Abstract
Fundo
Lisina demethylase específica 1 (LSD1) foi identificado e bioquimicamente caracterizado por epigenética, mas os papéis patológicos da sua disfunção no cancro do pulmão permanecem por ser elucidados. O objetivo deste estudo foi avaliar o significado prognóstico da expressão LSD1 em pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e definir o seu papel exacto no cancro do pulmão proliferação, migração e invasão.
Métodos
Os níveis de proteína de LSD1 em amostras cirurgicamente ressecados de pacientes com NSCLC foram detectados por imuno-histoquímica ou Western blot. Os níveis de ARNm de LSD1 foram detectados por qRT-PCR. A correlação da expressão LSD1 com características clínicas e prognóstico foi determinada por análise estatística. taxa de proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTS e imunofluorescência. migração e invasão celular foram detectados pelo teste do zero, ensaio de matrigel e transpoço ensaio de invasão.
Resultados
expressão LSD1 foi maior no tecido do cancro do pulmão mais do que em tecido pulmonar normal. Nossos resultados mostraram que a expressão excessiva de proteína LSD1 foram associados com menor sobrevida global dos pacientes com NSCLC. LSD1 foi localizada principalmente para o núcleo da célula do cancro. A interrupção da LSD1 utilizando siRNA ou um inibidor químico, pargilina, proliferação suprimida, migração e invasão do A549, H460 e células 293T. Enquanto isso, a sobre-expressão de crescimento celular aumentada LSD1. Finalmente, LSD1 foi mostrado para regular a transição epitelial-a-mesenquimal em células de câncer de pulmão.
Conclusões
Sobre-expressão de LSD1 foi associada com mau prognóstico no CPNPC, e promoveu a proliferação de células tumorais, migração e invasão. Estes resultados sugerem que LSD1 é um factor indutor de tumores com potencial terapêutico promissor para NSCLC
citação:. Lv t, Yuan D, Miao X, Y Lv, Zhan P, Shen X, et al. (2012) sobre-expressão de LSD1 promove a proliferação, migração e invasão em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (4): e35065. doi: 10.1371 /journal.pone.0035065
Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
Recebido: 22 de novembro de 2011; Aceito: 11 de março de 2012; Publicação: 06 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Lv et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é uma das principais causas de câncer morte no mundo. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é o tipo mais comum de câncer de pulmão [1]. A taxa de sobrevivência de 5 anos para o cancro do pulmão continua a ser deficiente. A fim de desenvolver terapias mais eficazes, é importante para se obter uma melhor compreensão da biologia molecular do cancro do pulmão.
As alterações genéticas são uma característica do cancro humano. Nos últimos anos, o campo genômica do câncer fez avanços significativos na identificação de lesões genéticas em câncer. Além disso, a importância de mudanças epigenética que ocorrem durante o desenvolvimento do cancro do pulmão, também tem sido reconhecido [2]. As mudanças epigenéticas estão associados tanto com a metilação do DNA e modificações de histonas [3]. modificações de histonas, tais como acetilação, fosforilação e metilação, estão os interruptores que alteram a estrutura da cromatina para permitir a activação pós-transcricional ou repressão de proteínas a jusante [4]. Compreender estas mudanças epigenéticas irá identificar novos genes relacionados com o cancro que podem representar alvos atraentes para o tratamento do câncer e fornecer novos insights sobre a biologia do câncer de pulmão. Assim, uma abordagem integrativa na pesquisa do câncer de pulmão, que combina dados epidemiológicos, genéticos e epigenéticos, emergiu como um conceito importante para a terapia do cancro [5].
