Sumário

Bmi1 é abundante em uma variedade de cancros humanos incluindo cancro gastrointestinal. O nível de expressão de proteína de alta Bmi1 está associada com mau prognóstico de pacientes com câncer gastrointestinal. Por outro lado, macrófagos associados a tumores (TAMs) contribuir para o crescimento do tumor, invasão e metástase através da produção de vários mediadores no microambiente tumoral. O objetivo deste estudo foi investigar a regulação TAM-mediada de expressão Bmi1 em câncer gastrointestinal. A relação entre a expressão e TAM Bmi1 foi analisada por imuno-histoquímica e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), e os resultados mostraram uma correlação positiva com os macrófagos que se infiltram no tumor (CD68 e CD163) e expressão Bmi1 em células cancerosas. Co-cultura com TAMs desencadeada expressão Bmi1 em linhas celulares de cancro e maior capacidade de formação de esfera. miRNA análise de microarray de uma linha de células de câncer gástrico co-cultivados com macrófagos foi realizado, e usando

in silico

métodos para analisar os resultados, identificou-miR-30e * como um regulador potencial de expressão Bmi1. Os ensaios de luciferase, utilizando o miR-30e * mímico Bmi1 revelou que era um alvo directo para miR-30e * por interacções com o putativo miR-30e * sítios de ligação na região não traduzida a 3 Bmi1 ‘. análise de qRT-PCR de amostras de cancro ressecados mostrou que o miR-30e * expressão foi regulada negativamente em regiões de tumor em comparação com regiões não-tumorais, e expressão Bmi1 foi inversamente correlacionada com miR-30e * expressão em tecidos de cancro gástrico, mas não em tecidos de cancro do cólon . Nossos resultados sugerem que TAMs podem provocar um aumento da expressão Bmi1 através * supressão de miR-30e, levando a progressão do tumor. A supressão da expressão Bmi1 mediada pela TAM pode, portanto, representam uma possível estratégia como o tratamento de câncer gastrointestinal

Citation:. Sugihara H, Ishimoto T, Watanabe M, Sawayama H, Iwatsuki M, Baba Y, et al. (2013) Identificação de miR-30e * Regulamento de Bmi1 Expressão Mediada por Tumor-Associated macrófagos em Câncer Gastrointestinal. PLoS ONE 8 (11): e81839. doi: 10.1371 /journal.pone.0081839

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 04 de julho de 2013; Aceito: 17 de outubro de 2013; Publicação: 28 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sugihara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo Fundo Memorial Okukubo de Pesquisa médica em Kumamoto University School of Medicine, Prêmio Estímulo de Investigação médica da Associação Japonesa de Medicina e Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid para a Investigação científica (para TI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Bmi1 é um membro do complexo repressor Polycomb-1 com um papel essencial na manutenção da cromatina silenciamento [1,2]. Bmi1 desempenha uma função na auto-renovação das células estaminais neuronais e hematopoiéticas através da repressão do locus INK4a /ARF [3-6]. Além disso, Bmi1 é expresso em células-tronco intestinais e implicados na manutenção do epitélio do intestino delgado [7]. Bmi1 foi identificado pela primeira vez como um oncogene que coopera com c-myc durante lymphomagenesis rato, e é sobre-expresso numa variedade de cancros humanos, incluindo o cancro gastrintestinal [8-10]. Além disso, o nível de proteína Bmi1 expressão está associada com mau prognóstico de pacientes com câncer gastrointestinal [9,10]. No entanto, o mecanismo subjacente a regulação Bmi1 em células cancerosas é em grande parte desconhecida.

tumores sólidos consistem das células cancerosas e vários tipos de células do estroma, os fibroblastos, células endoteliais e células hematopoiéticas, principalmente macrófagos e linfócitos. Os macrófagos têm plasticidade funcional e são descritos por dois estados distintos de polarização: classicamente-activado (M1) e alternativamente activados (M2) fenótipos de macrófagos. Estudos anteriores revelaram que os macrófagos e M1-M2-polarizadas desempenham diferentes papéis funcionais no microambiente tumoral [11,12]. macrófagos M1-polarizados de um modo geral que apresenta antigénios funções e actividade tumoricida. Em contraste, os macrófagos M2-polarizadas desempenham um papel na resposta aos parasitas, cicatrização de feridas, remodelação de tecidos, e promover o crescimento e a vascularização de tumores. Em muitos cancros humanos, macrófagos associados a tumores (TAM) contribuir para o crescimento do tumor, invasão e metástase através da secreção de vários mediadores, por isso, foi proposto que a TAM eram predominantemente polarizado para M2 macrófagos fenótipo [13-17]. Por outro lado, os estudos mais recentes demonstraram que os macrófagos eram muito células de plástico, e as suas alterações epigenética reprogramado TAM a partir de um M2 para um fenótipo M1-como em tumores [17,18].

