Abstract

Temos demonstrado que o bloqueio CXCR4 pode ser uma terapia anti-metastático potente para câncer oral CXCR4-relacionado. No entanto, como antagonistas CXCR4 estão actualmente em uso clínico para induzir a mobilização de células estaminais hematopoiéticas, a administração contínua de um inibidor para a metástase podem levar a leucocitose persistente. Neste estudo, investigou-se a novo alvo a jusante terapêutico (s) do sistema /CXCR4 SDF-1, usando B88-SDF-1 de células, que têm um /sistema CXCR4 autócrino SDF-1 e exibem distante potencial metastático

In vivo

. Microarray Analysis revelou que 418 genes foram sobre-regulada em B88-SDF-1 das células. Foram identificados um gene que é altamente regulada positivamente em B88-SDF-1 das células, receptor metabotrópico de glutamato 5 (mGluR5), a qual foi regulada negativamente após o tratamento com 1,1 ‘- [1,4-fenilenobis (metileno)] bis-1,4 , octahydrochloride 8,11-tetraazaciclotetradecano (AMD3100), um antagonista de CXCR4. A sobre-regulação de ARNm de mGluR5 no sistema /CXCR4 SDF-1 foi predominantemente regulada pela cinase regulada por sinal extracelular Ras-(ERK) 1/2 via. Além disso, o crescimento de B88-SDF-1 de células não foi afectada pelo agonista de mGluR5 (S) -3,5-DHPG (DHPG) ou os antagonistas de mGluR5 2-Metil-6- (feniletinil) piridina (MPEP) e 3- ((2-metil-1,3-tiazol-4-il) etinil) piridina (MTEP). No entanto, observou-se que DHPG promovido B88-SDF-1 migração celular, enquanto que ambos MPEP e MTEP inibiu a migração de células B88-SDF-1. Para avaliar a toxicidade das drogas, os antagonistas foram intraperitonealmente injectadas em ratinhos imunocompetente durante 4 semanas. Os ratinhos injectados com MPEP (5 mg /kg) e MTEP (5 mg /kg) não apresentaram quaisquer efeitos secundários, tais como hematotoxicidade, reacções alérgicas ou perda de peso. A administração de antagonistas inibiu significativamente a metástase das células B88-SDF-1 para os pulmões de ratinhos nus. Estes resultados sugerem que o bloqueio mGluR5 com antagonistas como MPEP e MTEP poderia impedir a metástase no câncer oral relacionados com o CXCR4 sem causar efeitos colaterais

Citation:. Kuribayashi N, Uchida D, Kinouchi M, Takamaru N, Tamatani T, Nagai H, et al. (2013) o papel do glutamato metabotrópicos do receptor 5 no fator-1 /Sistema CXCR4 derivadas de células do estroma no câncer oral. PLoS ONE 8 (11): e80773. doi: 10.1371 /journal.pone.0080773

editor: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2013; Aceito: 06 de outubro de 2013; Publicação: 13 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kuribayashi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma Grant-in-Aid para Jovens cientistas (B; 24792225; https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nós já demonstraram que as células B88, as células cancerosas orais que expressam o receptor de quimiocinas CXCR4, especificamente. metástases para nódulos linfáticos cervicais através de um factor derivado de células do estroma (SDF) -1 gradiente produzido pelo estroma linfático [1-3]. A expressão forçada de SDF-1 em células B88 (chamado B88-SDF-1 células) conferiu reforçada motilidade celular e metástases nos pulmões a seguir à inoculação intravenosa [4]. Recentemente, foi também demonstrado que a expressão de CXCR4 contribui para o potencial metastático de cancros das glândulas salivares [5]. Além disso, também demonstramos que o bloqueio CXCR4 com 1,1 ‘- [1,4-fenilenobis (metileno)] bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano octahydrochloride (AMD3100), um antagonista de CXCR4, pode ser um potente anti terapia -metastatic de cabeça relacionadas com o CXCR4 e pescoço [5,6].