O estado de metilação de metiltransferases de histonas e demethylases histona desempenha um papel fundamental na regulação da expressão do gene de [6]. Histona desmetilase lisina desmetilase específica 1 (LSD1), o primeiro desmetilase histona que foi descoberta como um homólogo nuclear de oxidases de amina, remove os grupos metilo a partir de mono- e dimetilada Lisina (Lys) 4 de histona H3 (H3K4me1 /2) e de Lys9 histona H3 (H3K9me1 /2) [7]. LSD1 é essencial para o desenvolvimento dos mamíferos e envolvidos em muitos processos biológicos, tais como o tipo de células de diferenciação e activação de genes e a repressão [8]. Um estudo recente indicou que LSD1 pode promover a transição de fase celular (deficiência em LSD1 levou à prisão parcial do ciclo celular em G
2 /M) e proliferação celular, sugerindo que a sua sobre-expressão pode promover tumorigênese [9]. A expressão de LSD1 tem sido associada com recorrência do tumor durante o tratamento em vários cancros, implicando ainda mais LSD-1 como um promotor de tumores [10] – [12]. Tissue análise de cDNA microarray também revelou LSD1 transactivação no pulmão e carcinomas colorrectais [11]. Derrubar de LSD1 com pequenos interferentes (SI) ARN resultou na supressão da proliferação de várias linhas de células da bexiga e cancro do pulmão [11]. No entanto, embora estes estudos demonstraram que LSD1 pode estar associado com a patogênese do câncer de pulmão, a expressão ea importância dos LSD1 em NSCLC é obscura.
Neste estudo, buscou-se investigar a expressão e função do LSD1 em NSCLC, sua relação com as características clínico-patológicas, e seu valor prognóstico para a sobrevivência de pacientes com NSCLC. Finalmente, também teve como objetivo determinar o papel exacto do LSD1 no cancro do pulmão proliferação, migração e invasão.
Materiais e Métodos
Pacientes e espécimes
espécimes cirúrgicos de 80 NSCLC pacientes obtidas no Chest Hospital Nanjing eo Hospital Jinling de janeiro de 2001 a dezembro de 2003 foram retrospectivamente coletados para estudo. Estes consistiu de 38 carcinomas espinocelulares e 42 adenocarcinomas, juntamente com amostras de tecidos não tumorais adjacentes pareados por paciente. Nenhum dos pacientes havia recebido radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. Todos os pacientes foram acompanhados por cinco anos após a operação, e os dados clínicos completos foram registrados eletronicamente. Todos os tecidos tumorais foram classificados de acordo com as diretrizes de classificação da Organização Mundial de Saúde. O estadiamento dos tumores seguiram a 7
th União Internacional de Classificação em critérios definidos câncer em 2009. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Jinling em Nanjing. Todas as amostras foram anónimos, e nenhum dos pesquisadores que realizam os experimentos tiveram acesso aos dados clínico-patológicos.
imuno-histoquímica (IHQ) Coloração
Todas as amostras foram fixadas em formol a 10%, embebidos em parafina, seccionado consecutivamente a 5 mm e coradas pelo HE. Os cortes foram desparafinados e reidratadas acordo com o protocolo de rotina. As secções foram incubadas durante a noite com os anticorpos específicos LSD1 primário (diluição 1:100; Cell Signaling, Danvers, MA, EUA). As lâminas foram incubadas durante 30 min com imunoglobulinas de cabra anti-coelho (E0432; Cell Signaling) depois de ter sido lavada com solução de NaCl tamponada com Tris. As lâminas foram então incubadas durante 30 min com despojado complexo AB /AP (K0391; Dako, Pequim, China). A contracoloração foi realizada com hematoxilina. A percentagem de células positivas foi determinada pela contagem de 500 células em cinco áreas aleatórias por secção. Resultados imunomarcação nuclear para LSD1 foram avaliados utilizando um sistema de semi-quantitativa marcando Remmele [13], o qual calcula a intensidade da coloração e a percentagem de células positivas. IHC coloração foi pontuada de acordo com os seguintes critérios: -, nenhuma das células coradas; +, 1-40% das células coradas; ++; 40-70% das células coradas; +++, 70-100% das células coradas. pontuação IHC de expressão LSD1 foi [0 (negativo) ≤ pontuação 2+] e [2 + ≤ pontuação ≤3 +], o que representou baixa e alta expressão, respectivamente.
