Sumário
Os microRNAs (miRNAs) são reguladores de RNA não-codificantes curtas que controlam a expressão de genes principalmente através de silenciamento pós-transcricional. Nós previamente identificados
miR-205
em uma assinatura para o cancro do colo do útero humano, utilizando uma abordagem de sequenciação de profundidade. Neste estudo, constatou-se que
miR-205
expressão era frequentemente mais elevados no cancro do colo do útero humano do que as suas amostras de tecidos normais correspondentes. Funcionalmente, foi demonstrado que
miR-205
promove a proliferação e migração celular em células de cancro cervical humano. Para entender melhor as funções biológicas do
miR-205
, foi realizada
in vivo
reticulação e Argonaute 2 imunoprecipitação dos complexos de ribonucleoproteínas miRNA seguido por análise de microarray (CLIP-Chip) para identificar seu mRNA potencial alvos. Aplicando CLIP-Chip on gain- e experiências de perda de função, identificamos um conjunto de transcritos como potenciais alvos de
miR-205
. Vários objectivos são funcionalmente envolvidos na proliferação celular e migração. Dois deles, Cyr61 e CTGF, foram ainda validado por análise Western blot e quantificação de mRNA de enriquecimento nos imunoprecipitados ago2 utilizando qRT-PCR. Além disso, tanto
Cyr61
e
CTGF
foram reprimidos em tecidos de cancro cervical. Em resumo, os nossos resultados revelam novos papéis e metas da
miR-205
no cancro cervical humano, que podem fornecer novos insights sobre seu papel na carcinogênese cervical e seu valor potencial para o diagnóstico clínico funcionais.
Citação: Xie H, Zhao Y, Caramuta S, Larsson C, Lui WO (2012)
miR-205
Expressão promove a proliferação e migração celular de cancro do colo do Human Cells. PLoS ONE 7 (10): e46990. doi: 10.1371 /journal.pone.0046990
editor: Siu Tim Cheung, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 13 Abril, 2012; Aceito: 07 de setembro de 2012; Publicação: 03 de outubro de 2012
Direitos de autor: © Xie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa sueco (523-2009-3517, 521-2010-3518); Fundação do Åke Olsson para hematológica Research; a Fundação Swedish Cancer; Fundação do Åke Wiberg; Rei Fundo Jubileu V Gustaf; Cancer Society, em Estocolmo; o Axel e Fundação Doação de Signe Lagerman; Karolinska Institutet e Conselho do Condado de Estocolmo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer cervical, o terceiro câncer mais comum entre as mulheres em todo o mundo [1], é fortemente associadas com a infecção e subsequente transformação de células do colo do útero pelo papilomavírus humanos específicos (HPV) subtipos [2]. O fato de que o câncer cervical se desenvolve a partir de formas pré-malignas bem reconhecidas, oferece uma oportunidade importante para o diagnóstico precoce e prevenção. Hoje, tais rastreio primário inclui análises citológicas e identificação HPV. No entanto, estes exames não pode distinguir com fiabilidade as lesões com potencial invasivo das lesões que regridem espontaneamente. Portanto, o desenvolvimento de marcadores mais robustos para a progressão da doença seria valioso suplementos aos métodos de rastreio atuais.
Os microRNAs (miRNAs) são RNAs não-codificantes curtas (± 22-nucleotídeos) que geralmente controlam a expressão de genes no posto nível -transcriptional através da degradação mRNA e /ou repressão de translação [3]. Estas pequenas moléculas têm demonstrado desempenhar papéis importantes numa variedade de processos fisiológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento e progressão do cancro. Nós, e outros, previamente identificadas assinaturas de expressão miRNA alterada no cancro do colo do útero humano [4] – [10]. Vários desses miRNAs têm sido consistentemente relatado como desregulados em câncer cervical (
por exemplo
.
miR-143
,
miR-145
,
miR-21
e
miR-205
). Alguns têm também sido caracterizados funcionalmente em células de cancro cervical humano. Entre eles,
miR-143
,
miR-145
e
miR-34a
foram mostrados para inibir a proliferação celular, e
miR-146a
e
miR-21
para aumentar o crescimento de células [8], [10], [11].
miR-23b
foi encontrado recentemente para reprimir a expressão do ativador do plasminogênio tipo uroquinase (uPA) e induzem a migração celular em células de câncer cervical humanos [12]. No seu conjunto, estas observações sugerem que miRNAs desregulados tem um papel funcional no desenvolvimento do cancro do colo do útero e pode se tornar aplicado como ferramenta de diagnóstico.