SDF-1 /sistema de CXCR4 funciona principalmente como um fator quimiotático em células cancerosas para chegar a locais metastáticos. No entanto, a fim de estabelecer a metástase, vários processos importantes, tais como invasão, intravasamento, extravasamento e um potencial de crescimento ectópica, são indispensáveis. Assim, é crítico para investigar a função de objectivo (s) a jusante responsável pelo estabelecimento de metástases no sistema de SDF-1 /CXCR4. Além disso, estudos clínicos recentes demonstraram que uma única administração de AMD3100 é eficaz na mobilização de células estaminais hematopoiéticas, não obstante o facto de AMD3100 é rapidamente eliminado com uma semivida de distribuição estimada de 0,3 horas e uma meia-vida terminal de 5,3 horas [7, 8]. No entanto, as terapias eficazes relacionadas com a CXCR4 anti-metastáticos podem exigir a administração diária de AMD3100 continuamente para prevenir a migração de células para locais premetastatic metastáticos, que podem causar leucocitose crónica. Se o gene alvo a jusante (s) de SDF-1 de sistema /CXCR4 expresso especificamente em células cancerosas foram identificados, espera-se que a terapia anti-metastático pode ser realizado de forma mais segura e eficaz. No entanto, o gene-alvo (s) de SDF-1 de sistema /CXCR4 não são completamente compreendidos. Assim, no presente estudo, investigou-se a novo alvo a jusante terapêutico (s) do sistema de SDF-1 /CXCR4 nas células B88-SDF-1, que tem um /sistema CXCR4 autócrino SDF-1 e exibem potencial metastático distante in vivo, utilizando microarrays de cDNA [4].

Materiais e Métodos

Ética declaração

Os ratos foram tratados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Tokushima (número de autorização: 10084). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

cDNA microarray análise

Total de RNA para análise cDNA microarray foi extraído de células B88-simulada privadas de soro e células B88-SDF-1. O Biosystems quimioluminescente RT-IVT Labeling Kit Aplicada (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foi utilizado para converter o ARN total a digoxigenina (DIG) marcado com ARNc. Um? G de ARN total foi usada para gerar o ADNc de cadeia dupla. O cDNA foi transcrito com nucleotídeos DIG-rotulados (Roche Diagnostics, Basileia, Suíça), fragmentados e hibridizadas com a Pesquisa do Genoma Humano Array (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de se lavar cada matriz, o sinal foi desenvolvido com o uso de um kit de detecção de quimioluminescência (Life Technologies). matrizes processados ​​foram digitalizados com um analisador de microarray quimioluminescente 1700 (Life Technologies). Estes resultados foram analisados ​​com o uso de GeneSpring GX 12,5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA) de software. análise funcional do IPA identificou funções biológicas ou doenças que eram mais significativo para o conjunto de dados. O teste exato de Fischer foi utilizado para calcular um valor p determinar a probabilidade de que cada função biológica ou doença atribuído a esse conjunto de dados foi devido apenas ao acaso. Os dados de microarranjos bruto são depositados em Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) de acordo com informações mínimas sobre o experimento de microarray diretrizes (Miame). O número de acesso é GSE50507.

Células e cultura de células

B88 células foram originalmente estabelecida a partir de um paciente com câncer de língua [1] e considerados livres de micoplasma e contaminantes bacterianos. As células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 ug /mL de estreptomicina e 100 U /mL de penicilina, numa atmosfera humidificada de 95 % de ar e 5% de CO2 a 37 ° C

glutamato ensaio

Um total de 5 x 10

6 células, foram semeadas em placas de 100 mm (Falcon;. Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, EUA). O meio foi substituído com DMEM sem L-glutamina e FCS após 24 h. Após uma cultura de 24 h adicionais, o meio condicionado foi recolhido e 100 uL foi analisada com um Amplex® Vermelho Ácido glutâmico /glutamato oxidase Assay Kit (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência foi medida com um Varioskan flash multimodo Reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) com 530 nm de excitação e 590 nm de detecção de fluorescência.

