Abstract

A rs4245739 funcional A C polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) localizando no

MDM4

3 ‘não traduzida (3’-UTR) região cria um miR-191-5p ou miR-887-3p alvejando sites. Esta alteração resulta em diminuição da expressão de oncogene

MDM4

. Por isso, examinaram a associação entre este SNP eo risco de câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), bem como sua função reguladora em células SCLC. Os genótipos foram determinados em dois conjuntos de caso-controle independentes consistiu de 520SCLC casos e 1040 controles de duas regiões da China. odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram estimados por regressão logística. O impacto do SNP rs4245739 em miR-191-5p /miR-887-3p mediada

MDM4

regulação da expressão foi investigada através de ensaios de gene repórter de luciferase. Descobrimos que os genótipos

MDM4

rs4245739AC e CC foram significativamente associados com sensibilidade diminuída SCLC comparação com o genótipo AA em ambos os conjuntos de caso-controle (Shandong set: OR = 0,53, 95% CI = 0,32-0,89,

P

= 0,014; conjunto de Jiangsu: OR = 0,47, 95% CI = 0,26-0,879,

P

= 0,017). análises estratificadas indicaram que houve uma interação significativa multiplicativo entre rs4245739 e tabagismo (

P

interactioin = 0,048). Depois de co-transfecção de miRNAs e allelic- diferente

MDM4

repórter constrói em células SCLC, descobrimos que os dois miR-191-5p e miR-887-3p pode levar a diminuiu significativamente

MDM4

actividades de expressão na construção com C-alélicas 3′-UTR, mas não a-alélicas 3′-UTR, sugerindo uma correlação genótipo-fenótipo consistente. Nossos dados iluminam que o

MDM4

rs4245739SNP contribui para risco de CPPC e apoiar a noção de que gene 3′-UTR variantes genéticas, impactando miRNA de ligação, pode modificar SCLC susceptibilidade

Citation:. Gao F , Xiong X, W Pan, Yang X, Zhou C, Yuan Q, et al. (2015) A Regulatory

MDM4

genética Variant localizando na sequência de ligação de múltiplos MicroRNAs contribui para a suscetibilidade de pequenas células do câncer pulmonar. PLoS ONE 10 (8): e0135647. doi: 10.1371 /journal.pone.0135647

editor: Yifeng Zhou, Faculdade de Medicina da Universidade de Soochow, CHINA

Recebido: 18 Março, 2015; Aceito: 24 de julho de 2015; Publicação: 14 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento: o estudo foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China. (números de subvenção: 31271382 81201586; URL: https://www.nsfc.gov.cn/) ; o Programa Nacional de High-Tech Research e Desenvolvimento da China (números de subvenção: 2015AA020950; URL: https://www.most.gov.cn/); Fundos Fundamentais pesquisa para as universidades Central (números de subvenção: YS1407; URL: https://www.moe.edu.cn/); Beijing Projeto de Educação Superior Jovem Elite Professor (números de subvenção: YETP0521; URL: https://www.bjedu.gov.cn/); e Programa de Changjiang Estudiosos e Innovative Research Team na University (números de subvenção: IRT13045; URL: https://www.moe.edu.cn/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer no mundo, com mais than1,000,000 mortes por ano [1]. O cancro do pulmão é normalmente classificado como cancro do pulmão de células pequenas (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Embora representando apenas cerca de vinte por cento de todos os casos de câncer de pulmão, SCLC é muito mais agressivo em comparação com NSCLC [2,3]. Como um tumor maligno com mau prognóstico, SCLC mostra fração de alto crescimento, tempo de duplicação rápida e desenvolvimento precoce de metástases generalizadas [2,3]. Quando diagnosticada, a maioria dos doentes com CPPC têm metástases e mau prognóstico, se não tratada [3]. evidências epidemiológicas acumuladas indicam que o tabagismo pesado é o principal fator de risco ambiental desta doença [2,3]. avanços recentes no estudo de associação genômica ampla (GWAS) revelaram que várias novas variações genéticas estão associadas a suscetibilidade ao câncer de pulmão [4-12]. No entanto, a maioria dos estudos analisou ambos os subtipos de câncer de pulmão, ou apenas focada em NSCLC. Curiosamente, a maioria dos loci de risco identificados não influenciam significativamente o risco de câncer de pulmão diferencialmente por histologia, indicando que pode haver genética diferente impactos maquiagem risco de CPPC ou NSCLC [4-12]. Portanto, a descoberta de SNPs SCLC-risco associados novos pode ser um caminho potencialmente valiosa para iluminar etiologia de SCLC.

