Abstract

Fundo e Propósito

NAD (P) H: quinona oxidorredutase 1 (NQO1) redução quinona mediada e subsequentes UDP-glucuronosiltransferases (UGTs) catalisada glucuronidação é a via metabólica dominante da Tanshinone IIA (TSA), um agente anti-câncer promissor. UGTs positivamente são expressos em vários tecidos tumorais e desempenham um papel importante na eliminação metabólica de TSA. Este estudo tem como objetivo explorar o papel de UGT1A na determinação da acumulação intracelular eo efeito apoptótica resultante da TSA.

Abordagem Experimental

Foram examinados TSA acumulação intracelular e glucuronidação no HT29 (UGT1A positivo) e HCT116 (UGT1A negativo) linhas celulares de cancro do cólon humano. Também examinamos espécies reativas de oxigênio TSA mediadas (ROS) produção, citotoxicidade e efeito apoptótica em HT29 e células HCT116 para investigar se os níveis UGT1A estão diretamente associados com o efeito anti-câncer TSA. UGT1A siRNA ou de propofol, um inibidor competitivo UGT1A9, foi utilizado para inibir a expressão ou actividade UGT1A UGT1A9.

Resultados chave

UGT1A múltiplas isoformas são expressas em HT29 positivamente, mas não em células HCT116. S9 fracções celulares preparados a partir de células HT29 exibem uma actividade forte em direcção glucuronidação TSA, que pode ser inibida por propofol ou interferência UGT1A siARN. TSA acumulação intracelular em células HT29 é muito menor do que em células HCT116, que se correlaciona com níveis elevados de expressão em células de UGT1A HT29. Consistentemente, de TSA induz menos intracelular ROS, citotoxicidade, e efeito apoptótico em células HT29 do que aqueles em células HCT116. O pré-tratamento das células HT29 com UGT1A siRNA ou propofol pode diminuir TSA glucuronidação e melhorar simultaneamente a sua acumulação intracelular, bem como melhorar a TSA efeito anti-câncer.

Conclusões e Implicações

UGT1A pode comprometer TSA citotoxicidade por meio de redução da sua exposição intracelular e interrupção do ciclo redox desencadeada-NQO1 de eliminação metabólica. Nosso estudo pode lançar uma luz no entendimento da farmacocinética celular e mecanismo molecular pelo qual UGTs determinar os efeitos da quimioterapia de fármacos que são substratos ‘UGTs

Citation:. Liu M, Wang Q, Liu F, Cheng X, Wu X, Wang H, et al. (2013) UDP-glicuroniltransferase 1A Compromises intracelular Acumulação e Anti-Cancer Efeito da Tanshinone IIA em células cancerígenas do cólon humano. PLoS ONE 8 (11): e79172. doi: 10.1371 /journal.pone.0079172

editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de maio de 2013; Aceito: 20 de setembro de 2013; Publicação: 14 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado financeiramente pela Fundação para o Autor da National Excelente Tese de Doutorado da China (Grant 200979), Natural Science Foundation da China (Grants 91029746 e 81273586), Natural Science Foundation da província de Jiangsu (Grants BK2011065 e BK2012026), e o Programa de New Century excelentes talentos na Universidade (Grant NCET-09-0770). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

UDP-glucuronosiltransferases (UGTs) catalisam a glucuronidação de muitos substratos endógenos lipofílicos tais como bilirrubina e hormônios esteróides, e xenobióticos, incluindo agentes cancerígenos e drogas clínicas [1], [2], [3]. Na maioria dos casos, o metabolismo mediado UGT promove a eliminação metabólica e diminui as eficácias biológicas dos substratos, embora tenham sido observados vários casos de bioactivação [4], [5]. UGTs são, portanto, considerado como um importante sistema de desintoxicação. polimorfismos genéticos de UGTs causando a atividade enzimática reduzida têm sido associados com o risco de câncer, como câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer do trato digestivo proximal, carcinoma hepatocelular, e câncer de próstata [6], [7]. Alternativamente, as atividades enzimáticas aumentadas de UGTs pode representar um importante contribuinte para quimioterápicos resistência de muitos fármacos que são substratos ‘UGTs, tais como irinotecano, metotrexato, epirubicina, e tamoxifeno [8], [9], [10], [11] , implicando um papel crucial de UGTs na terapia anti-cancro. UGTs positivamente são expressos em vários tipos de tecidos e células tumorais, embora a um nível relativamente mais baixo em comparação com os correspondentes tecidos normais [12], [13], [14], [15]. Embora UGTs foram reivindicados como uma causa importante de resistência quimioterapêutico, pouco se sabe sobre a influência direta do UGTs relativas à acumulação intracelular nas células cancerosas alvo e eficácia quimioterápico de drogas.