Neste estudo, examinamos o papel funcional da
miR-205
no cancro do colo do útero humano. Este miARN foi um dos mais significativos miARNs utilizados para a predição classe cancro cervical e foi significativamente sobre-expresso em amostras de cancro do colo do útero em relação aos homólogos normais correspondentes [9]. O aumento da expressão
miR-205
também tem sido observado em adenocarcinoma endometrial [13], cabeça e pescoço linhas de carcinoma de células escamosas de células [14], carcinoma do pulmão de células escamosas [15] e do ovário [16]. Por contraste, a expressão reduzida de
miR-205
foi reportado no melanoma [17] e os cancros do esófago [18], rim [19], da bexiga [20], [21], da mama [22] , e da próstata [23].
com base nos estudos acima,
miR-205
pode funcionar como um gene supressor de tumores ou oncogenes, dependendo dos contextos celulares. Consistente com sua dupla função, vários estudos têm demonstrado a sua tumor promoção e funções supressoras em diferentes linhas celulares de cancro. Para exemplos,
miR-205
foi mostrado para suprimir a migração celular /invasão através transição epitelial-mesenquimal-a em ambas as células da próstata e cancro da mama humano [23], [24], bem como para segmentar
HER3
receptor tirosina-quinase em células de câncer de mama [22]. Em apoio de uma função oncogénica,
miR-205
foi encontrado para direcionar
Ship2 Compra de sobrevivência Akt sinalização em células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço [14]. Dada a complexidade da sua funcionalidade, seria de interesse para investigar os papéis funcionais de
miR-205
no desenvolvimento do câncer cervical.
Aqui nós descrevemos as consequências funcionais da
miR- 205
regulação em células cancerosas cervicais humanos. Em gain- e experiências de perda de função, demonstramos que
miR-205
regula a proliferação e migração celular em células de câncer cervical humanos. Foram identificados mais de um conjunto de putativa
miR-205
alvos usando uma abordagem bioquímica. Vários destes alvos candidatos são funcionalmente associado com a proliferação celular e migração. Dois do potencial
miR-205
alvos de mRNA foram ainda validados em experimentos de cultura de células. Nossos resultados fornecem uma vantagem importante para novos insights sobre o papel funcional da
miR-205
no desenvolvimento do cancro do colo do útero humano.
Resultados
miR-205
Expressão em amostras de cancro do colo do útero humano
Nós já identificou um conjunto de miRNAs que poderia distinguir amostras de cancro do colo do útero de suas contrapartes normais usando uma abordagem baseada miRNA-sequenciação de perfis [9]. Nesse classificador,
miR-205
teve a pontuação mais alta, sugerindo uma função importante no desenvolvimento do câncer cervical. Para confirmar o nível de expressão alterada de
miR-205
no cancro do colo do útero, medimos
miR-205
expressão por reversa em tempo real quantitativa 27 pares combinados de transcrição-PCR (qRT-PCR) em de cancro do colo do útero e tecido normal. De acordo com os resultados baseados em seqüenciamento,
miR-205
foi achado significativamente sobre-expressos em câncer de colo uterino humano em comparação com os seus homólogos normais
P Art 0,001; Figura 1A). Em 19 casos (~ 70%) a expressão de
miR-205
foi fortemente aumentado nas amostras de tumor, em comparação com os seus homólogos normais; enquanto nos restantes 8 casos, o cancro e amostras normais apresentaram níveis baixos, mas comparáveis expressão de
miR-205
(Figura 1B).