Ratos e in vivo estudo

C3H /ave ratinhos nus ratos e ratinhos BALB /c foram adquiridos de CLEA Japan (Osaka, Japão) e foram mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos. Na quimioterapia experimental, os ratinhos C3H /HeN foram utilizados como ratinhos de controlo imunocompetentes [9], e foram tratados diariamente com ou (SC), injecções subcutâneas de AMD3100 (2,5 mg /kg; Sigma) [5,6] ou intraperitoneais (ip) injecções de 2-metil-6- (feniletinil) piridina (5 mg /kg; MPEP; Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) [10], 3 – ((2-metil-1,3-tiazol-4-il) etinil ) piridina (5 mg /kg; MTEP; Calbiochem, San Diego, CA, EUA) [10], ou o mesmo volume de solução salina. Os ratinhos tratados com AMD3100 foram sacrificados nos dias 1, 14 e 28, e os ratinhos tratados com MPEP ou MTEP foram sacrificados nos dias 1, 7, 14, 21 e 28. Todos os ratos foram sacrificados por exsanguinação sob anestesia com pentobarbital de sódio e de um hemograma completo contagem foi realizada utilizando um ADVIA120 (Siemens Healthcare Diagnostics KK, Tóquio, Japão) em Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (Tóquio, Japão). Para o ensaio de metástase, 1 x 10

6 B88-SDF-1 de células foram inoculadas por via intravenosa (i.v.) antes do tratamento com os agentes. Os ratinhos foram sacrificados 30 dias após a inoculação das células e os pulmões foram extirpados e bifurcados. Uma metade do pulmão foi fixado para análise histopatológica e coradas com H-E e o outro foi ligado para a análise quantitativa utilizando Alu-PCR. Os iniciadores que foram usados ​​para Alu-PCR foram Halu-UP: ACGCCTGTAATCCCAGCACTT, Halu-DN: TCGCCCAGGCTGGAGTGCA [11]. produtos específicos do gene foram medidos continuamente por um ABI PRISM 7000 Sequence Detection System para 35 ciclos usar o Thunderbird Mix SYBR® qPCR (TOYOBO, Osaka, Japão).

RT-PCR

As células cultivadas como monocamadas foram colhidas em sub-confluência. Após 24 h, o ARN foi isolado com o reagente TRIzol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. RT-PCR para mGluR5 e desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH) de ARNm foi realizada sob as seguintes condições: 94 ° C durante 2 min; depois 30 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 1 min e 72 ° C durante 1 min; e uma extensão final a 72 ° C durante 1 min. As sequências dos iniciadores para mGluR5 humano e GAPDH foram os seguintes: mGluR5-UP: 5′-TGGCCACCCTGTTTGTTACT-3 ‘, mGluR5-DN: 5′-GCACTGAGGCTGACCGAGAA-3′, GAPDH-UP: 5’-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3 ‘, e GAPDH- DN: 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 ‘. Para RT-PCR quantitativo, examinámos a expressão de mGluR5 e GAPDH por um

Δ

ΔCT método. mGluR5 e ARNm GAPDH foram detectados simultaneamente com Taqman

TM Gene Expression Assays (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. produtos específicos de genes foram continuamente medido por um sistema de PCR ABI StepOnePlus Real-Time durante 40 ciclos de PCR.

análise de citometria de fluxo

logaritmicamente crescente células foram tratadas com tripsina e fixados em paraformaldeído a 4% (V /V) em gelo durante 10 min. As células foram lavadas e incubadas com mAb anti-mGluR5 (diluição 1: 100; R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes com D-PBS (-), em seguida, incubadas com ficoeritrina (PE) marcado com cabra anti-rato IgG (Serotec, Sapporo, Japan) durante 30 min à temperatura ambiente e analisadas com um citómetro EPICS fluxo (Coulter, San Jose, CA, EUA)

análise de imunofluorescência

as células foram semeadas no Falcon CultureSlides (Falcon;. Becton Dickinson médico laboratorial). Vinte horas mais tarde, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min à temperatura ambiente. Após lavagem das células com PBS, a ligação não específica foi bloqueada com BSA 1% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. As células foram então incubadas com um anticorpo monoclonal primário de coelho contra mGluR5 (Genway Biotech, San Diego, CA, EUA). foi usada com Alexa Fluor 488 conjugado com anticorpo IgG anti-coelho (Life Technologies) para a detecção. As lâminas foram contrastadas com DAPI (Life Technologies) e montado com ouro Prolongar Antifade Reagente (Life Technologies). sinais de fluorescência foi observada com um microscópio confocal (Nikon, Tokyo, Japão). Para a detecção da F-actina, B88-SDF-1 foram incubadas com 100 uM de agonista de mGluR5, (S) -3,5-DHPG (DHPG; TOCRIS) [12], MPEP 20 pM ou 20 pM MTEP. Após 24 h, as células foram coradas com faloidina Alexa Fluor 488 conjugado (Life Technologies) e a imunofluorescência foi detectado com um microscópio de epifluorescência (Nikon, Tokyo, Japão).

ensaio MTT

Um total de 5 x 10

3 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços (Falcon, Becton Dickinson Labware) em DMEM suplementado com 10% de FCS . Após 24 h de cultura, as células foram tratadas com 100 uM DHPG, MPEP 20 pM ou 20 pM MTEP durante 48 h. O número de células foi quantificada utilizando o ensaio de MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio, Sigma].