Tanshinone IIA (TSA) é uma composto diterpene fenantrenoquinona isolado da raiz seca de miltiorrhiza salvia (Danshen em chinês), que é um medicamento herbal amplamente utilizado com eficácias cardiovasculares e cerebrovasculares bem comprovadas [16], [17], [18]. Em particular, a acumular evidência que suporta TSA é um promissor agente anti-cancro [19], [20], [21], [22]. Anteriormente temos esclareceu que TSA é predominantemente eliminado via sequencial NAD (P) H: quinona oxidoredutase 1 (NQO1) e UGT catalisada metabolismo [23], [24]. NQO1 catalisa uma redução de dois elétrons da TSA produzindo um metabolito catecol altamente instáveis ​​que podem ser rapidamente glucoronisado se UGTs estão presentes. No entanto, quando UGTs estão ausentes, o catecol altamente intermediário reactivo pode ser submetida a um ciclo redox de redução de quinona e auto-oxidação, um processo que produz quantidades excessivas de espécies de oxigénio reactivas (ROS). Com base nesta constatação, temos validado recentemente que NQO1 é um importante alvo intracelular de TSA que provoca a morte apoptótica de cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) células [25].

Com base no nosso recente descoberta de que várias isoformas UGT1A estão envolvidos em TSA glucuronidação [24], o presente estudo centra-se em elucidar o papel dessas UGTs na determinação da acumulação intracelular e efeito apoptótica de TSA em células cancerígenas do cólon humano. Aqui nós mostramos que TSA glucuronidação em células cancerosas UGT-positivos diminuiu acumulação intracelular TSA, quebrou ciclo redox desencadeou-NOQ1 e, consequentemente, reduziu TSA induzida por formação de ROS e seu efeito anti-câncer.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Cultura

linhas celulares de cancro do cólon humano HT29 e HCT116 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). As células cresceram em 5a de McCoy (Gibco, EUA), meio com soro fetal bovino a 10% (Hyclone, EUA), 100 U ml

-1 penicilina, e 100 mg ml

-1 de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada atmosfera com 5% de CO

2. Para finalidade diferente, as células foram cultivadas durante 24-72 horas no meio e, em seguida, foram adicionadas as drogas. Tripsina (2,5%) foi usado para a colheita de células. Todas as células foram livres de micoplasma.

produtos químicos e reagentes

TSA foi comprado do Instituto Nacional para o Controle de Produtos Farmacêuticos e Biológicos (Pequim, China), e preparados para dispersão sólida com PEG6000 como descrito [26]. O propofol, 4-metilumbeliferona (4-MU), ácido micofenólico (MPA), a N-acetilcisteína (NAC), dicumarol (DIC), glicose-6-fosfato, glucose 6-fosfato desidrogenase, fosfato de dinucleótido adenina β-nicotinamida (NADP) , ácido uridina 5′-difosfato-glucurónico (UDPGA), D-ácido sacárico 1,4- lactona, β-D-glucuronidase (Escherichia coli), clorzoxazona, 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA), e 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foram todos obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA). Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit foi comprado de Bipec Biopharma Corporation (EUA). Os iniciadores de PCR em tempo real, para a detecção de transcritos do UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9 e UGT1A10 foram adquiridos a partir de Invitrogen (CA, EUA). Os anticorpos contra UGT1A (Abcam, EUA), UGT1A9 (Abcam, EUA), e GAPDH (Boster Biologia, China) foram utilizados na análise de transferência de Western. Alto desempenho acetonitrilo de grau de cromatografia líquida (HPLC) foi obtida a partir de Fisher Scientific (Toronto, Canadá). Todos os outros produtos químicos eram de grau HPLC ou a melhor nota que estava disponível comercialmente.