(A)
miR-205
expressão foi significativamente maior nos tumores do que as amostras normais (
P
0,001; teste t emparelhado). (B) relativamente mais elevado de expressão de
miR-205
foi encontrada na maioria das amostras de tumor, em comparação com as suas contrapartidas normais. (C) alta expressão de
miR-205
foi detectado em ME-180, células C4I e CaSki e nível de expressão baixa ou indetectável foi encontrado em HeLa, SW756, SiHa e células C33A. Os dados apresentados representam a média de três experiências independentes com triplicados. As barras de erro representam desvios padrão da média.
consequências funcionais de
miR-205
regulamento no colo do útero células cancerosas humanas
As consequências funcionais de alteração
miR-205
expressão foram investigados em linhas celulares de cancro do colo do útero com níveis elevados ou baixos de endógenos
miR-205
. Para este efeito,
miR-205
foi quantificada em linhas celulares de cancro cervical humano por qRT-PCR. Entre as linhas de células 7 analisados,
miR-205
foi achado altamente expressa em ME-180, C4I e CaSki, enquanto a baixa expressão /níveis quase indetectáveis foram encontrados em HeLa, SW756, SiHa e C33A (Figura 1C) . Em seguida nós transfectadas células CaSki com um inibidor de miRNA células (Anti-miR-205), e HeLa e SW756 com um miRNA mimic (Pre-miR-205), e determinou o efeito de
miR-205
silenciamento ou superexpressão sobre a proliferação celular, apoptose e migração. Como controlos negativos, foi utilizado um precursor de miRNA ou inibidor, sem homologia de sequência com qualquer transcritos humanos.
Observou-se que a inibição da
expressão de miR-205
em células CaSki levou a uma diminuição significativa na célula crescimento (-15%;
P Art 0,001), enquanto que a sobre-expressão de
miR-205
em HeLa e células SW756 resultou em aumentos significativos de proliferação celular (~ 20% e -11% , respectivamente;
P
0,05), em comparação com os respectivos controlos negativos (Figura 2A). Tomados em conjunto, tanto gain- e experiências de perda de função efeitos sobre a proliferação de células suportado de forma consistente.
Efeitos sobre a migração de células foram demonstrados utilizando o Transwell e cura de feridas ensaios de migração. Utilizando o ensaio Transwell, que mostrou que a migração celular foi significativamente melhorada por
miR-205
sobre-expressão em ambas as linhas celulares HeLa e SW756 (~ 20% e ~ 30%, respectivamente;
P 0,05). No entanto,
miR-205
supressão em células CaSki não conduziu a uma diminuição significativa da migração celular (Figura 2B). O ensaio de migração de cicatrização de feridas revelaram que
miR-205
sobreexpressão em células HeLa aumentada a capacidade de fechar a ferida em comparação com as células tratadas com controlo e transfectadas por simulação negativos Pré-RIM. Da mesma forma, fechamento da ferida foi retardado em cima silenciamento de
expressão de miR-205
em células CaSki (Figura 2C).
O tratamento com
miR-205
imitar em HeLa ou inibidor em células CaSki não resultou em qualquer alteração significativa da apoptose (Figura S1). Em experimentos de controle de transfecção eficiente foi demonstrada por significativamente alterada
miR-205
nível, e indução significativa de apoptose foi observada após o tratamento camptotecina (Figura S1).
Identificação
miR-205 Genes
alvo
Para entender melhor a função biológica do
miR-205
, identificamos
miR-205
alvos usando
in vivo
reticulação e RNA imunoprecipitação juntamente com microarray (CLIP-Chip). mRNAs ligados às máquinas miRNA foram purificados por Argonaute 2 imunoprecipitação (ago2 IP). Os alvos de ARNm recuperados a partir de amostras tratadas e de controlo foram diferencialmente marcadas com corantes fluorescentes, e, em seguida, hibridados com micromatrizes de oligonucleótidos para identificar os mRNAs associados ao complexo ribonucleoproteico microARN (miRNP). Aqui, realizamos experimentos CLIP-chip para ambos
miR-205
superexpressão em células HeLa e inibição em células CaSki.