MDM4, também conhecido como MDMX ou HDMX, é uma proteína estruturalmente homóloga de MDM2. partes MDM4 um NH

2-terminal do domínio com MDM2 e podem inibir a actividade da p53 em várias malignidades [13-17] de ligação a p53. À medida que a guarda de genoma humano, as funções de p53 no centro de uma rede molecular complexa para mediar a supressão do tumor. Como um oncogene conhecido, MDM4 sobre-expressos em tumores humanos, incluindo o cancro do pulmão levou a actividades P53 deprimido e, assim, a tumorigénese. Em linha com esta, o modelo de rato com MDM4 overexpressed através da tecnologia transgênica mostrou carcinogênese espontânea durante a sua vida útil [18].

Há um

MDM4

3′-untranslatedregion (3′-UTR) rs4245739A C SNP localizar no local de ligação ao alvo para dois miARNs (mIR-191-5p e miR-887-3p) [19,20]. miR-191-5p e miR-887-3p poderia ligar-se selectivamente a

MDM4

3′-UTR com o alelo rs4245739C mas não 3′-UTR com o alelo. leads de ligação esta alélicas ‘miRNAs para níveis de expressão elevados de

MDM4

mRNA e /ou proteína entre rs4245739A alelo transportadoras com cancros [19-22]. Dois GWAS mostrou que o

MDM4

rs4245739 A-alelo está significativamente associado com aumento do risco de tanto câncer de próstata e câncer de mama [23,24]. Vários estudos de caso-controle utilizando estratégia de gene candidato também confirmou a associação positiva entre este polimorfismo e suscetibilidade de câncer de ovário, câncer de mama, carcinoma de células escamosas do esôfago e linfoma não-Hodgkin em diferentes populações étnicas [20,22,25,26]. No entanto, o envolvimento deste SNP funcional em SCLC ainda é em grande parte desconhecido. Considerando o papel essencial da MDM4 na carcinogênese, a hipótese de que o

MDM4

rs4245739 SNP pode contribuir para a susceptibilidade SCLC via regulação alélicas ofmiR-191-5p e /ou afinidade de ligação miR-887-3p e, por isso, MDM4 expressão. No presente estudo, foi realizado um estudo caso-controle de dois estágios de SCLC recrutados a partir da cidade de Jinan (província de Shandong, China) ea cidade de Huaian (província de Jiangsu, China). Além disso, para validar a função biológica desse polimorfismo, investigou-se a regulação alélica de miR-191-5p e miR-887-3p em MDM4 em células SCLC.

