PLOS ONE: Regulatory Função B celular é suprimida pelo tabagismo e obesidade em H. pylori Assuntos infectadas e está correlacionada com elevado risco de câncer gástrico

Abstract

infecção por Helicobacter pylori

ocorre em mais da metade da população do mundo e é a principal causa para o câncer gástrico. Uma série de estilo de vida e nutricionais fatores, como tabagismo e obesidade, foram encontrados para elevar o risco de desenvolvimento de câncer. Neste estudo, buscou-se determinar os aspectos imunológicos durante

H

.

pylori

infecção e desenvolvimento de câncer gástrico. Descobrimos que as células B de

H

.

pylori

pacientes infectados apresentaram composição e função alterada em comparação com pacientes não infectados. IL-10 expressando CD24

+ CD38

+ B células foram upregulated em

H

.

pylori

pacientes infectados, continha actividade de regulação significativa na inibição de células T secreção de citocinas pró-inflamatórias, e respondeu diretamente ao

H

.

pylori

antígeno estimulação. Curiosamente, em

H

.

pylori

indivíduos fumadores infectados e pacientes obesos, o número de IL-10

+ B células e CD24

+ CD38

+ B células foram reduzidas em comparação com

H

.

pylori

infectados indivíduos assintomáticos. As funções reguladoras mediadas por CD24

+ CD38

+ B células também foram prejudicadas. Além disso, os pacientes positivos câncer gástrico tinha reduzido IL-10 produtoras de frequências das células B após o

H

.

pylori

-stimulation. Em conjunto, esses dados sugerem que em

H

.

pylori

-infecção, CD24

+ CD38

+ células B é regulada positivamente e desempenha um papel na supressão de respostas pró-inflamatórias, possivelmente através de produção de IL-10, uma característica que não foi observada em fumadores e pacientes obesos

Citation:. Li G, H Wulan, Song Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) Regulatory Função B celular é suprimida pelo tabagismo e obesidade em

H

.

pylori

Assuntos infectado e está correlacionada com elevado risco de câncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10.1371 /journal.pone.0134591

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPÃO

Recebido: 03 de fevereiro de 2015; Aceito: 13 de julho de 2015; Publicação: 30 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Helicobacter pylori (H

.

pylori)

é uma espécie de bactérias patogênicas Gram-negativos encontrados em mais da metade da população do mundo e preferencialmente inibe o trato gastrointestinal superior, incluindo o epitélio do estômago e o tracto duodeno [1,2]. Embora a grande maioria ( 80%) de infecções são assintomáticos, 10-20% dos indivíduos infectados irá desenvolver úlceras pépticas enquanto 1-2% adquirirá cancro gástrico [3]. O mecanismo preciso de desenvolvimento de câncer como resultado da

H

.

pylori não está bem definida, mas não tratada inflamação crónica no tracto gastrointestinal superior é pensado para contribuir para a continuação danos do epitélio do estômago [4,5]. Especificamente, moléculas, tais como o factor de necrose tumoral alfa (TNF-a) sinalização associada à inflamação, têm sido encontrados para promover a tumorigénese gástrica e é regulada positivamente em

H

.

pylori

infecção [6]. Outras citocinas pró-inflamatórias segregadas pelas células T, incluindo IL-2, IL-17 e interferon gama (IFN-g), também são regulados positivamente em

H

.

pylori

infecção e estão associados ao aumento do risco de desenvolvimento de neoplasias gástricas [7-10]. Uma série de outros fatores, tais como a exposição contínua ao fumo do tabaco e obesidade, são positivamente correlacionados com o aumento do risco de câncer gástrico, embora o mecanismo subjacente não é clara [3,11].