Western Blot
Os tecidos tumorais de câncer de pulmão e tecidos não tumorais adjacentes foram homogeneizadas . Total de proteínas (30? G) a partir de amostras clínicas ou culturas de células foram separadas por electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio, seguido de electrotransferência para uma membrana de nitrocelulose pela utilização de uma célula de transferência (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Western blot foi realizada por incubação sequencial de leite em tampão de bloqueio 5% sem gordura à temperatura ambiente durante 60 min, seguido de anticorpo primário, quer contra LSD1 (1:500; Cell Signaling), AcH3K9, TWIST1, E-caderina, N- caderina ou β-actina, a 4 ° C durante a noite, e finalmente anticorpos de peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho secundário (1:5000) à temperatura ambiente durante 90 min. bandas imuno foram detectados por reacção com os reagentes ECL sistema de detecção (Amersham, Arlington Heights, IL, EUA) e exposição a filme de raios-X, que foi o desenvolvido e fotografadas.
mRNA Extração e quantitativa de transcrição reversa ( qRT) -PCR
os tecidos foram homogeneizados e ARNm celular total foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O cDNA foi transcrito usando M-MLV de transcriptase reversa (Promega, Madison, WI, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. qRT-PCR foi realizado usando o kit de FastStart Universal mistura SYBR Green mestre (Roche, San Francisco, CA, EUA). Os níveis de ARNm relativos de LSD1 foram normalizadas para os níveis do gene GAPDH de limpeza e calculada pelo método 2-ΔΔCt. Foram utilizados os seguintes iniciadores: GAPDH, a seguir: 5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3 ‘e inverso: 5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTG-3′; LSD1, frente: 5’-GAAACTGGAATAGCAGAGAC-3 ‘e inverter: 5′-GGTGGACAAAGCACAGTATCA-3’.
cultura de células, transfecção e Tratamento
A549, H460 e células 293T foram obtidos a partir de a American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina e 100 ug /mL de penicilina /estreptomicina. O plasmídeo Bandeira-LSD1 (3UG); gentilmente fornecida pelo Dr. Yang Shi, University of Southern California, Los Angeles, CA, EUA), a sobre-expressão do plasmídeo LSD1 (3 ug) e LSD1 siRNA (3 ug) foram transfectados em células A549 e H460 linhas em placas de 6 poços (1 ug /mL) utilizando o reagente de lipofectamina (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Pargilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), um inibidor da monoamina-oxidase, foi utilizado para bloquear quimicamente demetilação mediada por LSD1 [14]. As células foram tratadas com pargilina durante 48 h, e, em seguida, foram submetidos ao ensaio MTS. Os dados são apresentados como vezes de mudanças em unidades relativas de luz /miliunidades de pargilina, e representam a média de três experiências independentes.
proliferação celular, crescimento, MTS Ensaios
Para o ensaio crescimento celular, 50.000 células /poço foram semeadas em triplicado numa placa de 24 poços com meio de crescimento completo. As células foram contadas ao longo de seis dias, utilizando um hemocitômetro. Para o ensaio de MTS (Promega), 500 células /poço foram semeadas em triplicado numa placa de 96 poços para cada linha celular. Aos 12, 24, e 48 h, 20 mL de reagente MTS foi adicionada a cada poço, incubou-se durante 1 h a 37 ° C, e os resultados foram analisados por um leitor de placas a 490 nm. Os dados da amostra foi normalizada para leituras de fundo de mídia só.
Cultura celular tridimensional, Collagen Invasion Ensaio, e zero Ensaio
culturas de membrana basal tridimensional foram estabelecidas como descrito anteriormente [15 ]. Resumidamente, 5000 células /poço foram cultivadas em matrigel% 2 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) com o factor de crescimento epidérmico (EGF) em uma camada de base de matrigel 50%. O ensaio de invasão de colagénio foi realizado como anteriormente descrito [16]. Resumidamente, 5000 células /poço foram semeadas em 2% de matrigel sobre uma camada de colagénio 01:01 (BD Bioscience) a mistura de matrigel. o crescimento da cultura foi registada no dia 5. Para o ensaio de zero, as células foram cultivadas em meio de crescimento completo, até 90-100% de confluência foi atingido. Uma ferida três milímetros foi introduzido em todo o diâmetro de cada placa. A migração celular foi observada por microscopia às 24 e 48 h mais tarde.