transientes Transfecção de siRNA UGT1A

transfecção transiente foi efectuada utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, a discrição ARNi siRNA (Invitrogen, EUA) para UGT1A silêncio ou um controlo negativo foi misturado com Lipofectamina RNAiMAX Reagente em Opti-MEM I (Gibco, EUA) a uma concentração de remate de 20 nM, e a mistura siARN foi adicionado a uma placa de cultura adequado à temperatura ambiente. Exponencialmente as células em crescimento foram subsequentemente semeadas na placa contendo mistura de transfecção. As células foram incubadas numa incubadora (5% de CO

2) a 37 ° C durante 24-72 horas.

quantificação dos níveis de ARNm

ARNm total foi extraído a partir de células, e o ADNc foi sintetizado pelo kit de reagente PrimeScrip RT (Takara Biotecnologia, Dalian, China). Quantitative PCR em tempo real foi realizada por SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotecnologia, Dalian, China), seguindo as instruções do fabricante. As sequências dos iniciadores utilizados na PCR em tempo real estão listados no apoio informações 1 (Tabela S1). As condições de PCR foram 95 ° C durante 1 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 30 segundos.

Western Blot Análise

As células foram colhidas e a proteína total foi extraída. A concentração de proteína foi então determinada utilizando o kit BCA Protein Assay (Beyotime, China). Quantidades iguais de proteína (50 ug) foram carregadas e separadas por electroforese em SDS-PAGE. As proteínas foram então transferidas para uma membrana de PVDF (PALL, EUA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado num tampão TBST e incubadas durante 24 horas a 4 ° C com anticorpos primários específicos. A membrana foi lavada 3 vezes com TBST e, em seguida, incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP (KeyGen, Nanjing, China) durante 1 hora a 37 ° C. O sinal foi visualizado por quimioluminescência aumentada (ECL, Millipore). Os níveis de expressão de proteína foram normalizados com GAPDH.

UGT Ensaio de Actividade

atividade UGT foi apresentada pela atividade glucuronidação do substrato com frações S9 celulares. As células foram colhidas por 2,5% de tripsina e lavadas em PBS gelado, homogeneizado em PBS e centrifugadas a 9000 g durante 20 min a 4 ° C para se obter fracções S9 celulares. O teor de proteína das fracções S9 foi determinada utilizando o kit BCA Protein Assay (Beyotime, China). De acordo com relatórios anteriores [27], [28], substrato UGT1A não específica 4-MU foi usada para determinar a actividade geral de UGT1A, e MPA, que é glucoronisado principalmente por UGT1A9 foi usada para determinar a actividade UGT1A9. Resumidamente, 4-MU ou AMP (0,5 mM) foi incubado numa mistura reaccional de 200 uL contendo 0,1 mg (0,2 mg de MPA) fracções S9 celulares, UDPGA 2 mM, 1 mM de ácido sacárico 1,4- lactona, MgCl 5 mM de

2, e tampão Tris 50 mM-HCl (pH 7,4) a 37 ° C durante 15 min (30 min para AMF). As fracções S9 foram pré-tratadas com alameticina a uma concentração de 25 ug mg

-1 em gelo durante 20 min. Após pré-incubação durante 5 min a 37 ° C, a reacção foi iniciada pela adição de UDPGA. As reacções foram interrompidas pela adição de 400 ul de acetonitrilo arrefecido com gelo e as amostras foram centrifugadas durante 10 min a 20.000 g. As amostras de sobrenadante (100 uL) foram analisadas por um Shimadzu (Kyoto, Japão) sistema de HPLC LC-2010C equipado com uma bomba quaternária, auto-amostrador, forno de coluna, e detector de UV. A separação foi efectuada utilizando uma coluna lunar-C18 (250 x 4,6 milímetros d.i., 5 um, de Phenomenex Inc., China) com uma coluna de guarda (Phenomenex Inc., China). Para 4-MU, a fase móvel foi acetonitrilo (A) e água com 25 mM de K

2HPO

3 (B) a uma taxa de fluxo de 1 ml min

-1; a eluição foi realizada com o seguinte gradiente: 15% de A (0-2 min), gradiente linear de 15% a 60% de A (2-5 minutos), 60% a 40% de A (5-8 minutos), e 15% um para 8-10 min, e depois por mais 5 minutos de equilibração com uma temperatura de coluna de 40 ° C e a detecção de UV a 322 nm. Para MPA, a fase móvel foi acetonitrilo (A) e água com 0,1% (v /v) de ácido acético (B) a uma taxa de fluxo de 1 ml min

-1; A eluição foi realizada com o seguinte gradiente: 45% (0-2 min), gradiente linear de 45% a 80% de A (2-8 minutos), 80% de A durante mais 1 min, e 45% de A durante 9-10min e em seguida, durante mais 4 minutos de equilibração com uma temperatura de coluna de 40 ° C e a detecção de UV a 250 nm. quantificação precisa dos glucoronidos recém-formadas foi conseguido através da calibração com padrões autênticos (Sigma, EUA).