Recentemente, o papel de tolerance- indução de células B tem sido caracterizado por uma série de doenças infecciosas e doenças auto-imunes [12]. Em camundongos, CD1d

hiCD5

+ B células foram encontrados para ajudar a estabelecer ambiente tolerogênico em tecidos e ter um papel na prevenção de indução auto-imune [13]. Nos seres humanos, as células CD19

+ CD24

hiCD38

oi B têm semelhante tolerância de indução de papel no saudável, bem como indivíduos infectados pelo VHB [14]; o início da doença auto-imune está correlacionada com a perda da função reguladora neste subconjunto de células B [15]. IL-10 é uma citocina imuno-regulador pleiotrópico que é capaz de inibir uma série de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-2, IL-17, IFN-g e TNF-a, e é mostrado para suprimir potencialmente a capacidade apresentadora de antigénio de As células apresentadoras de antigénio [16]. Central para todos os subconjuntos de células B de indução de tolerância, a produção de IL-10 é essencial para B regulação mediada por células na supressão da inflamação mediada por células T [12,17]. O papel da regulação mediada por células B em

H

.

pylori

e indução subsequente de câncer gástrico, no entanto, não foi previamente estudado.

Neste estudo, analisamos o perfil de composição de células B e de expressão das citocinas em

H

.

pylori

indivíduos infectados. O aumento das percentagens de CD24

+ CD38

+ B células e reduzidas percentagens de células B virgens e células B de memória em repouso foram encontrados em

H

.

pylori

assuntos i-infectados. O CD24

+ CD38

+ células B em

H

.

indivíduos infectados com H. pylori tinham

aumento percentual da produção de IL-10, e suprimiu a expressão de citoquinas pró-inflamatórias quando co-cultivadas com células T autologous.

H

.

pylori-s

timulated CD24

+ CD38

+ B células de

H

.

pylori

indivíduos infectados potente secretadas IL-10. Curiosamente,

H

.

fumar infectadas pelo pylori

temas e subects obesos tinham reduzido os níveis de CD24

+ CD38

+ B células. Além disso, o CD24

+ CD38

+ células B reguladoras em fumadores e sujeitos obesos foram encontrados para exibir a perda da função supressora quando co-cultivadas com células T autologous e estimuladas reduziu os níveis de IL-10 após directo

H

.

pylori

estimulação. Além disso, em fumadores e doentes obesos que mais tarde desenvolveram cancro gástrico, as frequências de células B de IL-10-secretores foram ainda mais reduzidos, em comparação com os indivíduos que não desenvolveram cancro gástrico. Em conjunto, estes dados demonstram que CD24

+ CD38

+ B células foram upregulated em

H

.

pylori

infectado e tinha funcionalmente suprimida células T de produção de citoquinas inflamatórias. O CD24

+ CD38

+ células B em indivíduos fumantes e obesos, no entanto, eram refratárias ao

H

.

pylori

-stimulation, produziram menos IL-10, e faltava capacidade supressiva.

Materiais e Métodos

Os sujeitos do estudo

Foram obtidas amostras de sangue periférico primárias 55

H

.

pylori

pacientes sem úlceras infectados, dos quais 15 são consumidores primários de fumo do tabaco e 15 são de classe I obesos (30kg /m

2 IMC 35 kg /m

2 indivíduos), bem como 15 saudável

H

.

pylori

indivíduos livre-ulcerosos -uninfected. Indivíduos com exposição crónica ao fumo de segunda mão foram excluídos do estudo. Não houve diferenças significativas em relação à idade, sexo e história de infecção prévia entre os grupos de estudo foram encontrados. Todos os indivíduos foram acompanhados por 5 anos para o estado de desenvolvimento do câncer. Todos os indivíduos eram indivíduos não aparentados da província de Henan e sua região envolvente. Os pacientes foram recrutados entre janeiro 2008 e dezembro 2013 do Hospital Central 155 de PLA na China. Controles eram indivíduos sem câncer selecionados aleatoriamente a partir de um programa de despistagem do cancro da comunidade para detecção precoce do câncer realizado nas mesmas regiões durante o mesmo período, os pacientes foram recrutados. A taxa de resposta para ambos os controlos e de casos foi de 95%. Os critérios de selecção para os controlos saudáveis ​​incluiu indivíduos sem câncer e correspondência de frequência para casos por sexo e idade (± 5 anos). No recrutamento, consentimento informado foi obtido de cada dado assunto e pessoais, como sexo, idade, peso, altura e fumo de tabaco foram coletadas através de um questionário. Não amostras de todos os sujeitos foram usados ​​em todos os experimentos, devido à adesão do paciente incompleta e células insuficientes em alguns pacientes. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Central 155 de PLA.