Para verificar a eficiência da ago2 IP, que quantificou os níveis de expressão
miR-21 Comprar e
miR-30a-5p
utilizando qRT-PCR. Estes miARNs foram utilizados como controlos internos para avaliar o enriquecimento de miARNs após CLIP devido aos seus níveis elevados de expressão previamente relatados em ambas as células HeLa e CaSki [5], [8]. Observamos um significativo enriquecimento de ambos
miR-21
( 100 vezes,
P Art 0,01) e
miR-30a-5p
( 10 fold,
P
. 0,01) em anti-ago2 IP em comparação com IgG anti-IP ou controles de entrada (Figura S2)
em nossa análise CLIP-Chip, excluímos um dos os microarrays replicar a partir do
miR-205 experimentos superexpressão
devido a sinais de hibridação pobres. Após filtração de sinais de fundo, foi realizada agrupamento hierárquico sem supervisão dos cinco micromatrizes com base nos seus padrões de expressão de mRNA. Estamos focados em seis grupos (incluindo 270 transcrições /252 genes anotados) em que os padrões de expressão exibidos enriquecimento em
miR-205
superexpressão e exaustão no
miR-205
experimentos de supressão (Figura S3 e Tabela S1). Foi realizada anotação funcional sobre as metas CLIP-chip, utilizando programa GENECODIS. Vários grupos funcionais foram significativamente enriquecida (
P
0,05), incluindo ciclo celular, reprodução virai, reparação de DNA, apoptose, proliferação e migração celular (Tabela 1). Uma lista detalhada de anotações funcionais é dada na Tabela S2. Entre os alvos 75 candidatos listados na Tabela 1, 71 também foram previstos como
miR-205
alvos em pelo menos um programa de previsão (Tabela S3), e quatro alvos (
BOD1
,
SEPT2
,
AAGAB
e
DCAF13
) não foram previsto por qualquer um dos programas utilizados neste estudo.
Entre os genes alvo candidato, encontramos
Cyr61
e
CTGF
foram associados com ambos proliferação e migração celular (Tabela 1), e é consistente com nossas consequências funcionais observados neste estudo. Para entender melhor a relação entre a expressão
miR-205
e
Cyr61
ou
CTGF
, determinou-se a expressão de
Cyr61
e
CTGF
em 28 pares de câncer cervical e tecidos normais utilizando qRT-PCR correspondido. Nossos resultados revelaram expressão significativamente mais baixos de ambos
Cyr61
e
CTGF
em amostras de cancro cervical humanos, em comparação com os seus homólogos normais (
P
= 0,002
P
0,001, respectivamente; A Figura 3A-C). Curiosamente, os padrões desses dois genes selecionados de expressão foram inversamente correlacionados com a expressão
miR-205
(
Cyr61
,
Corr
= -0,241,
P
= 0,091;
CTGF
,
Corr
= -0,304,
P
= 0,032; Figura 3D). Os padrões de expressão inversa observada, juntamente com o previsto
sítios de ligação (Tabela S3, S4 Figura) miR-205
, mostram evidências de
Cyr61
e
CTGF como
miR-205
alvos.
proliferação (a) celular foi avaliada em linhas celulares de cancro do colo do útero, humanos, transfectados com um
miR-205
mímica (Pre-miR-205), inibidor (miR-205 Anti-) ou no correspondente controle negativo (controle Anti-miR Neg ou miR Pré-controle de Neg), utilizando ensaio de WST-1. crescimento celular relativa foi normalizada para as suas respectivas células tratadas com controlo. (B) Os gráficos que mostram a migração de células relativo em ambos
miR-205
inibição e experiências superexpressão avaliada pelo ensaio de migração Transwell. (C) Imagens representativas de migração celular avaliada por ensaio de cicatrização da ferida. feridas raspadinhas foram feitas em culturas de monocamada confluente após 48 horas de transfecção. Imagens de reparação de feridas foram tomadas a 0, 18 e 24 h após a ferida (painel da esquerda). A percentagem do fecho da ferida foi normalizada pelo tamanho da ferida em 0 h (painel direito). Os dados apresentados representam a média de três experiências independentes. As barras de erro representam desvios padrão da média. Todas as comparações foram avaliados utilizando o teste t. *
P Art 0,05; **
P Art 0,01; ***
P Art 0,001;
ns
= não significativo.