MicroRNAs (miARNs) são ARN (21-23 nucleótidos) que se ligam de forma imperfeita a região 3 ‘não traduzida (UTR) dos seus mRNAs alvo para reprimir a sua tradução não-codificante. miRNAs foram encontrados para direcionar oncogenes e supressores tumorais diferentes e evidência emergente sugere que a desregulação dos miRNAs está envolvido na patogênese de muitos cânceres [19,20].

Para explorar a regulação da expressão Bmi1 em células cancerosas , examinamos uma possível correlação entre a expressão Bmi1 em células de câncer gastrointestinal e macrófagos que se infiltram no microambiente tumoral, e investigou o mecanismo subjacente a regulação da expressão Bmi1. Aqui demonstramos que o miR-30e * mediada pela TAM regula diretamente a expressão Bmi1 em câncer gastrointestinal.

Materiais e Métodos

cultura de células e tratamento

As linhas de células AGS, NUGC4 , COLO201, e THP-1 foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). As células HCT116 foram cultivadas sob 5% de CO

2 a 37 ° C em meio nutriente-mistura de Eagle modificado por Dulbecco F-12 (Sigma, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de FBS. As linhas celulares foram obtidas da coleção japonesa dos recursos biológicos de Pesquisa Cell Bank e Riken Bioresource Centro Cell Bank.

imuno-histoquímica (IHQ) e marcando

procedimentos de processamento de amostras e IHC foram realizados como previamente descrito [ ,,,0],21]. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando 3% de peróxido de hidrogénio. As secções foram primeiro incubadas com anticorpos diluídos, seguido por incubação com rábano polímero marcado com peroxidase-biotina livre a partir do sistema de detecção Envision Plus (Dako, Glostrup, Dinamarca). As reacções positivas foram visualizados utilizando uma solução de diaminobenzidina, e contrastadas com hematoxilina de Meyer. Como controle negativo, anticorpos primários de rato foram utilizados e sem manchas positivos foram vistos. Todos IHC coloração foi marcado de forma independente por dois patologistas. Bmi1 nuclear e expressões CD68 e CD163 citoplasmáticos foram interpretados de acordo com as diretrizes publicadas no estudo anterior. Para Bmi1 nuclear e CD68 citoplasmático e CD163, que marcou os resultados de coloração positivos em categorias de 0 a 3+ da seguinte forma: 0, sem coloração; 1+, 1-25% das amostras coradas; 2+, 26-50%; e 3+, 50%. . Uma pontuação de 3+ foi considerado um resultado positivo IHC

Anticorpos para IHC e análises de imunotransferência

Os anticorpos seguintes foram utilizados para análise IHC: um anticorpo monoclonal de ratinho específico para Bmi1 humana ( 1: 100 de diluição; Abcam, Cambridge, Reino Unido), um anticorpo monoclonal de ratinho específico para CD68 humano (diluição 1: 100; Dako, Glostrup, Dinamarca), e um anticorpo monoclonal de ratinho específico de CD163 humano (diluição 1: 100; Novocastra, Newcastle, UK). Os anticorpos seguintes foram utilizados para a análise de imunotransferência: a anticorpos monoclonais de ratinho para Bmi1 (1: 1000), e um anticorpo policlonal de coelho para β-actina humano (1: 1000; Cell Signaling Technology).