Materiais e Métodos

Estudo assuntos

Este estudo consistiu de dois conjuntos de caso-controle: set (i) caso-controle Shandong: 320 doentes com CPPC do Hospital Shandong Câncer, Shandong Academia de Ciências Médicas (Jinan, província de Shandong, China) e sexo- e (± 5 anos) pareados por idade 640 controles. Os pacientes foram recrutados entre junho de 2009 e novembro de 2014, Hospital do Câncer Shandong. indivíduos do grupo controle foram selecionados aleatoriamente de um pool de 4500 indivíduos de um programa de despistagem do cancro da comunidade para detecção precoce do câncer realizado na cidade de Jinan, tal como descrito em detalhe anteriormente [22]. (Ii) conjunto de caso-controle Jiangsu: 200 doentes com CPPC de Huaian No. 2 Hospital (Huaian, província de Jiangsu, China) e sexo e da mesma idade 400 controles. Os pacientes foram recrutados consecutivamente entre janeiro de 2009 e janeiro de 2015, Huaian No. 2 Hospital. Controles eram indivíduos sem câncer seleccionados a partir de um programa de despistagem do cancro da comunidade (3600 indivíduos) para a detecção precoce do câncer realizado na cidade de Huaian, tal como descrito em detalhe anteriormente [22]. Indivíduos que fumavam um cigarro por dia para mais de 1 ano foram consideradas como fumantes [22]. Todos os indivíduos eram independentes chineses Han étnicas. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Boards de Huaian No. Hospital 2 e Hospital do Câncer de Shandong, Shandong Academia de Ciências Médicas. consentimento informado por escrito foi obtido de cada assunto no recrutamento

SNP genotipagem

baseada em PCR polimorfismo de fragmentos de restrição (RFLP) foi utilizado para determinar

MDM4

rs4245739A . genótipos C tal como descrito em detalhe previamente [22,25,26]. Em resumo, os iniciadores utilizados para amplificar segmentos de ADN com o local rs4245739 (incompatibilidade a base está sublinhado) foram 5′-AAGACTAAAGAAGGCTGGGG-3 ‘e 5′-TTCAAATAATGTGGTAAGTGACC-3’. enzima de restrição

Msp

I (New England Biolabs) foi utilizado para digerir os produtos da RCP e distinguir os genótipos rs4245739. Uma amostra aleatória de 10% foi examinada mutuamente por uma pessoa diferente, e a reprodutibilidade foi de 98,7%. Além disso, a 5% das amostras aleatórias também foram testados através de seqüenciamento Sanger, ea reprodutibilidade foi de 100%.

plasmídeo construção

O

MDM4

rs4245739A e alélicas rs4245739C construções repórter foram preparado por amplificar parte do

região 3′-UTR do MDM4

de indivíduos homozigotos para o rs4245739AA ou rs4245739CC genótipo. Os iniciadores de PCR utilizados foram como se segue: 5′-AACTCTAGAGGTAGTACGAACATAAAAATGC-3 ‘e 5′-AACTCTAGACTGCATAAAGTAATCCATGG-3’, que inclui o

Xba I do sítio de restrição (sequências sublinhadas). Os produtos de PCR foram digeridos com

Xba I (New England Biolabs) e ligou-se, respectivamente, dentro de um vector pGL3-controlo apropriadamente digerido (Promega). As construções foram designadas aspGL3-rs4245739A e pGL3b-rs4245739C, respectivamente. As inserções foram confirmadas por sequenciação de ADN.

gene repórter da luciferase dupla ensaio

Um plasmídeo de luciferase de pirilampo repórter (pGL3-controlo, pGL3-rs4245739A ou pGL3-rs4245739C), um vector de luciferase de Renilla (PRL -SV40, Promega) mais 30 nMsmall RNAs (imita miR-191-5p, mir-887-3p imita ou RNAs de controlo negativo) (Genepharma, Guangzhou, China) foram co-transfectados em SCLCH446 células com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). A actividade de luciferase foi determinada 48h após a transfecção utilizando um sistema de ensaio de luciferase (Promega) como descrito anteriormente [27-29]. Três experiências de transfecção independentes foram realizados e cada um foi feito em triplicado. Fold aumento foi calculado definindo a atividade de vector-control pGL3 vazio como 1.