A, B) expressão LSD1 foi regulada para cima no pulmão tecido de câncer escamoso. As setas indicam células cancerosas LSD1-positivas, que foram localizados nos núcleos das células. Ampliação: A, × 20; B, × 60. (C, D) expressão LSD1 foi regulado para cima em tecido de câncer adenocarcinoma de pulmão. Ampliação: C, × 20; D, × 60. (E, F) IHC revelou que a expressão LSD1 foi fraca em tecidos pulmonares normais. Ampliação: E, × 20; F, × 60. pontuação IHC de expressão LSD1 foram: baixo, [0 (negativo) ≤ pontuação 2+]; alta, [2 + ≤ pontuação ≤3 +].
P Art 0,05. Indicados diferenças estatisticamente significativas entre os grupos
(A) O nível de proteína de LSD1 no tecido de câncer de pulmão foi significativamente maior do que no tecido normal (
P
0,01), como detectado por Western blot. β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. (B) Amostra de 122, 206 e 207 são mostradas como representantes dos três grupos: N, tecidos pulmonares normais: C, tecidos NSCLC; P, tecidos paracarcinoma. O nível de ARNm de LSD1 (C) foi detectado por qRT-PCR, e a expressão de ARNm de LSD1 foi significativamente superior no tecido tumoral do que no tecido normal (
P
0,05).
linhas azuis representam níveis elevados de expressão LSD1, e linhas vermelhas representam baixos níveis de expressão em amostras de LSD1 NSCLC. (A) pacientes com NSCLC com níveis de proteína LSD1 menores tiveram melhor prognóstico. (Não ajustados
P
-valor = 0,0003; casos de expressão baixos, casos n = 52 e elevada expressão, n = 28). (B) Pacientes com baixos níveis de mRNA de LSD1 também tinham maior sobrevida (
P Art 0,05).
Análise Estatística
Estudante de
t
-test e ANOVA foram utilizados para investigar as associações entre a expressão LSD1 e fatores clínicos (idade, sexo, tabagismo, estágio do tumor, histologia, tamanho do tumor, o estado nodal, e sobrevida global). análise de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar o grau de correlação linear entre duas variáveis. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada para determinar o valor prognóstico da LSD1 e teste log-rank foi utilizado para comparar a igualdade das duas curvas de sobrevivência. A
P
-valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo e
P Art 0,01 foi considerado altamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS v17.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, EUA).
Resultados
LSD1 Expressão foi regulada em tecidos tumorais NSCLC
em primeiro lugar, examinou os níveis de LSD1 expressão em 80 tecidos tumorais NSCLC e 20 tecidos normais do pulmão por coloração IHC. expressão alta LSD1 foi detectado nos núcleos de células malignas, enquanto fraca coloração foi observada ao longo dos tecidos não-neoplásicas (Fig. 1). Especificamente, observou-se a expressão de LSD1 em 90,0% dos carcinomas do pulmão (72/80) e 10.0% de espécimes pulmonares benignos (2/20). Altos níveis de expressão LSD1 (pontuação: ++ – +++). foram detectados em 37 (46,3%) tecidos tumorais de pacientes com NSCLC
A seguir, examinou expressão LSD1 em 40 tecidos tumorais NSCLC selecionados aleatoriamente, pulmão paracarcinoma tecidos, e tecidos normais do pulmão por Western blotting. Os resultados revelaram um aumento estatisticamente significativo da expressão LSD1 em tumores, em comparação com os tecidos normais do pulmão utilizando β-tubulina como a referência (bicaudal emparelhado
t
-test, n = 40,
P
0,01) (Figura 2A).. O nível de proteína de LSD1 em amostras 122, 206, e 207 é mostrado na Figura 2B.