expressão relativamente menor de
Cyr61
(A) e
CTGF
(B) foi encontrado na maioria de amostras de tumor, em comparação com as suas contrapartes normais (n = 28). (C) A expressão de
Cyr61
e
CTGF
foi significativamente menor nos tumores do que as amostras normais (
P
= 0,002
P 0,001, respectivamente, teste t emparelhado). (D) correlação inversa entre o nível de expressão de
miR-205 Comprar e
Cyr61
(superior) ou
CTGF
(inferior). A relação de expressão foi avaliada pela análise de correlação de Pearson.
P
. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Validação de
Cyr61
e
CTGF
como
miR-205
genes alvo
Para determinar se
Cyr61
e
CTGF
poderiam ser alvos de
miR-205
em células cancerosas cervicais humanos, foram aplicados dois diferentes abordagens. Primeiro, avaliamos os níveis de Cyr61 e CTGF expressão da proteína em ambos os
miR-205
-overexpressing e células cancerosas cervicais -depleted usando análise de Western blot. Como mostrado na Figura 4 (A e B),
miR-205
sobre-expressão em células HeLa resultou numa diminuição significativa na expressão da proteína Cyr61 (~ 30%,
P
= 0,045) . A inibição da endógena
expressão de miR-205
em células CaSki aumentou significativamente o nível Cyr61 proteínas (-15%,
P
= 0,016). Para CTGF, observou-se uma ligeira diminuição ou aumento (mas não estatisticamente significativo) expressão da proteína em
miR-205
-overexpressing ou -depleted células, respectivamente. Uma explicação plausível é de que o CTGF pode ser regulado por vários miARNs ou factores, e modulando
miR-205
expressão por si só não foi suficiente para produzir alterações significativas no nível de expressão da proteína de CTGF.
(A) Western blot representante mostrando os níveis de Cyr61 e CTGF expressão de proteínas em células transfectadas com um
miR-205
mímica,
miR-205
inibidor, ou correspondente corrida e controles de transfecção simulada. (B) a expressão da proteína Cyr61 foi significativamente reprimido em
miR-205
-overexpressing (tratado com Pré-miR-205) células e aumentou significativamente em
miR-205
-depleting (tratados com Anti -miR-205) células, em comparação com seus respectivos controles negativos. a expressão da proteína de CTGF foi ligeiramente reprimido em células HeLa tratadas com o pré-miR-205, e ligeiramente aumentada em células CaSki tratados com anti-miR-205, mas o efeito não foi estatisticamente significativo. Os dados apresentados representam a média de pelo menos quatro experiências independentes. análise de qRT-PCR de
Cyr61
(C) e
CTGF
(D) de mRNA nos RNAs imunoprecipitadas-ago2 de
miR-205
-overexpressing ou -depleted células como em relação ao controle mock-transfecção. nível de expressão relativa de mRNAs individuais foi normalizado para
miR-21
expressão (como controle endógeno para ago2 RNA IP). Fold mudança foi calculado dividindo-se os valores normalizados de expressão de amostras ago2-immunoprecipiated por os valores normalizados de expressão das suas respectivas amostras de entrada. Os dados apresentados representam a média de pelo menos três experiências independentes. As barras de erro representam desvios padrão da média. Todas as comparações foram avaliados utilizando
t
-teste. *
P Art 0,05; **
P Art 0,01; ***
P Art 0,001;
ns
= não significativo.