Análise estatística

Como descrito em detalhe anteriormente [22, 30-32], as diferenças nas variáveis ​​demográficas e distribuições de genótipos de

MDM4

rs4245739 SNP entre casos e controles foram calculados SCLC usando χ de Pearson

2 de teste. As associações entre o

MDM4

genótipos rs4245739 e risco SCLC foram estimados pelo odds ratio (OR) e seus intervalos de confiança de 95% (IC) calculado utilizando o modelo de regressão logística não condicional. Todas as RUP foram ajustadas para a situação idade, sexo e tabagismo, onde era apropriado. Testamos as hipóteses de nulidade de interação gene-covariável multiplicativo e partidas avaliadas a partir de modelos de interação multiplicativa, incluindo principais variáveis ​​de efeito e seus termos de produtos no modelo de regressão logística [30-32]. A

valor P

inferior a 0,05 foi utilizado como critério de significância estatística, e todos os testes estatísticos foram em frente e verso. Todas as análises foram realizadas com o pacote de software SPSS (versão 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultados

As freqüências alélicas e distribuições de genótipos de

MDM4

rs4245739SNP

A idade média foi de 57 anos (variação de 25-82 anos de Shandong definido; gama, 23-79 anos para conjunto de Jiangsu) para os pacientes e 57 anos (variação de 19-80 anos para conjunto de Shandong, variando de 20-81 anos para conjunto de Jiangsu) para os controles (Shandong definido:

P

= 0,615; conjunto de Jiangsu:

P

= 1,000). Não houve diferença significativa entre casos e controles na distribuição por sexo (Shandong set: 78,4% do sexo masculino encaixa vs. 76,4% nos controles;

P

= 0,480; Jiangsu set: 74,0% do sexo masculino encaixa vs. 71,3% nos controles ;

P

= 0,479). Isto indica que a frequência correspondente foi adequado (Tabela 1). No entanto, mais fumantes entre os doentes com CPPC foram encontrados no conjunto de caso-controle Shandong comparação com indivíduos de controlo (conjunto de Shandong: 77,8% vs. 34,2%,

P Art 0,001). Da mesma forma, existem doentes com CPPC mais que fumar do que os controles em conjunto Jiangsu (78,5% vs. 21,5%,

P Art 0,001). Além disso, foram observados mais pacientes com doença limitada do que entre aqueles com doença extensa em dois sets (Shandong set: 56,9% vs. 43,1%; conjunto de Jiangsu: 56,5% vs. 43,5%).

Como apresentados na Tabela 2, a frequência para o

MDM4

alelo rs4245739 C foi 0,038 e doentes com CPPC e controles saudáveis ​​0.073among do conjunto de Shandong, e 0,043 e 0,101 de conjunto Jiangsu. Todas as freqüências genotípicas observadas em ambos os casos e controles SCLC em conformidade com Hardy-Weinberg. Distribuições destes

MDM4

genótipos foram então comparados entre os casos e controles SCLC. As frequências de

MDM4

genótipos AA rs4245739 e CA ou CC entre os pacientes eram significativamente diferentes daqueles entre os controles em conjunto Shandong (χ

2 = 10,70,

P

= 0,005,

DF

= 2) (Tabela 2). Da mesma forma, as frequências de

MDM4

genótipos AA rs4245739 e CA ou CC entre os casos foram significativamente diferentes daqueles entre os indivíduos do grupo controle em conjunto Jiangsu (χ

2 = 12,84,

P = 0,002

,

df

= 2) (Tabela 2).

Associação entre

MDM4

rs4245739SNP e risco de CPPC

Associações entre genótipos de

MDM4

rs4245739 A C polimorfismo eo risco SCLC foram calculados usando análise de regressão logística não condicional (Tabela 2). Como mostrado na Tabela 2,

MDM4

rs4245739 alelo C actua como um alelo de protecção de SCLC. Indivíduos com o genótipo AC teve um OR de 0,52 (IC 95% = 0,31-0,87,

P

= 0,013) para o desenvolvimento de SCLC, em comparação com indivíduos com o genótipo AA. Diminuiu significativamente o risco SCLC foi observado também entre rs4245739 AC ou portadores de CC em comparação com os portadores de AA (OR = 0,53 IC 95% = 0,32-0,89,