Glucuronidação Ensaio da TSA no S9 Frações

A fração S9 (0,25 mg) foi incubado com indicado concentrações de TSA em uma mistura reaccional consistindo de UDPGA 2 mM, 1 mM de ácido sacárico 1,4- lactona, MgCl 5 mM de um sistema de regeneração de NADPH NADP 0,2 mM contendo

2, e, glicose 1,9 mM, 6-fosfato, 1,2 L ml

-1 desidrogenase de glicose-6-fosfato, e 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,4) em um volume final de 200 ul. A fracção S9 foi pré-tratada com alameticina a uma concentração de 25 ug mg

-1 em gelo durante 20 min para reduzir a latência da actividade UGT. Para o ensaio de cinética enzimática, após pré-incubação durante 5 min a 37 ° C, a reacção foi iniciada pela adição de UDPGA e incubou-se a 37 ° C durante 60 min. Para o estudo da inibição do propofol, o propofol (0-400 uM) foi co-incubado com TSA (20 uM) a 37 ° C durante 20 min. Todas as reacções foram terminadas por acetonitrilo arrefecido em gelo, seguido por centrifugação a 20.000 g durante 10 min para se obter os sobrenadantes, e, em seguida, analisados ​​pelo sistema de HPLC da mesma, tal como descrito acima com o método baseado no nosso relatório anterior [24].

TSA intracelular Acumulação e glucuronidação em células vivas

células em crescimento exponencial, com 70% de confluência foram expostas a 20? M TSA para 0,5, 2, 6, 24 e 48 horas. Células e meio de cultura foram recolhidos separadamente nos pontos de tempo indicados. As células foram lavadas por três vezes com PBS arrefecido em gelo. Ultrapura água (300 ul) foi adicionado a cada amostra de células e de congelamento /descongelamento por três vezes para quebrar as células. De qualquer célula ou amostra de meio de cultura (100 ul) foi adicionado com acetonitrilo arrefecido com gelo (300 mL) e misturou-se por um forte vórtice durante 5 min, seguido de centrifugação a 20.000 g durante 10 minutos para obter o sobrenadante, em seguida, analisadas pelo método de HPLC com base em nosso relatório anterior [24]. As concentrações de droga foram normalizadas por determinação da concentração de proteína das amostras de células usando o BCA Protein Assay Kit (Beyotime, China).

ROS Ensaio

concentração indicada de TSA foi administrada às células a 70% confluência durante 1 hora. Em seguida, as células foram tratadas com DCFH-DA, durante 30 min e lavou-se por PBS gelado por três vezes. Cellular ROS podem conversar não fluorescente DCFH-DA ao seu fluorescente derivado DCF. formação de ROS foi analisada pela medição da intensidade da fluorescência de DCF a 535 nm (com excitação a 488 nm) em sinergia-H1 fluorímetro (Bio-Tek Instruments).

Ensaio de Citotoxicidade

As células foram semeadas a 7.000 células por poço para uma placa de 96 poços e incubadas durante a noite. As células foram subsequentemente expostas às concentrações indicadas de TSA. Após 48 horas (para HCT116) ou 72 horas (para HT29), MTT (5 mg ml

-1) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada a 37 ° C durante mais 4 horas. A solução de MTT foi removida e, em seguida, 150 ul de DMSO foram adicionados por cavidade. A absorvância a 570 nm foi medida por um leitor de microplacas.

Ensaio de Apoptose

As células foram semeadas por 2 × 10

5 /alvéolo em placa de 6 poços e atingiu 60% de confluência depois 72 horas de cultura. Em seguida, as células foram expostas à concentração indicada de TSA durante 48 horas (HCT116) ou 72 horas (HT29) e colhidas por 0,25% de tripsina sem EDTA e lavadas por PBS gelado. Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bipec Biopharma Corporation, EUA) foi utilizado para corar as células de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram analisadas usando um citómetro de fluxo (BD FACSCalibur, EUA).