Na segunda abordagem, quantificamos
Cyr61
e
mRNAs CTGF
mRNAs em ago2-imuno tanto
miR-205
-overexpressing e células descarregada, usando qRT-PCR e compararam seus níveis, com controles transfectadas por simulação. Esta experiência baseia-se no pressuposto de que miARNs e os seus alvos de ARNm são fisicamente associadas com o complexo de proteína contendo ago2. Portanto, esperávamos enriquecimento de mRNAs alvo em
miR-205
sobre-expressando células, ou esgotamento dos alvos em células com
miR-205
inibição. De fato, observamos enriquecimentos significativas de
Cyr61
(
P
= 0,050) e
CTGF
(
P
= 0,007) mRNAs em células HeLa com superexpressão de
miR-205
e esgotamento de ambas as transcrições em células CaSki com
miR-205
inibição (
P Art 0,001 para ambas as metas; Figura 4C e 4D) . Estes resultados sugerem que tanto o
Cyr61
e
CTGF Quais são alvos de
miR-205
em células cancerosas cervicais humanos.
Discussão
Observações da expressão aumentada ou diminuída de
miR-205
em diferentes tipos de tumores sugerem que
miR-205
podem ter diferentes funções no desenvolvimento do cancro, dependendo do tipo de célula envolvida. Em linha com esta noção, estudos anteriores demonstraram a sua função de supressão do tumor em células de cancro da mama e da próstata [22] – [24], e sua função de promoção do tumor em células de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço [14]. Neste trabalho, investigamos ainda mais as suas consequências funcionais e metas em células cancerosas cervicais humanos.
miR-205
regula a proliferação e migração celular no colo do útero células cancerosas humanas
Aqui , primeiro confirmada por qRT-PCR que
miR-205
é significativamente sobre-expressos em amostras de cancro do colo do útero em comparação com os seus homólogos normais. O resultado está de acordo com as nossas conclusões baseadas sequenciamento anterior [9], e com os dados de microarranjos relatados por Wang et al. [8]. Dado o aumento da expressão observada de
miR-205
em tecidos de cancro cervical, investigamos ainda as consequências funcionais da
miR-205
regulação em células cancerosas cervicais humanos. Em ambos
miR-205
células (HeLa e SW756) -overexpressing, observamos efeitos significativos sobre a proliferação e migração celular. Seguindo
miR-205
inibição em células CaSki, a proliferação foi significativamente reduzida, no entanto, o efeito sobre a migração celular foi revelado apenas na ferida ensaio de cura, mas não no ensaio de migração Transwell. Uma possível razão para essa discrepância é que a migração de células depende de diferentes fatores nos respectivos ensaios. A migração celular que ocorre durante a cicatrização de feridas é dependente da interacção célula-matriz. No entanto, no ensaio Transwell, as células são primeiro preparadas em suspensão de células individuais, que vai perturbar interacções célula-célula e célula-matriz. Além disso, a migração de células no ensaio Transwell pode depender do gradiente quimiotáctica, que não está disponível no ensaio de cicatrização da ferida.
Efeitos sobre a proliferação e migração celular semelhantes às observadas aqui no cancro do colo do útero humano também foram relatados em outros tipos de células. Por exemplo,
miR-205
superexpressão levou a um aumento da proliferação de células progenitoras em células epiteliais mamárias de rato [25] e a migração de células nos queratinócitos humanos [26]. Por contraste, a expressão aumentada de células [17] e do cancro da mama in
miR-205
foi encontrado para suprimir a proliferação de células de melanoma em [27], bem como migração de células de uma variedade de linhas celulares de cancro, incluindo SK- LU-1 do cancro de células pequenas do pulmão [28], glioblastoma U87 [28] e cancro renal A498 [19]. Tomados em conjunto, estes resultados apoiam ainda mais a dupla função de
miR-205
como um supressor de tumor ou um oncogene.