P

= 0,014). As associações de risco SCLC com o

MDM4

rs4245739SNP foram ainda validados em um conjunto de caso-controle independente Jiangsu. A significativa diminuição do risco SCLC também foi associado com rs4245739 (AC: OR = 0,48, 95% CI = 0,26-0,88,

P

= 0,019; AC ou CC: OR = 0,47, 95% CI = 0,26-0,87 ,

P

= 0,017). Nas análises combinadas, descobrimos que o genótipo AC rs4245739 tiveram um risco 0,49-folddecreased para SCLC comparação com o genótipo AA (IC 95% = 0,32-0,75,

P

= 0,001), eo AC rs4245739 ou CC genótipo apresentaram um risco 0,50 folddecreased comparação com o genótipo AA (IC 95% = 0,32-0,76,

P

= 0,001) (Tabela 2). Todas as RUP foram ajustados para sexo, idade e tabagismo.

Foram examinados ainda mais o risco SCLC associada ao

MDM4

rs4245739genotypes por estratificação por idade, sexo, tabagismo e estágio da doença usando o pool dados de dois conjuntos de caso-controle chineses (Tabela 3). Na análise estratificada com a idade, rs4245739AC e CC genótipos foram significativamente associados com a diminuição do risco em indivíduos com idades entre 57 anos ou mais jovens (OR = 0,40, 95% CI = 0,21-0,74,

P

= 0,003), mas não no indivíduos com idade superior a 57 anos (OR = 0,63, 95% CI = 0,35-1,15,

P

= 0,134). Não houve interação significativa gene-idade (

P

interação = 0,274). Um risco significativamente reduzido de SCLC foi associada com CA e CC genótipos só no sexo feminino (OR = 0,33, 95% CI = 0,15-0,74,

P

= 0,007), mas não entre os homens (OR = 0,63, 95 CI% = 0,38-1,06,

P

= 0,083), em comparação com o

MDM4

genótipo rs4245739 AA. Não foi observada significativa interação gene-sexo (

P

interação = 0,135). Nós não encontrou significativamente menor risco (OR = 0,73, 95% CI = 0,42-1,28,

P

= 0,274) para os portadores com AC e genótipos CC em comparação com indivíduos com o genótipo AA em fumantes. No entanto, thers4245739AC e CC genótipos mostrou um 0,30 vezes diminuição do risco de desenvolver SCLC (IC 95% = 0,14-0,64,

P

= 0,002) em comparação com o genótipo AA em não fumantes. A interação fumadores gene multiplicativo existiu (

P

interactioin = 0,048). As associações entre rs4245739 CA e CC genótipos e risco SCLC foram observadas em ambos os pacientes com a doença em estágio limitado (OR = 0,52, 95% CI = ,32-,84,

P

= 0,008) ou a doença em estágio extensa (OR = 0,48, 95% CI = 0,24-0,97,

P

= 0,040) (Tabela 3).

relevância funcional ofrs4245739 em miRNA-mediada

MDM4

regulação

SNPrs4245739A C poderia levar a uma maior afinidade entre miR-191-5p /miR-887-3p e

MDM4

mRNA e diminuição

expressão MDM4

em várias doenças malignas [19 -22]. No entanto, seus impactos sobre

MDM4

regulação no SCLC ainda não estão claros. Como resultado, nós examinamos se há um efeito alelo-específico de rs4245739polymorphismon

expressão MDM4

em células SCLC por miR-191-5p e miR-887-3p. Os ensaios de expressão de luciferase relativa indicada que o miR-191-5p pode significativas inferiores actividades da luciferase em células SCLC H446 transfectadas com construções repórter rs4245739C alélicas comparação com RNAs de controlo negativos (

P

= 0,003) (Fig 1). Da mesma forma, miR-887-3p também regula

região 3′-UTR MDM4

com significativamente mais baixos actividades de luciferase em células H446 que expressam as construções rs4245739C alélicas em comparação com RNAs controle negativo (

P

= 0,014) ( Figura 1). No entanto, não houve tal depressão em H446 células com transfecção do repórter alélica rs4245739A constrói por ambas miARNs imita (Fig 1).