Wound ensaio

Após 24 h de cultura, uma ferida linear foi gerado por raspagem a monocamadas confluentes de células com uma pipeta de ponta na presença de 100 uM, quer DHPG ou 20 ou 20? M MPEP MTEP uM. células não ligadas foram lavados com agitação. As células foram fotografadas no mesmo local da grade após 48 h. Cada linha foi banhado e feridos em triplicado.

In vitro migração celular ensaio

O

in vitro

migração de células de câncer bucal foi avaliada utilizando uma câmara de Transwell (Corning, Corning, NY, EUA). As células nos poros da membrana ou células ligadas à superfície inferior da membrana foram contados em 10 campos de vista em grande ampliação (x 400). Em algumas experiências, 100 uM DHPG, 20 ou 20? M MPEP MTEP iM foi adicionado às células semeadas na câmara superior.

A análise estatística

As diferenças estatísticas entre os valores médios dos diferentes grupos de tratamento foram avaliados com StatView 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA, EUA), utilizando uma ANOVA de uma via com o conjunto de significância em

p Art 0,05.

Resultados

Isolamento do gene alvo, o receptor de glutamato metabotrico 5, que é induzida pelo sistema de SDF-1 /CXCR4

investigado novo alvo terapêutico jusante ( s) do sistema de SDF-1 /CXCR4 usando as células cancerosas orais, B88-SDF-1, que têm um sistema /CXCR4 autócrina SDF-1 e exibem potenciais metastáticos distantes

in vivo

. Microarray Analysis revelou que 418 genes foram sobre-regulada em B88 SDF-1 de células em comparação com células falsamente, e que a expressão do receptor de glutamato metabotrico 5 (mGluR5) aumentou 46 vezes (5 a partir do topo) em B88 SDF-1 das células, com a maior pontuação correspondente à via de mGluR5 como mostrado por IPA (dados não mostrados). Além disso, Park e seus colegas demonstraram que a expressão mGluR5 forte está associado com a sobrevida do paciente e que os antagonistas de mGluR5 inibir a migração de células cancerosas orais

in vitro

[13]. Assim, analisamos mGluR5 como um gene candidato possível envolvidos no sistema /CXCR4 SDF-1. Para confirmar a especificidade da análise de microarranjo, a expressão de ARNm de mGluR5 foi confirmada por RT-PCR. Semelhante aos resultados de microarray, a expressão de ARNm de mGluR5 foi regulada positivamente em B88-SDF-1 das células, em comparação com células falsamente (Figura 1A) e inibida por tratamento com AMD3100 (Figura 1A). Anteriormente, demonstrou que o sistema /CXCR4 SDF-1 activa tanto do Ras-extracelular quinase regulada por sinal (ERK) 1/2 e o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) vias -Akt [1]. Por isso, ao lado examinado o envolvimento destas vias na regulação positiva de mGluR5. A expressão de mGluR5 foi completamente abolida por tratamento com U0126, um inibidor da MEK e parcialmente inibida com wortmanina, um inibidor de PI3K (Figura 1B). Também obtivemos os resultados semelhantes no quantitativo de RT-PCR (Figura 1C). Além disso, a regulação positiva da proteína mGluR5 foi também observada em citometria de fluxo e os resultados imunocitoquímica (Figura 1D, E).