ARN e miARN isolamento

o ARN total, incluindo miARN, foi isolado a partir de linhas de células utilizando um estojo de isolamento de miRvana miARN (Ambion, Austin, TX, EUA), e eluiu-se em 100 ul de solução de eluição aquecido, de acordo com o protocolo do fabricante. miARNs foram extraídos a partir de tecidos fixados com formalina e embebidos em parafina de cancro gastrintestinal e seus epitélio gastrointestinais normais adjacentes emparelhados, utilizando um kit de isolamento de RECOVERALL total de ácido nucleico para FFPE (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. A pureza e a concentração de todas as amostras de ARN foram avaliados pela sua razão de absorvância a 260/280 nm, determinada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Rockland, DE, EUA).

preparação de THP-1 de macrófagos e ensaio de co-cultura

THP-1 as células foram semeadas em inserções Transwell os (3540, Corning) em placas de 6 poços (1 × 10

6 células /poço). Para a preparação de M1-polarizados THP-1 macrófagos, 320 nM de acetato de miristato de forbol (PMA) foi adicionado a células THP-1 durante 6 h, seguido por PMA mais 20 ng /mL de interferão (IFN) -γ e 100 ng de lipopolissacárido /ml para as seguintes 18 h. Para a preparação de M2-polarizados THP-1 macrófagos, 320 nM de PMA foi adicionado às células THP-1 durante 6 h, seguido por PMA mais 20 ng /ml de interleucina (IL) -4 /IL-13 para a 18 h seguintes. Após três lavagens para remover citocinas, M1- ou M2-polarizada THP-1 macrófagos foram co-cultivados em inserções superiores com AGS ou células HCT116 em placas de 6 poços (1 × 10

5 células /poço), sem contacto directo, em cada meio sem FBS a 10% como descrito acima. Após 24 horas de co-cultura, as inserções superior contendo macrófagos foram descartados. AGS e células HCT116 foram lavados e usados ​​para experiências subsequentes.

cultura Esfera

Tal como descrito acima, ou M1- M2-polarizados THP-1 macrófagos foi preparado. Após três lavagens para remover citocinas, M1- ou M2-polarizada THP-1 macrófagos foram co-cultivados em inserções superiores com AGS e células HCT-116 (1 × 10

4 células /cavidade) não-adesiva em placas de 6 poços ( 3471, Corning) sem contacto directo, revestidas com agarose fino a uma densidade de 2 × 10

4 /mm

3 em DMEM isento de soro /F12 (Invitrogen), contendo 1% de N2 (Gibco), 2% B27 (Gibco), 20 ng /de factor de crescimento de fibroblastos humano ml (FGF) -2 (Sigma, St. Louis, MO), e factor de 20 ng /mL de crescimento epidérmico (EGF) (Sigma). Cada tratamento foi realizado em triplicado. O meio de cultura foi trocado a cada dois dias até a formação de esfera. Após 10 dias, as esferas foram recolhidas.

Macrófago cultura e ensaio de co-cultura

células mononucleares do sangue periférico foram obtidas a partir de dadores voluntários saudáveis. + monócitos CD14 foram isolados utilizando micropérolas CD14 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Os monócitos foram plaqueados em placas de 6 poços (1 × 10

5 /poço) e cultivadas com M-CSF de granulócitos (2 ng /mL) (Wako, Tokyo, Japão) durante cinco dias para induzir macrófagos imaturos. Após lavagens com PBS, as células foram estimuladas com IFN-γ (1 ng /mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA) para induzir macrófagos M1. Os monócitos foram plaqueadas e cultivadas com M-CSF (100 ng /mL) (Wako) durante cinco dias para induzir macrófagos imaturos. Após lavagens com PBS, as células foram estimuladas com IL-10 (10 ng /mL) (PeproTech) para induzir macrófagos M2. Meios a partir de culturas de macrófagos ou M1- M2-polarizados foi recolhido e transferido para placas de 6 poços contendo células AGS e HCT116 (1 × 10

4 células /cavidade). Após 24 horas de co-cultura, a AGS e células HCT116 foram lavados e usados ​​para experiências subsequentes.

miARN microarray

Cianina-3 (Cy3) marcado ARNc foi preparado a partir de 100 ng de ARN utilizando miARN da Agilent Labeling Kit completa e Hyb (P /N 5.190-0.456) de acordo com as instruções do fabricante. Agilent Humano 8 x 60K miARN matriz foi realizada nas duas amostras reunidas. A hibridação foi realizada de acordo com as instruções da rotulagem completa miRNA da Agilent e Kit Hib. As lâminas foram digitalizada imediatamente após a lavagem da Agilent DNA Microarray Scanner (G2505C) usando configuração para corrediças da disposição 8x60k (Área de Digitalização 61×21.6 mm, 5um Resolução de digitalização uma digitalização a cores, canal de Dye está definida para verde e verde PMT está definido como 100% ). As imagens digitalizadas foram analisadas com Extração de Características Software 10.7.3.1 (Agilent), utilizando parâmetros padrão (protocolo miRNA_107_Sep09). intensidades de sonda foram normalizados utilizando GeneSpring 12,0 através de uma normalização turno percentil. Diferencialmente expressos miRNAs foram identificados através de Mudança filtragem Fold. dados de microarranjos foram depositados em GEO (acesso GSE50601;. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50601).