Para validar ainda mais os resultados de proteína acima, foram também examinados os níveis de mRNA de LSD1 nestes 40 tecidos de tumor e normal NSCLC seleccionados tecidos pulmonares por qRT-PCR utilizando GAPDH como referência. Nós descobrimos que o nível de mRNA de LSD1 em tecidos de câncer (TC = 19,9 ± 1,01) foi significativamente maior do que nos tecidos pulmonares normais (TC = 22,1 ± 0,9) (bicaudal emparelhado
t
-teste, n = 40,
P Art 0,05) (Fig 2C)
Expression LSD1 foi associada com sobrevida global
Para avaliar o significado clínico da LSD1 sobre-expressão em.. câncer de pulmão, analisamos se os níveis de expressão LSD1 foram associados com sobrevida global em NSCLC. Como a Tabela 1 mostrado, níveis elevados de proteína de LSD1 foram significativamente associados com a sobrevivência (χ
2 = 12,87,
P
= 0,0003), mas não correlacionada com nenhuma das características clínico-patológicas (incluindo idade, hábito de fumar , sexo, diâmetro do tumor, tipo histológico, invasão pleural visceral, estágio patológico, ou tipo de operação; tudo,
P Art 0,05). Durante o período de acompanhamento de 5 anos, 52 de pacientes 80 (65%) NSCLC morreram como resultado da progressão da doença. As curvas de Kaplan-Meier indicou que pacientes com aumento da expressão LSD1 (28 casos) tiveram uma sobrevida global significativamente menor do que aqueles com menor expressão LSD1 (52 casos) (
P
= 0,0003) (Fig. 3A).
A expressão de LSD1 nas células de cancro do pulmão A549 e H460 foi maior do que nas células 293T. O nível de proteína na linha celular H460 foi maior do que na linha celular A549. β-actina foi utilizado como controlo de carga.
A série de curvas representam a proliferação celular, a 0 h até 48 h após a exposição a diferentes concentrações de tratamento de pargilina e transfecção com os diferentes plasmídeos. (A) O inibidor LSD1, pargilina (de cima para baixo: 1 mM, 2 mM, 3 mM e 4 mM), e LSD1 siARN inibiu a proliferação da linha de células A549. A proliferação de células A549 foi significativamente diminuída nos diferentes grupos, em comparação com os controlos (*
P
0,05). (B) Pargilina inibiu a sobrevivência linhagem celular H460. Além disso, foi observado um efeito inibitório forte na linha celular H460, mas não houve diferenças significativas entre as duas linhas celulares. A proliferação celular H460 foi significativamente diminuída nos diferentes grupos de concentração, em comparação com os controlos (*
P
0,05). (C) Pargilina inibiu a sobrevivência da linha celular 293T. (D) A curva de proliferação após a transfecção do plasmídeo Bandeira-LSD1 na célula A549 e transfecção de plasmídeo LSD1 siRNA na célula H460. Nas células A549, a proliferação foi significativamente maior após a transfecção do plasmídeo Bandeira-LSD1, em comparação com o controlo pCMV5-transfectadas (*
P
0,05). Em células H460, a proliferação foi significativamente mais baixa depois da transfecção de plasmídeo LSD1 o siARN, como comparado com as células transfectadas com o plasmídeo de controlo (siARN *
P
0,05).
As imagens são apresentadas em ampliação de × 20. fluorescência verde, vermelho e azul representam LSD1, BrdU e Topro-3, respectivamente. A proliferação aumentou significativamente nas células A549 após a transfecção do plasmídeo Bandeira-LSD1. No entanto, diminuiu a proliferação nas células H460 após a transfecção do plasmídeo LSD1 siARN. pargilina tratamento reduziu a proliferação em ambas as linhas celulares. Topro-3 mostra a coloração de localização nuclear, e a coloração BrdU mostra as células em proliferação.
A velocidade de migração diminuiu gradualmente a partir de 6 h a 48 h após a transfecção do plasmídeo LSD1 ARNsi nas células H460, que estava significativamente diferente da velocidade às 24 h e 48 h (*
P
0,05). A taxa de migração aumentou gradualmente após a transfecção do plasmídeo Bandeira-LSD1 para as células A549, o que foi significativamente diferente da velocidade às 24 h e 48 h (*
P
0,05). Todos os grupos de transfecção foram significativas diferente dos grupos de controlo (*
P Art 0,05).