(A) Expressão de ARNm de mGluR5 foi confirmada em B88-B88-simulada e SDF-1 em células, tanto na presença como na ausência de AMD3100 (1 ug /ml). placenta humana foi utilizado como controlo positivo (PC). (B) As células foram tratadas com U0126 (10 nM) ou wortmanina (50 nM) durante 48 h e a expressão de ARNm de mGluR5 foi analisado por RT-PCR. (C) A expressão do ARNm de mGluR5 foi confirmada pela PCR em tempo real. **;

p Art 0,01 quando comparado com as células não tratadas B88-SDF-1 por ANOVA de uma via. ND; não detectável. (D) Expressão das proteínas de mGluR5 foi avaliada em B88-simulada e células B88-SDF-1 utilizando citometria de fluxo. Logaritmicamente crescentes células foram incubadas com ou sem mAb anti-mGluR5 e coradas com IgG de cabra marcado com PE anti-ratinho. zonas brancas e vermelhas indicam células coradas com o controlo do isotipo e o mAb anti-mGluR5, respectivamente. (E) Expressão das proteínas de mGluR5 foi detectado por imunocitoquímica. O núcleo foi corado com DAPI (azul)

A expressão de receptores de glutamato no B88-SDF-1 células

Os receptores de glutamato são divididos em duas categorias.; mGluR e GluRs ionotrópicos (iGluR), os quais são ainda caracterizados como a N-metil-D-aspartato (NMDA), o a-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico (AMPA) ou receptores de cainato (KA) [14,15]. Nós validada a expressão dos receptores de glutamato envolvidos no sistema de SDF-1 /CXCR4 utilizando uma micromatriz de ADNc. Dos tipos de mGluR 8 examinados, apenas a expressão de mGluR5 foi marcadamente regulada positivamente em B88-SDF-1 de células (Tabela 1). Além disso, um dos 14 tipos de iGluR examinados, a expressão de GluR1, um receptor de AMPA, um aumento de 6 vezes na B88-SDF-1 de células (Tabela 2).

Grupo

mGluRs

Dobre induction

*

ImGluR11.27mGluR546.13IImGluR20.98mGluR30.67mGluR40.19IIImGluR61.54mGluR71.06mGluR80.46Table 1. A expressão de mGluRs em análise de cDNA microarray.

* Regulação positiva de B88-SDF-1 células contra células B88-simulada CSV Baixar Grupo CSV

iGluRs

Dobre indução

*

AMPAGluR16.05GluR21.42GluR3NDGluR41.04KAGluR50.46GluR60.47GluR70.84KA10.41KA20.39NMDANMDA12.34NMDA2A2.21NMDA2B0.71NMDA2C0.12NMDA2D1.23Table 2. A expressão de iGluRs em análise de cDNA microarray.

* Regulação positiva de B88-SDF-1 células contra células B88-simulada CSV Baixar CSV

A produção de glutamato nas células cancerosas orais

A seguir, examinou a produção de glutamato, um ligando de mGluR5, em B88 e seus transfectantes, B88-B88-simulados e SDF-1 de células. O glutamato produção foi detectada no meio condicionado derivado a partir destas células, a uma concentração de cerca de 12 pM (Tabela 3). No entanto, a produção de glutamato não era dependente quer o sistema de SDF-1 /CXCR4 ou o nível de expressão de mGluR5.

Cells

B88

B88-B88 simulada-SDF-1 liberação

glutamato (M) 12,23 ± 0.3012.17 ± 0.1712.21 ± 0.29Table 3. Produção de glutamato no câncer oral células.

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o papel do mGluR5 no crescimento celular

Foi examinado o efeito de mGluR5 no crescimento celular por meio de um agonista de mGluR5 específicos, DHPG, e dois antagonistas, MPEP e MTEP. O agonista e antagonistas não afectou o crescimento, quer do B88-simulada ou as células B88-SDF-1 (Figura 2).

Uma monocamada confluente de células foi tratado com 100 uM DHPG, 20? M MPEP (A) ou MTEP 20 uM (B). O efeito de mGluR5 no crescimento celular foi avaliado utilizando o ensaio de MTT. Não houve diferenças significativas entre os três grupos por ANOVA one-way.

O papel do mGluR5 na SDF-1 /dependente CXCR4-migração celular

A seguir, investigou o efeito de mGluR5 na migração SDF-1 /dependente CXCR4-de células. Os ensaios de cura de feridas revelou que a motilidade aumentada de B88-SDF-1 de células foi ainda mais acelerada com o tratamento DHPG, mas foi significativamente afectada pelo tratamento e MPEP MTEP (Figura 3A, B). Antagonistas de mGluR5 também inibiram a migração de células B88-SDF-1, como demonstrado por um ensaio de câmara de migração (Figura 3C). Além disso, DHPG reforçada polimerização de actina F na vanguarda, enquanto MPEP e MTEP inibida polimerização F-actina (Figura 3D-G). Observou-se também a inibição da invasão de matrigel com tratamento MTEP em B88-SDF-1 de células (dados não apresentados).