quantitativo em tempo real reacção de polimerase em cadeia (qRT-PCR)

os níveis de miR-30e * de expressão foram determinados por TaqMan qRT-PCR utilizando kits de ensaio TaqMan miARN (Ambion) reverso, de acordo com o protocolo do fabricante, tal como descrito anteriormente . miR-30e * expressão foi normalizado para a expressão de RNA nuclear pequeno RNU6B. Os níveis de expressão de Bmi1 foram quantificados por sondas mestre qRT-PCR utilizando um LightCycler 480 Sondas mestre (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e normalizadas para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato. Todas as reacções de qRT-PCR foram realizadas utilizando o LightCycler 480 System II (Roche Diagnostics). As quantidades relativas de miR-30e * e Bmi1 foram medidos com o método -ΔΔCT 2

. Todas as reações qRT-PCR foram realizadas em triplicado.

A transfecção de miRNA

As células foram transfectadas com 5 nM imitar ou inibidor de miR-30e * (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), utilizando reagente lipofectamina RNAiMax transfecção (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A especificidade da transfecção foi verificada utilizando um mímico de controlo negativo (Applied Biosystems). Foram utilizados os níveis de expressão de miR-30e * foram quantificadas 48 horas após a transfecção, e as células para as experiências subsequentes.

A geração de mutantes Bmi1 3’UTR

vectores contendo mutado miR-30e * sequências alvo na 3’UTR Bmi1 humana foram introduzidas por mutagénese dirigida utilizando os seguintes iniciadores de PCR: 5′-ccUAUGGACGU UAAUUGAAAa -3 ‘para Luc-Bmi1-tipo-selvagem, e 5′-ccUAUGGACGU UAUGACUUUa -3’ para Luc-Bmi1-mutante.

luciferase Assay

AGS células foram plaqueadas em placas de 96 cavidades e foram transfectadas, com MultiFectam (Promega) utilizando o vector de expressão Repórter PMIR-RELATÓRIO dE ™ de luciferase de pirilampo contendo miARN luciferase sob o controlo de um sistema promotor /terminador de mamífero. Uma região de clonagem miARN alvo foi incluída a jusante da sequência de tradução da luciferase ou vector vazio (Invitrogen), e o controlo mímica ou imitador de miR-30e * (Invitrogen). Os ensaios de repórter foram realizadas 48 horas após a transfecção com o luc-Screen® sistema (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

análise Western blot

As células cultivadas colhidas a partir de placas de 6 poços foram lavados uma vez em PBS e lisadas em tampão de radioimunoprecipitação suplementado com um cocktail inibidor de protease /fosfatase (Thermo Scientific , Tóquio, Japão). As amostras de proteínas foram submetidas a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio-e transferido para uma membrana de nitrocelulose e a membrana foi incubada com os anticorpos primários. Os sinais foram detectados por incubação com anticorpos secundários usando o Sistema de Detecção de ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).

Pacientes e amostras de tecido

tecidos de carcinoma gastrointestinal primária e os seus epitélio gastrointestinal normal adjacente combinado foram obtidos de 83 pacientes com câncer gástrico e 49 pacientes com câncer de cólon que foram submetidos a cirurgia do câncer gastrointestinal sem tratamento pré-operatório no Departamento de Cirurgia Gastroenterologia, Hospital Universitário Kumamoto de 2005 a 2008. assinaram termo de consentimento para participar foi obtido de todos os pacientes informados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética médica da Universidade de Kumamoto.

A análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicado e os dados mostrados são representativos dos resultados consistentemente observados. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD). testes de Qui-quadrado foram utilizados para avaliar as diferenças na proporção entre a expressão Bmi1 e expressão CD68 /CD163. Student independente

t

-Testes foram utilizados para comparar variáveis ​​contínuas entre os dois grupos, e procedimento de Tukey-HSD foi utilizado para comparar as variáveis ​​contínuas entre os três grupos. Para a análise estatística, foi utilizado o JMP (versão 9, SAS Institute) e os programas de software SAS (Versão 9.1, SAS Institute). Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A expressão de Bmi1 se correlaciona com os níveis de TAMs em tecidos de câncer gastrointestinal

TAM contribuem para o crescimento do tumor, invasão e metástase em muitos cancros de produção de vários mediadores [13-17]. Para determinar se a expressão de Bmi1 em células cancerosas se correlaciona com os níveis de MAT, examinámos a expressão Bmi1, CD68, CD163 e em tecidos de cancro gastrointestinais utilizando IHC. CD68 coloração foi utilizado para detectar pan-macrófagos, e a população M2 foi avaliada utilizando CD163, tal como descrito anteriormente [22]. Os resultados mostraram uma relação positiva com a expressão Bmi1 e CD68 /CD163 no câncer gástrico (Figura 1A, C) e no câncer de cólon (Figura 1B, D). Estes resultados sugerem que os macrófagos em estroma tumoral pode estar envolvido na expressão Bmi1 em células de cancro gastrointestinal.

(A) imuno-histoquímica de expressão Bmi1, CD68, CD163 e em 83 tecidos de cancro gástrico. Barras de escala, 100um. (B) A percentagem de CD68 /163 amostras positivas em alta Bmi1 expressando câncer gástrico. Houve uma correlação significativa entre a expressão Bmi1 e CD68 expressão /163 (*

P Art 0,05, ***

P Art 0,001, respectivamente). (C) imunohistoquímica do Bmi1, CD68 e expressão CD163 em 49 tecidos de câncer de cólon. Barras de escala, 100um. (D) A percentagem de CD68 /163 amostras positivas em alta Bmi1 expressando cancro do cólon. Houve uma correlação significativa entre estes dois grupos (**

P Art 0,01, **

P Art 0,01, respectivamente).

expressão Bmi1 é aumentada em linhas de células de cancro gastrointestinal co-cultivadas com ou M1- M2-polarizados THP-1 macrófagos, levando-se à capacidade de formação de esfera adquirida em cultura

3D

a seguir realizada uma

in vitro

ensaio de co-cultura com M1- ou M2-polarizados THP-1 macrófagos para examinar se a expressão afectar macrófagos Bmi1 em células cancerosas e funções de células de cancro. Como mostrado anteriormente, THP-1 As células foram diferenciadas em macrófagos M1- ou M2-polarizada pelo tratamento distinto citocinas (Figura 2A) [23]. análise de qRT-PCR revelou que a expressão foi significativamente aumentada Bmi1 em AGS e células HCT116 co-cultivadas com ambos M1- e M2-polarizados THP-1 macrófagos (Figura 2B, C). Bmi1 está envolvido na capacidade de auto-renovação através da repressão do locus INK4a-ARF, assim, a hipótese de que as células gastrointestinais co-cultivadas com TAMs podem possuir a capacidade de auto-renovação através upregulating expressão Bmi1. Para investigar o fenótipo das células gastrointestinais co-cultivadas com MAT, foi realizada uma cultura a esfera 3D cultivadas em cultura não-aderente livre de soro em células gastrointestinais co-cultivadas com ou M1- M2-polarizados THP-1 macrófagos (Figura 2D, E ). A capacidade de formação de esfera células gastrointestinais co-cultivadas com MAT foi aumentada (Figura 2F, L). Estes resultados sugeriram que a TAM upregulated expressão Bmi1 e formação melhorada esfera.

(A) perfil de produção de citocinas e de M1–M2 polarizados macrófagos THP-1. (B) Análise de qRT-PCR da expressão em células Bmi1 AGS co-cultivadas com M1- e M2-polarizados THP-1, em comparação com macrófagos, Bmi1 expressão em células AGS apenas como um grupo de controlo. Significativamente maior expressão Bmi1 foi detectado em grupos co-cultivados em comparação com o grupo controle (***

P Art 0,001, ***

P Art 0,001, respectivamente). Análise (C) qRT-PCR da expressão em células HCT116 Bmi1 co-cultivadas com M1- e M2-polarizados THP-1 macrófagos, em comparação com a expressão em células HCT116 Bmi1 apenas como um grupo de controlo. Significativamente maior expressão Bmi1 foi detectado em grupos co-cultivados em comparação com o grupo controle (***