preparação da amostra

periféricos células mononucleares do sangue (PBMC) foram isoladas de amostras de sangue periférico com procedimento de Ficoll-Hypaque padrão e congelados imediatamente em -150 ° C até à sua utilização, ou utilizados em experiências imediatamente se observou. meio de cultura regular é meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, 5 mL de 100 U de penicilina /0,1 mg /mL de estreptomicina, e 5 mL de L-glutamina 2mM. As células foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C durante o período de tempo indicado.

células de isolamento de células

T e B foram isolados utilizando celular T humanas ou células B negativa Kit Selection (Stemcell, Vancouver, Canadá), seguindo protocolos fornecidos pelo fabricante. As purezas dos isolamentos de células T e B foram superiores a 94% por citometria de fluxo. Para a depleção de CD24

+ CD38

+ B células Em algumas experiências, as células B purificadas foram coradas com PE anti-humano CD24 e APC CD38 anti-humano durante 30 min. As células foram, em seguida, enviado para viver e separação de células CD24

+ CD38

+ células foram esgotados. Na configuração de célula inteira B, células totais B foram enviados para viver separação de células, sem os anticorpos

A citometria de fluxo

Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais anti-humanos:. IL-10, TNF- um (eBioscience, San Diego, CA, EUA); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (BioLegend, San Diego, CA, EUA); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). Purificada de IgG humana (BioLegend, San Diego, CA, EUA) foi utilizado para bloquear os receptores Fc, quando coloração contendo populações de células B. Para algumas experiências,-forbol 12-miristato-13-acetato (PMA, Sigma), ionomicina (Sigma, Munique, Alemanha), ou

H

morta pelo calor.

pylori

(Sigma, Munique, Alemanha) foram utilizadas para estimular as células. GolgiStop GolgiPlug e foram adicionados 6 h antes da colheita da célula para a coloração intracelular de IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a e IL-10. FlowJo foi usada para análise de citometria de fluxo.

Luminex ensaio

IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a e IL-10 a partir de células T e as células B foram medidos quantitativamente por ensaio Luminex multiplex seguindo protocolos fornecidos pelo fabricante, com modificações (EMD Millipore, Etobicoke, Canadá). Um total de 2×10

5 células T e /ou células B foram semeadas em cada poço da placa de 96 poços (Corning, Tewksbury, MA, EUA). Para a estimulação das células B, mortas pelo calor

H

.

pylori

foram adicionados às células B, que foram plaqueadas a parte inferior de um de 96 poços Transwell placa (Corning, Tewksbury, MA). Para a estimulação de células T, a parte inferior da placa transwell foi pré-incubada com CD3 (OKT3 clone) anti-humano durante a noite e lavou-se, após o que as células T purificadas foram transferidos para a placa. esferas de anticorpo de captura de citocina humana foram adicionadas à câmara superior do Transwell de 96 poços da placa. Doze horas depois, as pérolas foram colhidas, lavadas e interpretadas de acordo com o protocolo do fabricante.

A análise estatística

D’Agostino e Pearson teste de normalidade omnibus foi usado para examinar se os dados foram distribuídos normalmente. one-way análise de variância (ANOVA) foi utilizada para as comparações entre vários grupos, seguido pelo teste de Dunn. O teste t de Student foi utilizado para comparações entre os dois grupos. Se os conjuntos de dados significativamente desviado distribuição normal, foram utilizados testes não paramétricos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Prism (GraphPad Software). P 0,05 foi considerado significativo. Os resultados foram apresentados como média ± S.E.M.

resultados

H

.

pylori

indivíduos infectados tinha alterado a circular composição celular B

Para analisar as possíveis mudanças no papel das respostas de células B no

H

.

pylori

infecção e como ela pode ser afetada pelo tabagismo e obesidade, 15 saudável

H

.

pylori

-uninfected (

H

.

pylori

-uninfected) voluntários, 20

H

.

pylori

infectados indivíduos assintomáticos não-fumadores não-obesos (assintomáticos), 15

H

.

pylori

infectados fumar não-obesos (fumadores) indivíduos, e 15

H

.

pylori

infectado fumar em indivíduos obesos (obesidade) foram recrutados para este estudo. Os dados demográficos e clínicos foram resumidos na tabela 1.