(A), B88-B88-simulada ou SDF-1 células foram cultivadas até à confluência. Um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada na presença de 100 uM, quer DHPG, MPEP 20 pM ou 20 pM MTEP. (B) Os dados quantitativos derivados de (A). *;

p Art 0,05 quando comparado com células tratadas com DHPG por ANOVA de uma via. (C) A motilidade de B88-SDF-1 em células na presença de 100 uM, quer DHPG, 20 ou 20? M MPEP MTEP uM foi examinada utilizando um ensaio de migração Transwell. *;

p Art 0,05 quando comparado com o controlo não tratado ou células tratadas com DHPG por ANOVA de uma via. de polimerização (D-G) de F-actina no bordo de ataque de B88-SDF-1 de células foi examinada pela imunocitoquímica seguinte (D) sem tratamento, o tratamento de (E) DHPG, (F) o tratamento MPEP e (G) tratamento MTEP. Núcleo foi corado com DAPI (azul).

Efeito de antagonistas de mGluR5 em ratos imunocompetentes

Porque mGluR5 pode ser um novo alvo metastático em câncer bucal, foram avaliados os efeitos colaterais dos antagonistas de mGluR5 em ratinhos C3 /galinha. Nenhuma perda de peso ou anormalidades de órgãos macroscópicas foram detectadas nos ratos que foram tratados com os antagonistas de mGluR5 MPEP e MTEP (dados não mostrados). Além disso, estes antagonistas não induziu hematotoxicities, tais como anemia e leucocitose (Figura 4A-C). Também foram avaliados os efeitos colaterais de AMD3100 em ratos C3H /galinha. Nenhuma perda de peso, alterações macroscópicas de órgãos ou alteração dos glóbulos vermelhos contagem foi observada em ratinhos administrados com AMD3100 (dados não mostrados); no entanto, foi observada leucocitose significativa e crônica após s.c. diária administração de AMD3100 (dados não mostrados).

camundongos C3H /ave foram tratados i.p. com MPEP (5 mg /kg), MTEP (5 mg /kg) ou o mesmo volume de solução salina diária. Os ratinhos foram sacrificados nos dias 1, 7, 14, 21, e 28 por exsanguinação e WBC (

Um

), células vermelhas do sangue (RBC; B) e hemoglobina (Hb; C) foram medidos. Não houve diferenças significativas entre os três grupos por ANOVA one-way.

O papel do mGluR5 na SDF-1 /dependente de CXCR4 metástase celular

Assim, determinou-se a efeito de antagonistas de mGluR5 em metástases do pulmão de células B88-SDF-1. Numerosos nódulos metastáticos foram detectados nos pulmões de ratinhos que foram inoculados com B88-SDF-1 de células (Figura 5A, esquerda). No entanto, foi observada uma redução significativa nos nódulos metastáticos do pulmão em ratinhos tratados com MPEP (Figura 5A, meio) e MTEP (Figura 5A, à direita), como mostrado por análise histopatológica, durante um período de observação de 4 semanas. Nós também confirmou a presença de células cancerosas metastáticas em tecido de pulmão extraído utilizando Alu-PCR quantitativa. Consequentemente, a expressão do ADN Alu humano em ratinhos tratados com antagonistas de mGluR5 foi significativamente mais baixa do que em ratos tratados com solução salina (Figura 5B).

As células foram inoculadas no vaso sanguíneo de ratos nus, os quais foram sacrificados no dia 30. (A) representativas H E de coloração dos pulmões de tratamento de controlo (esquerda), MPEP-tratadas (meio), MTEP-tratada (à direita) ratinhos nus. (B) A análise quantitativa por Alu-PCR foi realizada sobre os tecidos extirpados-pulmonares. **,

p Art 0,01 quando comparado com o controlo de solução salina por ANOVA de uma via.