De acordo com este, nós também determinou que a maior expressão de mRNA de LSD1 foi associado com diminuição da sobrevida global em pacientes com NSCLC (
P Art 0,05). (.. Fig 3B)
LSD1 Promovido Proliferação em linhas celulares de cancro do pulmão
A expressão de LSD1 foi inferior na célula A549 do que na linha celular H460, tal como mostrado na Figura 4. Assim, o plasmídeo da Bandeira-LSD1 foi transfectado para as células A549 e o plasmídeo LSD1 siARN foi transfectado para as células H460. As células epiteliais normais 293T foram usadas como um controlo negativo.
detectado o valor de OD A549, H460 e células 293T por MTS para gerar curvas de crescimento celular. Em todas as três linhas de células, a proliferação celular diminuiu com o tratamento ao longo de pargilina de um modo dependente da concentração. Foi nomeadamente menor no grupo 4 tratado com mM do que nos grupos de 1 ou 2 mm- tratada mm. Além disso, foi também mais baixa no grupo tratado com 1 mM do que no grupo tratado com 3 mM; No entanto, não houve diferença entre os grupos 1 e 2 mm- tratados com mM ou o 3 mm- e grupos tratados com 4 mm (
P
0,05)., como mostrado na Figura 5A-C
a quantidade de células atravessado foi significativamente maior para células A549 transfectadas com o plasmídeo Bandeira-LSD1; no entanto, a transfecção de LSD1 siARN plasmídeo nas células H460 levaram a uma diminuição da quantidade de células invasivas. Os números de células invasoras de ambos os grupos de transfecção foram significativas diferente do grupo de controlo (*
P Art 0,05).
A expressão da H3K9 total de não mudou notavelmente. Quando a actividade LSD1 foi regulado para cima, TWIST1 e N-caderina e AcH3K9 expressão aumentada e a expressão de E-caderina diminuiu. Quando a atividade LSD1 foi regulada para baixo, TWIST1 e expressão N-caderina diminuiu e AcH3K9 e expressão da caderina-E aumentou. O plasmídeo Bandeira-LSD1 foi transfectado para a linha celular A549, e o plasmídeo LSD1 siARN foi transfectado para a linha celular H460. β-actina foi utilizado como controlo de carga
A proliferação aumentou significativamente no grupo A549 após a transfecção do plasmídeo Bandeira-LSD1 (
P
0,05).; No entanto, diminuiu significativamente no grupo de H460 após a transfecção do plasmídeo LSD1 siRNA (
P
0,05). O plasmídeo pCMV foi utilizado como controlo no grupo A549 transfecção, e o plasmídeo de controlo LSD1 siARN foi usado no grupo de transfecção de células H460 (Fig. 5D).
ainda identificado o papel de LSD1 em A549 e proliferação de células H460 por coloração por imunofluorescência. A mudança no número de células em proliferação foi observada por coloração BrdU. Os resultados demonstraram que a proliferação de células aumentou significativamente após a transfecção do plasmídeo que sobre-expressam LSD1 na linha celular A549. Enquanto isso, a proliferação celular diminuiu nas células H460 transfectadas com o plasmídeo LSD1 siARN. Ele diminuiu em ambas as linhas celulares após tratamento pargilina, como mostrado por coloração de imunofluorescência (Fig. 6), o que também confirmou que LSD1 está envolvida na proliferação de células tumorais.
LSD1 promovido a migração de células do cancro do pulmão
a migração celular foi investigada pelo ensaio de célula do zero. Comparado com o grupo controle, o número ea taxa de células que migraram foi gradualmente reduzida após transfecção com o plasmídeo LSD1 siRNA nas linhas de células H460. As células que migram atingiu um pico às 48 h, como mostrado na Figura 7A. Em contraste, o número de células que migraram foram significativamente aumentados na linha celular A549 após transfecção com o plasmídeo da Bandeira-LSD1, em comparação com o grupo de controlo (
P
0,05). A velocidade relativa de migração é mostrado na Figura 7B.