Cyr61
e
CTGF
como alvos novos de
miR-205
Devido à sua complexidade funcional, aplicamos uma abordagem bioquímica (CLIP-Chip) para identificar o
miR-205-
interações alvo
in vivo
. Usando essa abordagem, identificamos um conjunto de
miR-205
alvos de ambas as experiências gain- e perda de função. Entre estes, alguns são funcionalmente relacionados com proliferação e migração celular; o que é consistente com as consequências funcionais observadas neste estudo. Dois dos genes-alvo,
Cyr61
e
CTGF
, foram ainda validados em proteína e /ou níveis de ARN. No entanto, seu site interação precisa (s) precisa ser mais determinada por ensaios de repórter de luciferase. Neste estudo, não realizamos a inibição Cyr61 e CTGF em células de cancro do colo do útero, é possível que outro alvo (s) direto contribui para a
miR-205
mediada por efeitos na proliferação celular e migração. No entanto, estes genes tinham expressão significativamente inferior em amostras de cancro do colo do útero do que as suas contrapartes normais, sugerindo que eles podem desempenhar um papel importante na carcinogénese do colo do útero.
Proteínas
e CTGF Cyr61 são membros da rico em cisteína 61 de crescimento de tecido /conjuntivo fator /nephroblastoma (CCN) da família de reguladores de crescimento. Estas proteínas desempenham diversos papéis em diversos processos celulares, incluindo o desenvolvimento, a proliferação celular, adesão, migração, angiogénese e tumorigénese [29]. NCN são expressas de forma aberrante em uma ampla gama de tipos de tumores [29]. Curiosamente, ambos Cyr61 e CTGF podem funcionar como supressores de tumores ou oncogenes, dependendo do contexto celular (ver exemplos abaixo); que é semelhante à dupla função de
miR-205
.
Em concordância com nossas observações, a desregulamentação dos Cyr61 e CTGF também tem sido demonstrado em vários outros estudos. Por exemplo,
Cyr61
expressão é regulada no cancro do colo do útero [30], o cancro do pulmão [31] – [33], o cancro endometrial [34] e carcinoma hepatocelular [35]; No entanto, a sua sobre-regulação tem sido relatada em vários tipos de tumores, incluindo osteossarcoma [36], glioma [37], [38], e cancro da mama [39], [40]. Semelhante a Cyr61, estudos anteriores revelaram padrões de expressão conflitantes de CTGF em diferentes tipos de tumores. Por exemplo, a diminuição da expressão de CTGF tem sido relatado em cancro do pulmão [31], o cancro da mama [40], tumor de Wilm [41] e do ovário [42]; enquanto que a expressão aumentada foi encontrada em câncer papilar da tiróide [43], o cancro colorectal [44], carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas [45], [46] e glioblastoma [47].
Curiosamente,
miR -205
, Cyr61 e CTGF estão envolvidos em processos e caminhos funcionais comuns. Semelhante às consequências funcionais de
miR-205
observados neste estudo, Cyr61 foi mostrado para suprimir o crescimento de células do cancro do pulmão [32] e cancro hepatocelular [35]. Por outro lado, o silenciamento de Cyr61 suprime a proliferação e migração de células de glioma em [37] e as células cancerígenas pancreáticas [48]. Perda de
miR-205
expressão conduz a indução de células epiteliais para mesenquimal transição (EMT) [23], [24], enquanto que o silenciamento de expressão Cyr61 inibe EMT [48]. Esgotamento de
miR-205
e expressão Cyr61 inibe a sinalização Akt nos queratinócitos, células de carcinoma de células escamosas [14] e células de glioma [37]. Como Cyr61 e
miR-205
, o CTGF tem também sido demonstrada para desempenhar ambas as funções oncogénicas e supressores de uma vasta gama de tipos de células de cancro [45], [47], [49] – [51], e que também está envolvida em ambos os EMT [52], [53] e a Akt [54] – [56]. Apesar dos numerosos estudos mencionados acima, os papéis de Cyr61 e CTGF no cancro cervical humano permanecem obscuros. Será de interesse para determinar os papéis funcionais destes fatores no câncer de colo uterino e avaliar suas interações com o
miR-205
em diferentes tipos de câncer.