Análise estatística

Todos os dados são apresentados como médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. As diferenças estatísticas entre dois grupos foram avaliados utilizando o teste t de Student; para comparações múltiplas, foi aplicada uma análise de variância, seguida por teste de Dunnett. A diferença foi considerada significativa em * P 0,05, ** P 0,01, ou *** P 0,001

Resultados

Vários UGT1A isoformas são Positivamente Expresso em HT29 mas não em HCT116. células

em primeiro lugar, avaliaram os níveis de isoformas UGT1A que foram envolvidos no TSA glucuronidação por PCR em tempo real em ambas as linhas de células HT29 e HCT116 expressão. A Figura 1A mostra o padrão de expressão do gene de isoformas UGT1A em células HT29. Em contraste, nenhuma expressão de genes UGT1A foi detectada em células HCT116 (dados não mostrados). Para investigar ainda mais o papel da UGTs, siARN específica foi usada para silenciar genes UGT1A em células HT29. Três pares de siRNAs dirigidos contra a sequência UGT1A foram concebidos, e o melhor par com os mais elevados efeitos de silenciamento com ARNsi ao longo não específica como um controlo negativo foi examinada. Após as transfecções de ARNip, os níveis de ARNm foram avaliados em células HT29. Os níveis de ARNm de UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9 e UGT1A10 foram reduzidos em 85,8%, 31,4%, 87,5%, 66,5%, e 68,2%, respectivamente, enquanto que os siARN de controlo negativo teve pouco efeito (Figura 1A). ensaio Western Blot suportado um nível de expressão elevado de UGT1A em células HT29, ao passo que não foi observada nenhuma proteína UGT1A detectável em células HCT116 (Figura 1B). A expressão da proteína de UGT1A total e UGT1A9 específica foi acentuadamente diminuiu UGT1A siRNA em células HT29 (Figura 1B e 1C). Os resultados do ensaio de actividade UGT mostraram que as células HT29 possuem alta capacidade para a glucuronidação de 4-MU, um substrato geral UGT1A, e MPA, uma sonda UGT1A9 relativamente específico. 4 MU-MPA e actividades de glucuronidação foram reduzidos com UGT1A siARN transfecção por 85,6% e 57%, respectivamente (Figura 1B e 1C). Consistente com o ARNm e os níveis de proteína de exame, nenhuma actividade enzimática específica UGT1A foi detectada em células HCT116 (Figura 1B).

As células foram pré-tratadas com siRNA UGT1A, siRNA não específico (controlo negativo) ou veículo durante 48 horas. os níveis de (A) de ARNm de UGT1A isoformas em células HT29. UGT1A1 nível de ARNm das células com veículo foi feita como uma; (B) os níveis de proteínas e atividades enzimáticas de UGT1A; (C) os níveis de proteínas e atividades enzimáticas de UGT1A9. A actividade total UGT1A foi determinada pela detecção da velocidade de 4-MU glucuronidação, e a actividade específica UGT1A9 foi determinada pela detecção da velocidade de MPA glucuronidação. A actividade da enzima foi expressa como nmol por min por mg de proteína. A atividade UGT1A 0,1 nmol min

-1 mg

-1 foi considerado não detectável (ND). Os resultados são apresentados como média ± SD de pelo menos três experiências independentes.

A inibição da UGT1A expressão ou UGT1A9 Atividade Reduz TSA Glucuronidação em HT29 celular S9 Frações

Para ganhar a compreensão da TSA glucuronidação por células cancerígenas do cólon, foi realizado o ensaio de cinética enzimática utilizando frações S9 preparados a partir de células HT29 com ou sem tratamento UGT1A siRNA. Consistente com nosso estudo anterior [24], M1 e M2, um par de regioisómeros de glucoronidos catecol TSA, foram detectados a partir HT29 mas frações S9 não de células HCT116. TSA glucuronidação apresentada uma típica a cinética de Michaelis-Menten (Figura 2A e 2B). Os parâmetros cinéticos, incluindo a aparente (max V