Circulação células B no sangue periférico de indivíduos saudáveis ​​são compostas principalmente de IgD

+ CD27

– células B virgens e CD21

+ CD27

+ descansando células B de memória, enquanto que em infecções crónicas, existe, frequentemente, uma diminuição de células B virgens e que descansa células B de memória, e um aumento em CD21

lo células B activadas e CD24

+ CD38

+ células B [15,18]. Em primeiro lugar, examinou a composição das células B em circulação no

H

.

pylori

indivíduos infectados. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram coradas para expressão do marcador de superfície

directamente ex vivo

(Fig 1A). Descobrimos que em comparação com

H

.

pylori

-uninfected indivíduos saudáveis, todos os

H

.

pylori

grupos infectados continham porcentagens mais baixas de IgD

+ CD27

– células B virgens (P 0,001 para todos, Fig 1B e 1C). As percentagens de CD21

+ CD27

células B de memória descansando + foram reduzidas em

H

.

pylori

indivíduos infectados por fumantes e obesos em comparação com indivíduos saudáveis ​​(P 0,001 para ambos), e a percentagem de CD21

+ CD27

+ B células em indivíduos obesos foi reduzida em comparação com

H

.

pylori

infectados assintomáticos (P 0,01). Curiosamente, as percentagens de CD24

+ CD38

+ B células foram variou entre os diferentes grupos de

H

.

pylori

indivíduos infectados.

H

.

pylori

infectados assintomáticos contido porcentagens muito mais elevadas de CD24

+ CD38

+ B células do que controles saudáveis ​​(P 0,001). A percentagem de CD24

+ CD38

+ B células foi reduzido em indivíduos fumadores comparada com a de sujeitos assintomáticos (P 0,05), mas ainda maior do que em indivíduos saudáveis ​​(p 0,001). Em indivíduos obesos, a percentagem de CD24

+ CD38

+ B células não foi significativamente diferente do que em indivíduos saudáveis, mas foi reduzido de que, em indivíduos assintomáticos (P 0,001).

(A ) estratégia Gating para células B em PBMC. Todas as populações subsequentes apresentados foram fechado, em conformidade, CD3

-CD19

+ linfócitos singlet ao vivo. (B) gráficos de pontos representativos que descrevem IgD vs. CD27, CD27 versus CD21 e CD38 vs expressão de CD24 em células B em saudável

H

.

pylori

assuntos -uninfected (

H

.

pylori

-uninfected, N = 20),

H

.

pylori

infectado não-fumantes não-obesos assintomáticos (assintomática, N = 15),

H

.

pylori

infectados fumar em obsese (Fumar, N = 15), e

H

.

pylori

infectados obesos não-fumantes (= 15 Obese, N). (C) Percentagens de IgD

+ CD27

– células B virgens, CD21

+ CD27

+ células de memória clássica B e CD24

+ CD38

+ células B regulamentares em estudo grupos. *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Kruskal-Wallis ANOVA one-way e teste de Dunn). Para citometria de fluxo análise, superior a 10

6 eventos na delimitação de linfócitos foram recolhidos.

H

.

pylori

indivíduos infectados tinham alterado B citoquina célula perfil de expressão

Anteriormente, as células B foram encontrados para amplificar ou suprimir as respostas imunes através da produção de uma série de citoquinas com funções diferentes, incluindo pro- citoquinas inflamatórias, tais como IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-g e TNF-a, bem como IL-10 e fator de crescimento transformador beta (TGF-b), como citoquinas reguladoras [19] . Aqui, examinámos a expressão de citoquinas de células B em sujeitos do estudo. Verificou-se que o

ex vivo

expressão de IL-2, IFN-g e TNF-a por células B foram aumentados em

H

.

pylori

infectado indivíduos fumadores e pacientes obesos do que em indivíduos saudáveis ​​(Fig 2A). Nenhuma diferença significativa foi encontrada em TGF-b expressão.