O papel de LSD1 em Pulmão Cancro Invasão
A capacidade das células para atravessar Matrigel indicou a invasividade do A549 e linhas de células H460. células H460 transfectadas com o plasmídeo LSD1 siRNA foram menos invasivo do que o grupo controle (
P Art 0,05). As células A549 transf ectadas com o plasmídeo da Bandeira-LSD1 eram mais invasiva do que as células de controlo e células tratadas com pargilina (ambos,
P
0,05). A quantidade de células que atravessam através da membrana basal Matrigel invadindo é mostrado na Figura 8.
LSD1 regulado epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) em células de cancro de pulmão
Para investigar se regula a LSD1 transição EMT em células de cancro do pulmão, foi examinada a expressão do EMT transcricional TWIST1 chave repressor e os marcadores EMT e-caderina e N-caderina em células A549 LSD1-sobre-expressando (transfectadas com a bandeira-LSD1 LSD1 sobre-expressando plasmídeo) e LSD1 derrubado H460 células (transf ectadas com o plasmídeo LSD1 ARNsi, ou tratadas com pargilina 4 mM). Foram examinados os efeitos sobre H3K9, AcH3K9, TWIST1, E-caderina e N-caderina induzida por alteração da actividade LSD1. Enquanto expressão da H3K9 total foi afetada, LSD1 sobre-expressão levou à diminuição da acetilação H3K9 e E-caderina expressão e aumenta em TWIST1 e expressão N-caderina. Enquanto isso, os níveis de acetilação H3K9 e expressão de E-caderina foram aumentados em LSD1 derrubar células, sugerindo que a expressão LSD1 pode ser correlacionada com AcH3K9, TWIST1, E-caderina e N-caderina, tal como mostrado na Figura 9.
Discussão
nos últimos anos, a epigenética tornou-se um tema quente na investigação oncológica. O saldo de metilação e demetilação na modificação epigenética afeta a expressão de genes e atividade celular. Estudos têm demonstrado que aberrantes de metilação da histona lisina no câncer está associada não só com a repressão da cromatina relacionado a genes específicos, mas também com a repressão de regiões cromossômicas grandes. alterações em Epigenetic LSD1 demonstraram desempenhar um papel-chave na carcinogénese [17]. LSD1 pode evitar a acumulação dos grupos dimetil de p53, reprimindo mediada por p53 transcricional-regulação, impedindo a apoptose, e contribuindo para a carcinogênese humana através de um mecanismo de modificação da cromatina
.
Até o momento, poucos estudos têm implicado LSD1 em NSCLC. Hayami
et al.
Demonstraram que siRNAs específicos de LSD1 significativamente derrubado expressão LSD1 e resultou na proliferação reprimida de várias células de câncer de pulmão [11]. No entanto, a associação entre LSD1 ea sobrevivência de pacientes com NSCLC não foi bem definido, e o papel da LSD1 na proliferação, migração e invasão em NSCLC era obscura. Nosso estudo investigou as associações de expressão LSD1 e características clínicas de pacientes com NSCLC diagnosticados como fase I /II. A fim de demonstrar que as alterações epigenética foram associados a alterações genéticas no cancro do pulmão, foi investigada a expressão de primeira LSD1 em amostras clínicas NSCLC.
Estudos anteriores demonstraram que a proteína LSD1 e os níveis de ARNm poderia actuar como biomarcadores para pacientes com tumores mais agressivos de câncer de mama, câncer de próstata, e neuroblastoma [18] – [20]. Em nosso estudo, detectamos LSD1 por análise IHC, Western blot e qRT-PCR. Um ponto forte desta pesquisa é a constatação de que a expressão de LSD1 foi significativamente correlacionada com sobrevida global dos pacientes com NSCLC. Nossa pesquisa investigou o papel de LSD1 em NSCLC. Outros estudos sobre LSD1 em outros tipos de tumores pode revelar que pacientes com níveis mais elevados de LSD1 (independentemente do mRNA ou proteína e /ou independentemente do tipo de tumor primário) têm pior sobrevida do que pacientes com níveis mais baixos de LSD1.