P Art 0,001, ***

P Art 0,001, respectivamente). (D) As imagens microscópicas de esfera 3D células AGS cultivadas co-cultivadas com os macrófagos, em comparação com a esfera 3D células AGS cultivadas única como um grupo de controle. Barras de escala, 100um. (E) As imagens microscópicas de esfera 3D células HCT116 cultivadas co-cultivadas com os macrófagos, em comparação com células HCT116 cultivadas esfera 3D apenas como um grupo de controle. Barras de escala, 100um. (F) os números esfera significativamente mais elevados foram detectados em grupos de co-cultivados em comparação com o grupo controle nas células AGS (*

P Art 0,05, *

P Art 0,05, respectivamente). (G) números esfera significativamente mais elevados foram detectados em grupos de co-cultivados em comparação com o grupo controle nas células HCT116 (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01, respectivamente) .

Identificação de miRNAs regulam a expressão Bmi1 usando rastreio miRNA relacionada ao câncer em células cancerosas gástricas

Vários miRNAs estão implicados na regulação das atividades das células-tronco do câncer, incluindo a auto-renovação e tumorigenicidade [19,20]. Por isso, testamos a hipótese de que a regulação da expressão Bmi1 em células de câncer gastrointestinal pode ser mediada por miRNAs usando análise de microarray miRNA. Nós selecionamos os dez melhores miRNAs mais reprimidos em células gastrointestinais co-cultivadas com M1- ou M2-polarizados THP-1 macrófagos em comparação com células gastrointestinais sozinho (Tabela 1A, B). Usando várias bases de dados on-line (Miranda, Diana, TargetScan, TargetMiner, miRBase), miR-30e-3p (miR-30e *) foi o único candidato miRNA entre todos os miRNAs identificados encontrados para atingir diretamente o Bmi1 3 ‘UTR. Nós, portanto, focada em miR-30e * para análise posterior.

A

B

mudança miRNAfold (M1 vs controle) mudança miRNAfold (M2 vs control)hsa-miR-36820.006816627hsa-miR-36820.005809477hsa-miR-30e-3p0.011009754hsa-miR-373-3p0.015210649hsa-miR-3350.013768308hsa-miR-192-3p0.015870558hsa-miR-335-3p0.016194038hsv1-miR-H6-3p0.016751566hsa-miR-373-3p0.017847616hsa-miR-1225-3p0.017139628hsa-miR-192-3p0.01862193hsa-miR-36760.017353492hsa-miR-296-5p0.019188985hsa-miR-7660.032502682hsa-miR-1225-3p0.020111009hsa-miR-335-3p0.324230407hsa-miR-7660.038137453hsa-miR-769-5p0.445738351hsa-miR-769-5p0.434152471hsa-miR-30e-3p0.54343376Table 1. Análise de Microarray de 1360 miARNs em linhas celulares AGS co-cultivadas com células THP-1 macrófagos.

(A) Os dez melhores miARNs regulados negativamente em linhas celulares AGS co-cultivadas com macrófagos M1-polarizados em comparação com os controlos. (B) os dez melhores miRNAs regulados negativamente em linhas de células AGS co-cultivados com macrófagos M2-polarizados em comparação com os controles. CSV Baixar CSV

miR-30e * suprime a expressão Bmi1 em células gastrointestinais e visa diretamente o Bmi1 3 ‘UTR

Para revelar a relevância funcional de miR-30e * expressão, examinámos a expressão Bmi1 nas 6 linhas de células de cancro gastrointestinal por transferência de Western (Figura 3A), e analisada a relação entre o miR-30e * e expressão Bmi1 em alta cancro expressando Bmi1 linhas celulares de cancro expressando linhas celulares (AGS e HCT116) transfectadas com miR-30e * imita, e baixa Bmi1 (NUGC4 e COLO201) transfectadas com miR-30e * inibidores. análise de Western blot revelou reduziu significativamente os níveis de proteína Bmi1 em AGS e células HCT116 transfectadas com miR-30e * imita em comparação com os controles (Figura 3B, C) e aumento dos níveis em células NUGC4 e COLO201 transfectadas com miR-30e * inibidores em comparação com os controles (Figura 3D, e). Além disso, para estudar o fenótipo de células cancerosas transfectadas com miR-30e * imita, foi realizada uma cultura a esfera 3D cultivadas em cultura não-aderente livre de soro em células transfectadas com AGS miR-30e * imita (Figura 4A). A capacidade de formação esfera de células AGS transfectadas com miR-30e * imita foi inibida (Figura 4B), portanto, confirmou que a regulação baixa de miR-30e * causou uma formação esfera reforçada.