) K

m, velocidade máxima, depuração intrínseca (CL

int, V

max /K

m) para o M1 e M2, e soma CL

int (M1 + M2) estão resumidos na Tabela 1. o silenciamento de isoformas UGT1A por UGT1A siARN conduziu a um decréscimo de cerca de 10 vezes de

valores Vmax para a produção tanto de M1 e M2, enquanto teve pouca influência no K

valores m. Por conseguinte, o CL

int para M1 e M2 e a soma CL

int (M1 + M2) do grupo silêncio UGT1A foram aproximadamente 10 vezes menores do que os do grupo de controlo negativo.

cinética enzimática para a formação de glucuronídeos de TSA (M1 e M2) foi examinada em fracções de células (a) S9 preparadas a partir de células HT29 pré-tratadas com ARNsi de controlo negativo, e fracções celulares S9 (B) preparada a partir de células HT29 pré-tratadas com siRNA UGT1A. (C) Efeito inibitório de propofol (0-400 uM) em TSA glucuronidação em fracções S9 de células HT29. Os resultados são apresentados como média ± DP de três experiências independentes.

O efeito inibitório de propofol em TSA glucuronidação em fracções de células HT29 foi também examinada. Como um substrato específico UGT1A9 [8], o propofol apresentaram inibição aproximada de 25% de ambos M1 e M2 em 100 uM e cerca de 40% de inibição a 400 ^ M (Figura 2C).

UGT1A determinates TSA Acumulação no cancro do cólon células

Para testar se UGT1A pode influenciar TSA disposição nas células vivas, foi realizado um estudo farmacocinético celular. Determinou-se a acumulação intracelular dinâmica de TSA e os seus metabolitos (M1 e M2). De interesse, o nível intracelular de TSA aumentou continuamente ao longo de 48 horas após o tratamento TSA em células HCT116. No entanto, a concentração de TSA em células HT29 atingiu um máximo de 6 horas e, em seguida, diminuiu dramaticamente (Figura 3A). A área sob a curva de 0 a 48 horas (ASC

0-48 h) e a concentração máxima (C

max) de TSA em HCT116 foram muito mais elevados do que nas células HT29 (Tabela 2). O pré-tratamento das células HT29 com propofol resultou num aumento da acumulação intracelular significativa de TSA. Da mesma forma, UGT1A siARN transfecção também aumentou a acumulação de TSA em células HT29 (Figura 3A, Tabela 2). Ambos M1 e M2 foram detectadas em células HT29 a 0,5 hora após o tratamento TSA, sugerindo uma rápida produção intracelular de glucuronídeos. Os níveis intracelulares de M1 e M2 atingiu um máximo de 6 h e, em seguida, diminuiu (Figura 3B e 3C), enquanto que os níveis de glucuronídeos TSA em meio de cultura continuamente acumulada ao longo de detecção (Figura 3D e 3E). A formação de M2, mas não M1, foi reduzida em propofol ou UGT1A siARN transfecção em células HT29 (Figura 3B e 3C, Tabela 2). Ambos propofol e UGT1A siARN diminuiu significativamente a formação de glucuronídeos TSA M1 e M2 no meio de cultura (Figura 3D e 3E, Tabela 2).

HT29 células foram pré-tratadas com siRNA UGT1A ou veículo durante 48 horas, ou pré-tratados com propofol (100 uM) durante 1 hora. Em seguida, as células foram expostas a TSA (20 uM) durante 0,5, 2, 6, 24, e 48 horas e amostras de ambos o meio de cultura e as células foram colhidos e preparados para análise por HPLC. TSA e seus glucoronidos (M1 e M2) foram detectados com o método baseado no nosso relatório anterior [24]. (A) TSA intracelular de células HT29 ou HCT116; (B) intracelular M1 de células HT29; (C) M2 intracelular de células HT29; (D) M1 em meio de cultura de células HT29; (E) M2 em HT29 meio de cultura celular. Os dados são apresentados como média ± SD de pelo menos três experiências independentes.