Em resumo, nós relatamos efeitos funcionais em fenótipos tumorais e novos alvos de
miR-205
em células cancerosas cervicais humanos. Mostramos que
miR-205
desempenha um papel oncogénica em cancro cervical humano, promovendo a proliferação e migração celular. Além disso, identificamos um conjunto de novela
miR-205
alvos usando uma combinação de abordagem bioquímica e microarray. Entre eles,
Cyr61
e
CTGF
foram ainda verificadas em proteína e /ou níveis de ARN. Mais importante, estes dois genes foram regulados negativamente em amostras de cancro cervical humano. Nossos resultados sugerem que
miR-205
e seus alvos (
por exemplo
Cyr61 e CTGF) podem desempenhar papéis importantes na patogénese do cancro do colo do útero, e que
miR-205
(e seus alvos) pode fornecer valores de diagnóstico potenciais para a patologia cervical.
Materiais e Métodos
Amostras de tecidos e Declaração de Ética
Trinta pares de tumor cervical snap-congelados e combinados tecidos normais provenientes de regiões adjacentes de 30 pacientes foram fornecidos pelo Gynecologic Oncology Group Banco de tecidos (Columbus, Ohio). Tumores e amostras de tecidos normais foram verificadas como tumor ou não tumor por exame histopatológico de hematoxilina e cortes de parafina corados-eosina. Vinte e nove pares de as amostras foram incluídos na nossa anterior pequena perfis de ARN por tecnologia de sequenciação profunda [9]. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Karolinska Institutet. Sem consentimento informado por escrito foi necessário porque todos os materiais clínicos foram-identificados. O conselho comitê de ética do Instituto Karolinska dispensada especificamente a necessidade de consentimento
linhas celulares de cancro do colo do útero
Sete linhas celulares de cancro do colo do útero humanos foram utilizados:. CaSki, HeLa, SW756, ME-180, SiHa, C4I e C33A. CaSki e ME-180 células foram inicialmente estabelecidas a partir de metástases de cancro do colo do útero, e as outras linhas de células foram derivadas de tumores cervicais primários [57] – [61]. Estas linhas foram gentilmente cedidas pelo Dr. Keng-Ling Wallin (Hospital Universitário Karolinska, Suécia), e tinha sido comprado de Cultura American Type Tissue (ATCC). CaSki e células ME-180 foram cultivadas em meio RPMI 1640, ao passo que HeLa, SW756, SiHa, C4I e células C33A foram cultivadas em meio DMEM. Todas as células foram suplementados com FBS a 10% e penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) e cultivadas de 1% a 37 ° C e 5% de CO
2 numa incubadora humidificada.
quantitativa TaqMan Transcrição Reversa -PCR (qRT-PCR)
Expressão de ARNm miARNs maduros e foi quantificado por qRT-PCR utilizando um rápido em tempo real do sistema de PCR Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems). O ARN foi extraído utilizando o kit de isolamento miRvana miARN (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX), aplicando-se o enriquecimento de pequeno RNA de amostras de tecido e isolamento de ARN total a partir de linhas de células. As concentrações de RNA foram medidos utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).
Para madura miARN, o ADNc foi sintetizado a partir de 25 ng de RNA pequeno enriquecida de ARN para amostras de tecidos, de 120 ng de ARN total para linhas celulares ou 15 ng de RNAs-imunoprecipitadas utilizando ago2 Taqman MicroRNA Transcrição reversa Kit (Applied Biosystems). Predesigned TaqMan microRNA ensaios para
miR-205
(ID 000509),
miR-21
(ID 000.397) e
miR-30a-5p
(ID 000417) foram adquiridos da Applied Biosystems. Todas as reacções foram realizadas em triplicado, em três ocasiões independentes, e os níveis de expressão relativos foram normalizados para a média geométrica de
RNU6B
(ID 001093) e
RNU43
(ID 001095), e classificado como 2
-ΔCT.
para a quantificação de mRNA, cDNA foi sintetizado a partir de 200 ng de RNA fração grande (
ou seja
fração RNA permaneceu após pequena enriquecimento RNA) para amostras de tecidos ou 50 ng ago2-imunoprecipitado RNAs utilizando High Capacity kit cDNA Transcrição reversa (Applied Biosystems).