(A) análise de Western blot Bmi1 de expressão em 6 linhas de células de cancro gastrointestinal. (B) Análise de Western blot de expressão Bmi1 em linhas celulares de alta Bmi1 expressando AGS transfectadas com controle negativo (NC) e miR-30e * imita. (C) Análise de Western blot de expressão Bmi1 em Bmi1-expressando linhas celulares elevadas HCT116 transfectadas com NC e miR-30e * imita. (D) Análise de Western blot de expressão Bmi1 em Bmi1 expressam linhas baixas de células NUGC4 transfectadas com NC e miR-30e * inibidores. (E) Análise Western blot da expressão Bmi1 em Bmi1-expressam linhas baixas de células COLO201 transfectadas com NC e miR-30e * inibidores.

Esfera 3D

(A) cultura cultivada em isento de soro não-aderente cultura com células AGS co-cultivadas com os macrófagos e transfectadas com mímico miR-30e *, em comparação com a cultura esfera 3D com células AGS co-cultivadas com os macrófagos e transfectadas com NC mímico como um grupo de controlo. Barras de escala, 100um. (B) um número significativamente baixo esfera foram detectados em mímico miR-30e * grupos transfectados em comparação com o grupo de controlo (* P 0,05, * P 0,05, respectivamente). (C) O miR-30e * sítio putativo alvo ou uma sequência mutada da UTR 3 ‘de Bmi1 foi clonado imediatamente a jusante do gene da luciferase. (D) A actividade da luciferase de células AGS co-transfectadas com plasmídeos contendo o tipo selvagem de miR-30e * sequência alvo na UTR 3 ‘de Bmi1 ou plasmídeos de controlo juntamente com o ARNm mímico NC e mímico miR-30e *. (E) A actividade de luciferase de células AGS co-transfectadas com plasmídeos contendo o tipo selvagem ou o miR-30e * sequência alvo mutante na UTR 3 ‘de Bmi1 juntamente com o ARNm mímico NC e mímico miR-30e *.

Análise da Bmi1 3 ‘UTR utilizando o banco de dados on-line miRanda revelou uma sequência alvo previsto para miR-30e *. A seguir, foi investigado se o miR-30e * tem como alvo directamente o ‘UTR de Bmi1 utilizando construções que contêm o miR-30e * sítio putativo alvo ou uma sequência mutada do 3’ UTR de 3 Bmi1 clonado imediatamente a jusante de um gene da luciferase. O LUC-Bmi1 construção contendo a sequência de miR-30e * alvo previsto na UTR Bmi1 3 é mostrada na Figura 4C, com sequências de sementes indicadas por linhas. A transfecção de células com AGS o miR-30e * imitam suprimiu significativamente a actividade de luciferase a partir do vector repórter contendo o tipo selvagem Bmi1 UTR 3 ‘(Luc-Bmi1-WT) em comparação com o vector de controlo (Figura 4D). Nós também construídos vectores repórter contendo o mutante Bmi1 UTR 3 ‘(Luc-Bmi1-MT). A transfecção com o miR-30e * mímico não suprimiu a actividade de luciferase a partir do vector repórter contendo a mutação UTR 3 ‘de Bmi1 em comparação com a de tipo selvagem 3’ UTR do vetor (Figura 4E). Estes resultados indicam que miR-30e * regula a expressão Bmi1, visando directamente o seu ‘UTR 3.

expressão Bmi1 é inversamente correlacionada com miR-30e * expressão em pacientes com câncer gástrico

A seguir, analisadas os níveis de miR-30e * expressão em tecidos de cancro e os seus correspondentes epitélios normais adjacentes utilizando qRT-PCR. Expressão de miR-30e * foi significativamente menor em tecidos de cancro em comparação com o seu epitélio normal adjacente combinados em ambos cancro gástrico (Figura 5A) e cancro do cólon (Figura 5C). Além disso, em comparação miR-30e * níveis de expressão entre alta e baixa Bmi1 expressando tecidos de câncer. elevados níveis de expressão Bmi1 foram detectados em 45% (24/53) das amostras de cancro gástrico e 54% (20/37) das amostras de cancro de cólon. expressão Bmi1 foi inversamente correlacionada com miR-30e * expressão no câncer gástrico (Figura 5B). No entanto, a expressão Bmi1 não foi associada com miR-30e * expressão em cancro do cólon (Figura 5D). Estes dados mostraram que a expressão Bmi1 foi fortemente correlacionada com miR-30e * expressão em pacientes com câncer gástrico, mas não em pacientes com câncer de cólon.