(A) Percentagens do total de células B que expressam IL-2, IFN-g, TNF-a e TGF-b em

H

.

pylori

não infectado (N = 7),

H

.

pylori

infectado assintomático (N = 8),

H

.

pylori

infectado fumar (N = 6), e

H

.

pylori

infectados indivíduos obesos (n = 6) sob unstimulated (sem /ionomicina PMA) condição. (B) gráficos de pontos representativos de células B coloração de citocinas intracelulares sem ou com PMA /ionomicina estimulação, a partir de um tema não infectado. As expressões de citocinas de células B totais menos CD24

+ CD38

+ B células (não-CD24

+ CD38

+ células B) e a de CD24

+ CD38

+ B As células foram mostrados separadamente. (C) Percentagens de IL-10 que expressam, não-CD24

+ CD38

+ B células e CD24

+ CD38

+ B células em todos os grupos estudados, tanto sob unstimulated e PMA /ionomicina condições estimulada. (D) O número de IL-10

+ B células em grupos de estudo, calculada pela percentagem de IL-expressando-10 células CD24

+ CD38

B + células multiplicadas pela percentagem de CD24

+ CD38

+ em células B total (como mostrado na Figura 1C). *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Kruskal-Wallis ANOVA one-way e teste de Dunn). Para gráficos de pontos, 5000 eventos em cada portão foram mostrados.

CD24

+ CD38

células + B têm funções reguladoras em outros estudos e tinha níveis de expressão interessantes em diferentes

H

.

pylori

grupos infectados (Fig 1C). Foi examinada a expressão das citocinas intracelular por CD24

+ CD38

+ células B. Como mostrado na Fig 2B, a expressão de citoquinas de CD24

+ CD38

+ B células eram diferentes dos não-CD24

+ CD38

+ B (células B total menos CD24

+ CD38

células + B) em que elas não produzem níveis elevados de IFN-g e TNF-a, quando estimuladas com PMA /ionomicina, mas expressa níveis muito elevados de IL-10, tanto em condições não estimuladas e estimuladas. Comparou-se a produção de IL-10 a partir de diversos subconjuntos de células B e verificaram que CD24

+ CD38

+ B as células em todos os grupos de estudo secretada muito mais elevada de IL-10 do que os não-CD24

+ CD38

+ células B, tanto em condições não estimuladas, assim como as condições de ionomicina /PMA estimuladas (Fig 2C). Nós, portanto, considerar o CD24

+ CD38

+ fração como a IL-10 de produção de subconjunto de células B principal. Dentro do

H

.

pylori

grupo infectado, indivíduos assintomáticos apresentaram maior percentual de IL-10 que expressam células CD24

+ CD38

+ B células do que indivíduos saudáveis, enquanto

H

.

pylori

infectados pacientes obesos apresentaram menores células IL-10 que expressam em CD24

+ CD38

+ B células do que os pacientes assintomáticos (Fig 2C). Nós então multiplicado a frequência de IL-10

+ células na CD24

+ CD38

+ B células com a percentagem de CD24

+ CD38

+ células do total de células B para obter o “número” de células IL-10 expressa nas células B, e descobriu que ambos

H

.

pylori

infectados indivíduos assintomáticos e indivíduos fumadores tinham níveis mais altos de IL-10

+ B células do que indivíduos saudáveis ​​(P 0,001 e P 0,01, respectivamente). Dentro do

H

.

pylori

infectados grupo, tabagismo e obesidade baixou significativamente as frequências de IL-10

+ células B (P 0,001 para ambos). de indivíduos assintomáticos

Em conjunto, estes dados demonstraram que a citocina reguladora IL-10 é produzida principalmente por CD24

+ CD38

+ células B e é aumentado em

H

.

pylori

infectados indivíduos assintomáticos. Tabagismo e obesidade reduzida IL-10 expressão em CD24

+ CD38

+ B células.

