (p≤0.001). A linha pontilhada representa ARO /CD133

células neg e linha contínua representa ARO /CD133

células pos em todos os gráficos.

(A) Caspase 3 atividade após tratamento com doxorrubicina. A linha pontilhada representa ARO /CD133

células NEG, linha contínua representa ARO /CD133

células POS. Os dados são expressos como média ± DP (p≤0.001). 3 atividade (B) Caspase no ponto de tempo de 72 horas, com doxorrubicina. linha preta representa coloração positiva para a caspase 3, linha cinza mostra controlo negativo com o anticorpo isotipo. Os dados são representativos de três experiências independentes.

In vitro

caracterização de ARO /CD133

células pos

Para caracterizar ainda mais a ARO /CD133

população pos, avaliou-se a co-expressão de outros marcadores de células estaminais. A expressão do mRNA da transcrição da tireóide factor-1 (TTF-1) em ARO /CD133

pos foi significativamente maior do que em ARO /CD133

células NEG, semelhante ao TAD-2 linha de células da tireóide fetal (controle positivo) ( A Fig. 7A). OCT-4 expressão foi de 91 ± 3% in /CD133

células pos ARO

vs

5 ± 1,5% em ARO /CD133

neg, sugerindo as características de células-tronco pluripotentes de ARO /CD133

pos células (Figura 7B). Estes dados foram confirmados por PCR semi-quantitativa, utilizando linha celular nTERA2 como controlo positivo (Figura 7C). Quantificação, expresso em relação ao nTERA2 densidade, apresentaram níveis OCT-4 mRNA em ARO /CD133

células neg quase duas vezes mais baixas do que em ARO /CD133

pos (35%

vs

62%, respectivamente , com nTERA2 = 100%)

(a) qRT-PCR de TTF 1-expressão de mRNA em ARO /CD133

CD133

células neg pos e.; linha celular de TAD-2 foi utilizado como controlo positivo. (B) A citometria de fluxo análise da OCT-4A no ARO /CD133

pos e ARO /CD133

células NEG. linha preta representa coloração positiva para OCT-4A, linha cinza mostra controlo negativo com o anticorpo isotipo. (C) RT-PCR semiquantitativo de mRNA OCT-4 em ARO /CD133

pos e ARO /CD133

células NEG. β-actina foi utilizada como controlo interno. A linha celular nTERA2 foi utilizado como controlo positivo. Os dados são representativos de três experiências independentes

A marcadores de células tronco membrana c-Kit -. Expressa na CES (células-tronco embrionárias) – e THY-1 – típicos da mesenquimais e células estaminais hematopoiéticas – foram negativos (dados não mostrados).

Discussão

nos últimos anos, vários estudos foram publicados confirmando a hipótese de que os tumores surgem de populações de células heterogéneas com diferentes propriedades biológicas. Recentemente, tem sido sugerido que as células estaminais, caracterizado pela auto-renovação e diferenciação capacidade, pode desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro [29], [30]. Desde múltiplas mutações que ocorrem ao longo de muitos anos, são necessários antes de uma célula torna-se cancerosa, as células com um longo tempo de vida tronco podem ser os melhores candidatos para a acumulação de células heterogéneas de indução de câncer, como [5], [31]. No entanto, ainda não está claro se ou não estes CSCs são originários de desdiferenciação de células maduras dentro dos órgãos ou de células-tronco residentes que adquirem progressivamente um fenótipo maligno [32].

ATC é um dos endócrina mais agressiva tumores caracterizados por um elevado grau de desdiferenciação [1]. A existência de células estaminais residentes da tiróide pode ser responsável por ambas a proliferação sustentada e heterogeneidade das lesões ATC [4]. Takano et ai. a hipótese de que uma relação estreita entre células estaminais e carcinogênese pode existir em ATC [17], [26], [33]. ATC perfil de expressão gênica sugeriu pelo menos três tipos de células indiferenciadas como sua origem: as células-tronco da tiróide, expressando onfFN mRNA mas não Tg, com elevado potencial de diferenciação, auto-renovação e capacidade de gerar carcinomas anaplásicos; thyroblasts, expressando tanto Tg e mRNA onfFN e folículos que não façam; prothyrocytes, que são mais diferenciadas do que as que expressam thyroblasts, Tg, mas não onfFN ARNm, com a capacidade de formar folículos. Mitsutake et ai. identificaram uma população muito pequena lado (SP), altamente enriquecidas em células estaminais, em várias linhas celulares de cancro da tiróide humana. No entanto, tanto SP

pos e SP

populações neg formado tumores quando transplantadas em ratinhos nus, o que demonstra que as células cancerosas tronco-like não são exclusivos ou idênticas às células SP [16].