(A) Os níveis de miR-30e * expressão em 16 tecidos de câncer gástrico e a sua correspondência epitélio gástrico normal adjacente tal como avaliado por qRT-PCR. (B) Os níveis de miR-30e * expressão em 29 de alta e 24 de baixa Bmi1 expressando tecidos de câncer gástrico, avaliada pela qRT-PCR. (C) Os níveis de miR-30e * expressão em 37 tecidos de câncer de cólon e sua correspondência epitélio do cólon normal adjacente, como avaliadas pelo qRT-PCR. (D) Os níveis de miR-30e * expressão em 20 de alta e 17 de baixa Bmi1 expressando tecidos de cancro do cólon, avaliada pela qRT-PCR.

macrófagos M1- e M2-polarizadas purificada a partir de monócitos humanos induzida downregulation de miR-30e * e regulação positiva de Bmi1

Os nossos resultados anteriores mostraram que a expressão Bmi1 foi significativamente aumentada em AGS e células HCT116 co-cultivadas com ambos M1- e M2-polarizados THP-1 macrófagos. Nós próximos AGS co-cultivadas e células HCT116 com M1- e macrófagos M2-polarizados purificada a partir de monócitos humanos. Bmi1 expressão foi significativamente aumentada em células AGS co-cultivadas com ambos M1- e macrófagos M2-polarizados purificado a partir de monócitos humanos, e miR-30e * expressão foi significativamente diminuída em células AGS co-cultivadas com ambos os macrófagos (Figura 6A, C). Em contraste, a expressão Bmi1 foi significativamente aumentada em células HCT116 de co-cultura com macrófagos M1-polarizados, mas não em células HCT116 de co-cultura com macrófagos M2-polarizadas. Expressão de miR-30e * foi significativamente diminuída em células HCT116 de co-cultivadas com ambos os macrófagos (Figura 6B, D). Este resultado demonstrou que M1- e macrófagos M2-polarizados purificado a partir de monócitos humanos downregulation de miR-30e * induzidas em linhas celulares gastrointestinais, e regulação positiva do Bmi1 na linha celular de cancro gástrico, mas não na linha celular de cancro do cólon.

(a) qRT-PCR a análise de miR-30e * express em culas AGS co-cultivadas com os macrófagos e M1-M2-polarizadas. Significativamente menor * expressão de miR-30E foi detectada em grupos co-cultivados em comparação com o grupo controle (***

P Art 0,001, *

P Art 0,05, respectivamente). (B) Análise de qRT-PCR de miR-30e * expressão em células HCT116 de co-cultivadas com M1- e macrófagos M2-polarizadas. Significativamente menor * expressão de miR-30E foi detectada em grupos co-cultivados em comparação com o grupo controle (***

P Art 0,001, **

P Art 0,01, respectivamente). (C) qRT-PCR A análise de expressão em células Bmi1 AGS co-cultivadas com M1- e macrófagos M2-polarizadas. Significativamente maior expressão Bmi1 foi detectado em grupos co-cultivados em comparação com o grupo controle (***

P Art 0,001, **

P Art 0,01, respectivamente). (D) Análise de qRT-PCR de miR-30e * expressão em células HCT116 de co-cultivadas com M1- e macrófagos M2-polarizadas. Significativamente maior expressão Bmi1 foi detectado em grupos de co-cultura de macrófagos M1 em comparação com o grupo controle (**

P Art 0,01). (E) Representação esquemática de miR-30e sinalização * -Bmi1 mediada pela TAM.

Discussão

Neste estudo, mostramos que a TAM upregulated expressão Bmi1, levando ao aumento da capacidade de formação de esfera. expressão Bmi1 foi suprimida por miR-30e * através de miR-30e * ligação direta com Bmi1 3 ‘UTR, e expressão Bmi1 foi inversamente correlacionada com miR-30e * expressão em tecidos de câncer.