Discussão

O glutamato é um ligando original para mGluR5, um receptor de glutamato metabotrópico que pertencem à família de proteína G acoplado receptores [16,17] que é ubíqua encontrada no córtex cerebral, hipocampo, núcleo caudado e núcleo accumbens do sistema central nervoso (CNS) [16,17]. Tem sido sugerido que o mGluR5 está envolvido em distúrbios do SNC que são induzidas pela hipersecreção de glutamato, tais como a epilepsia, dor neurogénica ou inflamatória, psicose, discinesia, dores de cabeça e dependência de drogas [16,17]. Ao nível celular, mGluR5 regula o crescimento e a migração das células da glia [18], as células estaminais precursoras neurais [19], as células estaminais embrionárias [20] e células de glioma de [21]. Embora o papel do mGluR5 na progressão do câncer ainda não está claro, investigações recentes sugerem que as funções de mGluR5 no cólon [22], de mama [22] e as células de câncer de próstata [23]. Além disso, Park e seus colegas demonstraram que a expressão mGluR5 forte está associado com a sobrevida do paciente e que os antagonistas de mGluR5 inibir a migração de células cancerosas orais

in vitro

[13]. Estes resultados sugerem que as funções de mGluR5 como um oncogene em tumores sólidos, incluindo o cancro oral. Nas outras mãos, investigações recentes demonstraram que o glutamato é produzido por células mesenquimais, tais como osteoblastos e osteoclastos, células epiteliais, tais como as células dos ilhéus pancreáticos e queratinócitos, da mama e cancro da próstata células [24-27]. Além disso, a produção de glutamato em células de glioma foi relatado para ser associado com a proliferação e invasão [21,28,29]. Além disso, tomar banho e colegas demonstraram aumentou significativamente as concentrações de glutamato no soro de doentes com cancro do pâncreas, tal como medido por análise metabolômicas [30]. No presente estudo, nós demonstramos que as células B88 e seus derivados transfectadas, produzem glutamato no seu meio condicionado a uma concentração de cerca de 12 uM. Estas concentrações foram semelhantes para os resultados descritos por Seidlitz e colegas na linha celular de cancro da mama, MDA-MB-231 [29]. Estes resultados indicam que o glutamato e o seu receptor está relacionado com a progressão do cancro. No entanto, não foi observada nenhuma diferença na produção de glutamato entre o B88-simulada e as células B88-SDF-1, embora a expressão de mGluR5, um receptor de glutamato, foi regulado positivamente em B88-SDF-1 das células. Estes resultados sugerem que a expressão de mGluR5, em vez de produção de glutamato, é necessário para o sistema glutamatérgico para ser envolvido na sinalização SDF-1 /CXCR4.

Recentemente, os antagonistas de mGluR5 sintéticos têm sido desenvolvidas como potenciais drogas para distúrbios do sistema nervoso central que são induzidas pela hipersecreção de glutamato [11,31,32]. Tem sido relatado que a administração de MPEP MTEP e tem sido utilizada para tratar eficazmente os sintomas de dor, doença de Parkinson, desordem da cognição, depressão, ansiedade e esquizofrenia, [16,17]. Embora inicialmente utilizado MPEP como um antagonista de mGluR5 no presente estudo, as acções não específicas significativas de MPEP, incluindo a inibição de receptores de AMPA ou de NMDA, foram indicadas [10]. Além disso, detectou-se aumento de 6 vezes na expressão de GluR1, um receptor de AMPA envolvidos no crescimento e invasão de células de glioma, em B88-SDF-1 células [33,34]. Para excluir os efeitos não-específicos de MPEP em mGluR5, re-avaliou o papel do mGluR5 no sistema de SDF-1 /CXCR4 utilizando o recentemente desenvolvido mGluR5 antagonista MTEP, que é mais altamente selectivos para mGluR5 e tem menos efeitos fora do alvo de MPEP [10]. No entanto, ambos MPEP e MTEP teve efeitos semelhantes sobre a migração e metástase das células B88-SDF-1, indicando um efeito específico de mGluR5 no sistema /CXCR4 SDF-1.