H

.

pylori

infectados assintomáticos tiveram mais atividade tolerogênico mediado por CD24

+ CD38

+ B células do que fumar e em obesos

células B reguladoras eram conhecidos por inibir as respostas de células T em infecções crónicas, tais como a infecção da hepatite B e infecção pelo vírus da imunodeficiência humana [14,20], através do estabelecimento de tolerogénico ambiente através de IL-10 antes da indução da inflamação [15,21]. Nós examinamos se o CD24 IL-produzindo-10

+ CD38

+ B células teve efeitos regulatórios semelhantes em

H

.

pylori

-infecção. CD4

+ T células co-cultivadas com autóloga CD24

+ CD38

+ – células B empobrecido tinham significativamente elevados de produção de IL-2, IL-17, IFN-g e TNF-a, de CD4

+ células T co-cultivadas com as células B inteiros, em

H

.

pylori

pacientes infectados assintomáticos (Fig 3A). Em indivíduos fumadores e indivíduos obesos, não foi observado o efeito. Da mesma forma, CD8

+ células T de

H

.

pylori

indivíduos assintomáticos infectados por co-cultivadas com autóloga CD24

+ CD38

+ – células B empobrecido significativamente aumentada de IFN-g e TNF-a secreção do que os co-cultivadas com células B inteiras ( Fig 3B). Mais uma vez, tal efeito não foi observado em indivíduos fumadores e indivíduos obesos. A supressão da expressão de citocinas de células T parece ser mediada por CD24

+ CD38

+ células B, uma vez que menor produção de citocinas foi observada em células CD4

+ e CD8

+ T células co-cultivadas com CD24

+ CD38

+ B células sozinho. Em conjunto, esses dados demonstraram que o CD24

+ CD38

células + B em

H

.

pylori

indivíduos infectados suprimida CD4

+ e CD8 + células T produção de citocinas

pró-inflamatória no

H

.

pylori

infectados indivíduos assintomáticos. Tabagismo e obesidade inibida ações regulatórias de CD24

+ CD38

+ B células.

células B puras e células T foram isoladas de PBMC inteiro através de seleção negativa magnético. As células B purificadas foram coradas com anticorpos CD38 CD24 anti-humano e anti-humanos e enviado para triagem de células vivas. As células B inteiros, CD24

+ CD38

+ – células B esgotados, ou purificado CD24

+ CD38

+ células B foram depois co-cultivadas com células T autólogas in vitro a 1-to- um rácio durante 72 h, após o que as células T foram ainda separadas através de selecção magnética para células CD4

+ e CD8

+ fracções e cultivadas na presença de anti-CD3 e citocinas pérolas de captura ligado à placa durante 6 dias. N = 8 para cada grupo. As produções de citocinas a partir de (A) células T CD4

T + e (B), CD8

+ células T foram, em seguida, medida pelo ensaio de Luminex sensível. *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Kruskal-Wallis ANOVA one-way e teste de Dunn).

IL-10 secreção por células CD24 + CD38 + B em cima do

H

.

estimulação pylori

em diferentes assuntos

A seguir, procurou examinar o mecanismo de IL-10 regulação positiva nas células B de

H

.

pylori

indivíduos infectados. produção de IL-10 é fundamental para a função das células B regulamentar [12,13]. a sinalização do receptor de tipo Toll é um importante mecanismo de regulação positiva de IL-10 em células B, e foi demonstrado que modula a expressão de citocinas em

H

.

pylori

infecção [22,23]. Testou-se a presença de

H

.

pylori

pode upregulate diretamente a secreção de IL-10 em CD24

+ CD38

+ células B. As células B purificadas a partir de PBMC foram cultivadas na ausência ou na presença de morta pelo calor

H

.