ainda demonstrado que LSD1 era importante para a proliferação de células de cancro e invasão. activação da proliferação, a migração e a invasão de células de tumor induzida por LSD1 foi inibido por pargilina. A regulação negativa da expressão LSD1 por siRNA em linhas de células de tumor levou a um aumento do crescimento celular, migração e invasão. Estes dados sugerem que LSD1 podem influenciar a transformação de células de tumor e podem também promover a EMT no epitélio pulmonar. Mais pesquisas precisam ser realizadas a fim de determinar se a sobre-expressão de LSD1 é um evento cedo ou mais tarde na tumorigênese de pulmão e que o mecanismo de sobre-expressão é. Nós apresentamos dados que sugerem que LSD1 é regulada para cima no cancro do pulmão via de promoção de tumor e que atua para aumentar o crescimento celular, migração e invasão, e para restaurar um fenótipo epitelial transformado. supressão farmacológica da LSD1 pode representar uma abordagem promissora para o tratamento de NSCLC.
Além disso análise funcional é necessária para determinar a rede reguladora do LSD1. análise transcricional revelou que os complexos LSD1 /NURD regular várias vias de sinalização celulares [21], incluindo a via de sinalização de TGF-p1 que está criticamente envolvida na proliferação de células, a sobrevivência, e a transição epitelial-mesenquimal-a. Nós demonstramos que LSD1 promoveu a invasão e potencial metastático de células de câncer de pulmão
in vitro
. Nós também descobrimos que LSD1 é regulado para cima em carcinomas pulmonares e que o seu nível de expressão está negativamente correlacionada com a de AcH3K9, TWIST1 e N-caderina, e positivamente correlacionada com a de E-caderina. Nossos dados fornecem uma base molecular para a interação de desacetilação da histona na remodelação da cromatina, indicando que LSD1 pode afetar a EMT e acetilação da H3K9.
O aberrante sobre-expressão de LSD1 no cancro do pulmão pode torná-lo um bom candidato como um alvo terapêutico molecular [11]. Este tipo de informação também indica que devemos continuar o desenvolvimento da nova terapia anticâncer com base no estado epigenético. Como tem implicações para a descoberta de marcadores epigenéticos, uma questão importante a resolver é como definir potenciais alvos para a terapia epigenética. medicamentos de primeira geração segmentação relativamente promíscuas de metilação de DNA e de acetilação das histonas modificadores tiveram sucesso no tratamento de cancros hematológicos [22]. Se a inibição LSD1 leva a significativas de-repressão de alguns genes, LSD1 pode ser um alvo importante para a terapia alternativa. epigenética controlo da regulação de genes é um campo em rápido desenvolvimento com potencial substancial, e oncologia é provável que seja a aplicação terapêutica em que o andamento mais rápido é feita. Até à data, os inibidores sintéticos de histona-desacetilases clássicas têm sido amplamente utilizados como ferramentas para estudos biológicos epigenética, e alguns têm avançado para estudos clínicos. Além disso, o desenvolvimento de inibidores da metiltransferase de histona e desmetilase foi recentemente relatado [21], [23]. No cancro do pulmão, a sobre-expressão de LSD1 deve contribuir para a repressão do gene para inibir o crescimento celular e progressão maligna, mas em que há um efeito real de LSD1 permanece desconhecida. Pretendemos investigar esta em estudos futuros.
Em conclusão, constatamos que LSD1 foi sobre-expressa em pacientes com NSCLC, por meio cedo para estágios finais da carcinogênese. LSD1 está presente no núcleo e promove a proliferação, possivelmente através da regulação de uma grande variedade de funções de cromatina. Enquanto isso, a sobre-expressão de LSD1 promovido de células de tumor a proliferação, migração e invasão. Além disso validação com análises funcionais desta proteína no contexto da carcinogénese humana pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o cancro do pulmão.