H446 células foram co-transfectadas com pRL-SV40 para padronizar a eficiência da transfecção. Fold aumento foi medida por definição a actividade das células co-transfectadas com ambos pGL3-rs4245739A ou pGL3-rs4245739Creporter construir e NC-ARN como 1. Todas as experiências foram realizadas em triplicado em pelo menos três experiências de transfecção independentes e cada valor representa a média ± SD . *

P Art 0.05compared uns com os da construção de luciferase por

t

-Testes. NC-ARN, ARN de controlo negativo; SCLC, cancro do pulmão de pequenas células.

Discussão

No presente estudo, foi investigada a associação entre o

MDM4

SNP funcional rs4245739 e risco de CPPC via um caso abordagem -control. Observou-se que os indivíduos com

MDM4

rs4245739 CA ou CC genótipos mostram redução significativa do risco SCLC comparação com os portadores do genótipo AA. Para revelar miR-191-5p /miR-887-3p mediada alélicas-regulação por este SNP, examinamos as actividades da luciferase em células SCLC transfectadas com diferentes construções repórter alélicas. As análises de correlação genótipo-fenótipo indicaram que ambos os miRNAs poderia inibir

expressão MDM4

apenas em células SCLC com construções C-alelo expressão, mas construções não A-alélicas. Estes resultados destacam o envolvimento de variantes genéticas funcionais em locais em etiologia SCLC miRNA-vinculativo.

evidências acumuladas demonstram que a composição genética pode ter contribuição direta de ao risco SCLC [33-35]. Curiosamente, referindo-se as bases de dados de perfil de expressão de genes para identificar os genes que são desregulados em SCLC e seus SNPs na 3′-UTR, Xiong et al identificaram uma susceptibilidade SCLC rs3134615 SNP G T pode inibir a interacção de miR-1827 com

MYCL1

3′-UTR, resultando em maior expressão constitutiva de MYCL1 [35]. Consistente com esta noção, também encontramos um

MDM4

SNP 3′-UTR alvo de miRNAs é associado com a susceptibilidade SCLC.

O

MDM4

polimorfismo rs4245739 demonstraram uma associação consistente com o risco de CPPC intwo conjuntos de caso-controle independentes, que não são susceptíveis de ser atribuível a fatores de confusão desconhecidos devido a ter aumentado significativamente os rácios ímpares com pequenas

valores P

. Além disso, a relação genótipo-fenótipo entre o polimorfismo rs4245739 e expressão do gene repórter apoia a nossa conclusão. Além disso, o

MDM4

rs4245739 SNP pode ser um componente de risco genético comum para diferentes tipos de câncer, o que foi provado pelo nosso grupo e outros, quer através de abordagem do gene candidato ou GWAS [19-26]. Por exemplo, nós já descobriram que rs4245739 AC e os genótipos CC foram significativamente associados com a diminuição do risco de câncer de esôfago [22], um tumor maligno de etiologia ambiental semelhante de SCLC (isto é pesada fumar). No entanto, pode haver várias limitações no estudo de caso-controle atual. Por exemplo, uma vez que todos os casos SCLC foram recrutados no hospital, viés de seleção inerente pode existir. Portanto, os resultados do nosso estudo mandado para ser validado em um estudo prospectivo de base populacional no futuro. tamanho relativamente pequeno da amostra para não-fumantes devem ser analisados ​​em uma população maior.

Em resumo, os nossos resultados sugerem que funcional

MDM4

rs4245739 SNP foi associada com uma redução significativa do risco SCLC em chinês populações Han. As associações entre SNPs e risco de CPPC são notáveis ​​em não fumantes. Dado este fato, são necessários mais esforços para examinar se

MDM4

polimorfismo genético rs4245739 pode ser usado como um potencial marcador de diagnóstico de CPPC.