pylori

bactéria. Após incubação de 72h, a secreção de IL-10 no sobrenadante foi medida por Luminex. As células B também foram colhidas por intracelular de IL-10 de coloração. Como mostrado na Fig 4A, secreção de IL-10 no sobrenadante é aumentada em ambos

H

.

pylori

-uninfected indivíduos saudáveis ​​e

H

.

pylori

infectado não-fumadores indivíduos assintomáticos não obesos após

H

.

pylori

-stimulation (P 0,01 e P 0,05, respectivamente). Figura 4B mostra que a percentagem de células B de IL-10 que segregam foi regulada positivamente em CD24

+ CD38

+ B células após

H

.

estimulação pylori

em indivíduos saudáveis ​​e assintomáticos (P 0,001 e P 0,05, respectivamente). Em contraste, a concentração de IL-10 no sobrenadante e a percentagem de IL-10 produzindo-CD24

+ CD38

+ B a partir de células

H

.

pylori

indivíduos fumadores infectados e pacientes obesos foram não aumentou significativamente após

H

.

pylori

-infecção. Estes dados demonstram que o tabagismo ea obesidade tinha prejudicado a indução de IL-10 a partir de células B após o

H

.

estimulação pylori

, e sugeriu que, em parte, a perda da função reguladora do CD24

+ CD38

+ B células de indivíduos fumadores e indivíduos obesos foi possivelmente devido a uma incapacidade de regular positivamente a IL-10 secreção em resposta à estimulação de antigénio bacteriano (ver discussão).

total de células B foram isoladas a partir de PBMC por selecção negativa e, em seguida, cultivadas na ausência ou presença de

H

morta pelo calor.

pylori

bactéria, juntamente com IL-10 esferas de captura. Após incubação de 72h, a secreção de IL-10 no sobrenadante foi recolhido por pérolas de captura e medido pelo ensaio de Luminex. As células B também foram colhidas por intracelular de IL-10 de coloração. N = 8 para cada grupo. (A) segregados concentração de IL-10 no sobrenadante. (B) Percentagem de IL-10

células CD24 + em

+ CD38

+ células B no final do período de incubação de 72h. *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Student

t

teste).

pacientes com câncer positivo gástrico no

H

.

pylori

fumar infectado e

H

.

pylori

infectados grupos de obesos tinham frequências mais baixas de IL-10

+ B células

Fumo e obesidade eram conhecidos por aumentar o risco de desenvolvimento de câncer gástrico em

H

.

pylori

indivíduos infectados. Desde o tabagismo ea obesidade também suprimiu as funções das células B normais de regulação, examinamos se esses dois fenômenos estavam ligados. Descobrimos que em indivíduos fumadores e indivíduos obesos, aqueles que se tornou positiva para o estatuto de câncer gástrico tinha freqüências significativamente mais baixos de IL-10

+ células em CD24

+ CD38

+ B células após

H

.

estimulação pylori

do que aqueles que permaneceram negativos para o desenvolvimento de câncer gástrico (Fig 5A P . 0,05 para ambos). Por outro lado, não encontramos que os pacientes positivos e negativos de câncer de câncer foram significativamente diferentes em termos das suas frequências de CD24

+ CD38

células + B em células totais B (Fig 5B). Não

H

.

pylori

pacientes infectados assintomáticos neste estudo se tornou câncer gástrico positivo.

status de câncer gástrico dos pacientes foi monitorado durante 5 anos após a coleta da amostra inicial. (A) As frequências de IL-10

+ células CD24 em

+ CD38

+ B células após direta

H

.

estimulação pylori

em

H

.

pylori

indivíduos fumadores infectados e pacientes obesos (B) As percentagens de CD24

+ CD38

+ B células em células totais B em

H

.

pylori

infectado indivíduos fumadores e indivíduos obesos. N = 8 para cada grupo. *: P 0,05. (Student

t

teste).