Detectamos efeitos aditivos dos agonistas mGluR5 DHPG em ensaio de migração, apesar de conter uma grande quantidade de glutamato na mídia. Embora não se observou a activação directa de mGluR5, considera-se que activam provavelmente DHPG mGluR5 em B88-SDF-1 células por DHPG não melhorou a migração em células falsamente, que não expressam mGluR5 (dados não mostrados). Cleva e Olive demonstrado que mGluR5 são fisicamente acopladas aos receptores de NMDA por várias proteínas do andaime, e são bioquimicamente acoplado a função do receptor de NMDA por via da PKC [35]. Além disso, esta interacção de mGluR5 por NMDA tem sido observada em várias preparações de cérebro, em que a activação de receptores de mGluR5 com DHPG potencia as respostas mediadas pelo receptor de NMDA para aplicada exogenamente glutamato ou de NMDA [35]. Dado que as células B88-SDF-1 expressam receptores de NMDA na nossa análise de microarray (Tabela 1), este efeito aditivo de DHPG pode ser devido à concomitante activação da via do receptor de NMDA.

No presente estudo, demonstramos o envolvimento da Ras-ERK1 /2 caminho na regulação positiva de mGluR5 pelo sistema /CXCR4 SDF-1. Embora uma associação entre mGluR5 e o sistema de SDF-1 /CXCR4 não tem sido relatada em células cancerosas, Luo e colegas demonstraram a indução de mGluR5 em células precursoras neurais E14.5, estimulando com SDF-1. Eles também sugeriu que a expressão de mGluR5 pelo sistema /CXCR4 SDF-1 é induzido pelo factor de transcrição, Ets, que é activado pela via de ERK1 /2 de sinalização [36]. Porque o

gene mGluR5

tem locais de ligação Ets nos seus promotores [37], o /ERK1 /2 /Ets via CXCR4 podem estar envolvidos na indução de mGluR5 que foi observado na nossa experiência.

Nós fizemos a mesma experiência utilizando uma linha de células CCE oral, HNT, em que a expressão de CXCR4 é 7,5 vezes menor do que em células B88 [1]. HNT-SDF-1 células exibiram ligeira, mas não significativas, as alterações fenotípicas in vitro e in vivo [4], e a indução de mGluR5 foi detectado em apenas um nível marginal, provavelmente devido à redução da expressão de CXCR4, em comparação com a de células B88. Assim, o CXCR4 nível de expressão e a sinalização a jusante forte pode ser também crítico para a activação da via de mGluR5.

Nós descobrimos que os antagonistas de mGluR5 inibiu significativamente a migração e metástase SDF-1 /dependente de CXCR4. Embora o sistema de /CXCR4 SDF-1 funciona principalmente como um factor quimiotáctico de células cancerosas, mas também está envolvida em diversos processos metastáticos, tais como neovascularização, a adesão celular, invasão, crescimento epitelial e mesenquimal para [38-43]. No presente estudo, mGluR5 regulada a migração de células associadas com o sistema de SDF-1 /CXCR4; No entanto, é pouco provável que os antagonistas de mGluR5 suprimir SDF-1 metástase /dependente de CXCR4 apenas através de migração celular inibido. Embora mGluR5 foi mostrado para aumentar a adesão e invasão das células cancerosas orais [13] e o crescimento de células neurais [44], existe pouca informação disponível sobre as funções relacionadas com a metástase. mGluRs ativar ambas as vias MAPK e Akt, que são duas vias da indicação sinalização que promovem o crescimento e metástase [45,46] câncer. Assim, a segmentação de mGluR5 pode suprimir estas vias metastáticos críticos e inibir a metástase do cancro.

Em nosso estudo anterior, foi detectada expressão CXCR4 em aproximadamente 60% dos cancros orais primárias e concluiu que os casos CXCR4-positivos tiveram um prognóstico significativamente pior do que os casos CXCR4-negativas [3]. Apesar de não examinar a expressão de mGluR5 em tecidos de câncer oral, Park e seus colegas demonstraram que 70% dos cancros orais expressar mGluR5 e que a sobre-expressão de mGluR5 diminui a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer oral [13]. Tomados em conjunto, a associação entre o CXCR4 e mGluR5 é fortemente sugerido para promover a progressão do cancro oral. Para nosso conhecimento, os antagonistas de mGluR5 MPEP e MTEP ainda não estão disponíveis clinicamente, embora sem efeitos colaterais significativos foram relatados nos estudos em animais [10]. No presente estudo, a administração de antagonistas de mGluR5 não causou perda de peso ou hematotoxicidade em ratinhos imunocompetentes.