No presente estudo, nós mesmos sustentam que ATC podem ser originários de células-tronco da tiróide. Descrevemos CD133

células pos com características fenotípicas de células-tronco, que crescem sem formar folículos. No entanto, entre as quatro linhas celulares analisadas, apenas ARO e KAT-4 mostraram alta porcentagem de CD133

células pos (64 ± 9% e 57 ± 12%, respectivamente; A Fig. 1A). Os nossos resultados são consistentes com observações recentes sobre linhas de células de hepatoma altamente agressivos, também caracterizadas pela percentagem muito elevada de CD133

células pos [34]. a alta expressão de CD133 em ATC pode ser, portanto, associado com a agressividade do tumor. No entanto, a ausência de marcador presente em linhas celulares de FRO KAT-18 e, sugere que a simples presença de CD133 não é suficiente e outros marcadores têm ainda de ser identificados. Além disso, como relatado por Takano et ai. [17], descobrimos que ARO e KAT-4 linhas de células expressa onfFN mas não Tg, TPO e NIS, confirmando o seu estado indiferenciado.

Para melhor caracterizar as características funcionais e fenotípicas destes CSCs putativos em ATC, estudamos ARO /CD133

células pos ordenadas. ARO /CD133

células pos apresentaram maior taxa de proliferação celular, em comparação com CD133

neg células (Fig. 4A e B). Além disso, a capacidade de auto-renovação de ARO /CD133

células pos foi confirmada por diminuição da CD133 expressão paralelo ao aumento da proliferação celular, o que sugere a divisão assimétrica, isto é, produção de CD133

pos e CD133

filha neg células. No entanto, outros do que a divisão assimétrica (por exemplo CD133 pós-transcricional down-regulation) mecanismos não podem ser excluídos. Mínimas percentagens de morte celular excluir que a diminuição da expressão de CD133 foi devido a apoptose ( 2%).

Outra confirmação que a maioria dos ARO /CD133

células pos podem ser células-tronco /progenitoras vem análise da expressão de outros genes relacionados com a “stemness”. Embora os marcadores de células-tronco c-Kit e Thy-1 foram negativas, uma forte positividade foi encontrada para OCT-4. Oct-4 pertence à família POU (Pit-Out-Unc) de factores de transcrição que medeia a pluripotência em CES através da inibição da ligação específica dos tecidos e promoção de genes de células-tronco [22], [23]. ARO /CD133

pos classificadas células foram fortemente positivas para OCT-4A, em comparação com ARO /CD133

células NEG, e sua expressão era semelhante ao da linha de células embrionárias teratoma nTERA2. Os iniciadores e o anticorpo monoclonal utilizado nas nossas experiências para a variante de splicing nuclear OCT-4A excluir qualquer contaminação pseudogene ou artefactos [24].

O factor de transcrição específico da tiróide nuclear TTF-1 é uma proteína de homeodomínio que contém pertencente para o NKX-2 classe de genes homeobox, que é necessária para o desenvolvimento adequado da tiróide e é utilizado como um marcador da tiróide e carcinoma pulmonar [35]. TTF-1 expressão foi encontrada significativamente maior em ARO /CD133

pos do que em ARO /CD133

células NEG, com níveis de mRNA comparável ao TAD-2 linha de células da tireóide fetal (controle positivo). Isto implica que, apesar de todas as linhas de células de ATC são desdiferenciado (expressão ausente de genes específicos da tireóide, como Tg, TPO e NIS e positividade para onfFN), em ARO /CD133

poscells um marcador de organogênese da tiróide ainda é mantida.

Além disso, a fim de caracterizar funcionalmente estas células estaminais-como câncer putativos, testamos sensibilidade às drogas quimioterápicas mais comuns usados ​​no ATC, ou seja, a cisplatina, doxorubicina e etoposida. A cisplatina reticula de ADN de várias maneiras diferentes que interferem com a divisão celular por mitose, doxorrubicina interage com o DNA por intercalação e a inibição da biossíntese de macromoléculas e etoposido inibe a enzima topoisomerase II [36] – [38]. ARO /CD133

pos células revelaram uma resistência significativa a todas as drogas utilizadas em cada ponto de tempo em comparação com ARO /CD133

células NEG, como demonstrado pelos níveis mais baixos de apoptose marcadamente detectados através da caspase 3 (Fig. 6). A indução potencial de moléculas anti-apoptóticos em vez de apoptóticos, ou o bloqueio do tirócito mecanismos de regulação celular volume de negócios fisiológicas, demonstrou em outras doenças da tiróide, tais como tiroidite auto-imune [39], poderia explicar a capacidade adquirida de tireóide células estaminais-como se tornar resistente à quimioterapia.