Discussão

H

.

pylori

é a principal causa do desenvolvimento de câncer gástrico. Embora a maioria das infecções eram assintomáticos e tratável, um subconjunto de temas falha de tratamento e progresso para câncer gástrico. Além disso, o tabagismo e a obesidade aumenta o risco de desenvolvimento do cancro, enquanto os mecanismos não são totalmente claras. Neste estudo, observou-se primeiro uma alteração na circulação de composição celular B em

H

.

pylori

infectados assintomáticos em comparação com indivíduos saudáveis ​​não infectadas, com uma redução de IgD

+ CD27

– células B simples e uma regulação positiva de CD24

+ CD38

+ células B . O CD24

+ CD38

+ B células também foram encontrados para ser o principal subconjunto de células B IL-secretores-10. Em seguida, realizada de células-B experiências co-cultura de células T e descobriram que as células T em CD24

+ CD38

+ depleção de células co-culturas B segregados níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias que as células T em co-cultura com células B inteiras, enquanto as células T co-cultivadas com CD24

+ CD38

+ B células só tinha a menor produção de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, descobrimos que a presença de

H

.

pylori

poderia aumentar directamente IL-10-expressão de CD24

+ CD38

+ células B. Em conjunto, estes dados demonstram que

H

.

pylori

indivíduos infectados tinham regulada frequências de CD24 circulando

+ CD38

+ B células, o que expressa altos níveis de IL-10 e exibiu função reguladora. Curiosamente, em

H

.

pylori

indivíduos fumadores infectados e pacientes obesos, o que circula CD24

+ CD38

+ B células foram reduzidos em frequência em comparação com

H

.

pylori

infectados assintomáticos, não foram capazes de suprimir a produção de células T citocinas pró-inflamatórias em experiências de co-cultura, e não upregulate significativamente IL-10 expressão depois de

H

.

pylori

estimulação. Além disso, seguimos os assuntos para cinco anos e, posteriormente, descobriu que, comparados a pacientes com câncer gástrico positivo, pacientes com câncer gástrico negativo tinha mais a produção de IL-10, após

H

.

pylori

estimulação. lesões destruição das células e dos tecidos crônicas em persistente

H

.

pylori

foram os principais fatores que contribuem para o desenvolvimento de câncer gástrico [24]. A partir dos resultados apresentados neste trabalho, é possível que o aumento da IL-10-expressão por células B podem proteger o

H

.

pylori

indivíduos infectados, reduzindo a inflamação mediada por células T e limitar lesões teciduais, mas em indivíduos fumadores e indivíduos obesos, a protecção dos tecidos mediada por células B não estava presente. Mais estudos são necessários no futuro para analisar se a presença de IL-10

+ células B está correlacionada com lesões redução do tecido em

H

.

pylori

. Isto, no entanto, não era viável no presente estudo, uma vez que requer amostras de tecido gástrico.

Tem sido relatado que o fumo de tabaco está associado com o stress oxidativo e aumento da libertação de citocina pró-inflamatória, possivelmente devido ao tecido induzida por fumo danos [25,26]. A obesidade também está associada com o aumento de baixo grau, inflamação crónica [27]. Neste estudo, verificou-se que

H

.

pylori

indivíduos fumadores infectados e pacientes obesos tinham menos IL-10 células

+ B do que

H

.

pylori

infectados indivíduos assintomáticos. Subsequentemente, ao contrário do que em indivíduos assintomáticos, a presença de CD24

+ CD38

B + células de indivíduos fumadores e indivíduos obesos na co-cultura de células de células-B T não reduziu de células T de produção de citoquinas pró-inflamatórias. A redução na produção de IL-10 e a falta da função reguladora das células B pode ter resultado do aumento do estado inflamatório global do tabagismo e obesidade. Na verdade, os nossos dados mostraram que as células B de

H

.

pylori

fumar infectado e indivíduos obesos, mas não os de indivíduos assintomáticos, apresentaram maior de IL-2, IFN-g e TNF-a produção de células B de indivíduos saudáveis, não infectadas, sugerindo um enviesamento para uma mais fenótipo pró-inflamatória. Ao mesmo tempo, a exposição crónica ao fumo e a obesidade são conhecidos para associar com o aumento do risco de cancro gástrico.

pylori

.

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