UGT1A Diminui formação de ROS induzida por TSA

Temos anteriormente demonstrado que TSA sofre metabolismo NQO1 para produzir um catecol altamente instável intermediário que poderia ser ou conjugado por UGTs ou espontaneamente revertido para TSA pai para formar um ciclo redox fútil com quantidades excessivas de produção ROS [23]. Além disso, descobrimos que TSA produziu um nível significativo de ROS em células NSCLC, uma linha de NQO1 positivo e negativo UGT celular [25]. Nós portanto fundamentado que, na presença de UGT1A, o ciclo redox TSA-desencadeada pode ser comutada para a eliminação metabólica e reduzindo, assim, a produção de ROS. Para examinar esta hipótese, o ensaio de coloração DCF foi realizada para monitorar a formação de ROS induzida por TSA. TSA induziu a formação dependente da dose de ROS em células HCT116 (Figuras 4A). No entanto, estas alterações na formação de ROS não foram observadas em células HT29 (Figura 4B). Quando o propofol foi utilizado para inibir a actividade UGT1A9 em células HT29, o nível de ROS induzida por TSA foi significativamente aumentado em cerca de 3,6 vezes a 40 uM de TSA, e este aumento foi revertida por NAC (Figura 4B). Em contraste, o propofol não alterou o nível de ROS induzida por TSA em células HCT116, mas a combinação de NAC ainda diminuiu o nível de ROS induzida por TSA (Figuras 4A). Além disso, UGT1A siARN transfecção também aumentou significativamente os níveis de ROS por 2,0 vezes a 40 uM em células HT29 (Figura 4C).

As células foram pré-tratadas com siRNA UGT1A ou siRNA não específico (controlo negativo) durante 48 horas , ou pré-tratados com propofol (100 uM) /NAC (5 mM) durante 1 hora. Em seguida, as células foram expostas a TSA (5, 20, 40 uM) durante 1 hora e posteriormente tratada com DCFH-DA. A intensidade de fluorescência foi medida por um fluorímetro. As células HCT-116 (A); (B) e células HT29 (C). Os resultados são apresentados como média ± DP de pelo menos quatro experiências independentes (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, tratamento de TSA contra as células de controlo;

# P 0,05,

# # P 0,01,

### P . 0.001, propofol /NAC pré-tratamento vs TSA apenas, ou UGT1A siRNA pré-tratamento vs controlo negativo pré-tratamento siRNA)

UGT1A Faz com que a resistência do cancro do cólon células para induzida por TSA Citotoxicidade

O excesso de ROS pode induzir perturbações da homeostase intracelular redox, e modificações oxidativas irreversíveis de lípido, proteína ou ADN, subsequentemente, promover a morte apoptótica de células através tanto de receptor de morte e vias mediadas por mitocôndrias [29 ]. Temos validada recentemente que a citotoxicidade induzida por TSA é ROS dependentes [25]. Uma vez que a presença de células HT29 em UGT1A comprometidas a produção de ROS, propõe-se que a expressão de genes UGT1A iria aumentar a resistência das células cancerosas a citotoxicidade induzida por TSA. Para este fim, um ensaio MTT foi realizada em ambas as células HCT116 e HT29. Os resultados mostraram que o TSA produziu citotoxicidade dramática em células HCT116 que expressam nenhuma UGT1A com um

valor de IC50 de 4,5 ± 0,4 uM (Figura 5A). Em contraste, células HT29, que expressam enzimas UGT1A abundantes, foram encontrados altamente resistente a TSA citotoxicidade com um IC

50 valor de 54,3 ± 4,7 uM (Figura 5B). O pré-tratamento com propofol para inibir a actividade UGT1A9 aumentou significativamente TSA citotoxicidade nas células HT29, com um

valor de IC50 em 29,9 ± 4,5 uM (Figura 5B), que foi invertido pela combinação de NAC (IC

50 80 uM) . Em células HCT116, não se observou-propofol reforçada TSA citotoxicidade, mas a combinação de NAC causada alta resistência TSA (Figura 5A). Juntos, estes resultados sugerem que o efeito do propofol em células HT29 é a partir da inibição da UGT1A9 e promovendo assim o ciclo inútil de redox TSA. Consistentemente, transfecções UGT1A siRNA também aumentou o efeito citotóxico de TSA em células HT29 e reduziu significativamente o IC

50 valor de 25,9 ± 5,6 uM (Figura 5C).

As células foram pré-tratadas com siRNA UGT1A ou não- siRNA específico (controlo negativo) durante 24 horas, ou pré-tratados com propofol (100 uM) /NAC (5 mM) durante 1 hora. Em seguida, as células foram expostas a concentrações de gradiente de TSA (2,5-80 uM para HT29; 0,5-40 uM para HCT116) durante o tempo indicado e ensaio de MTT foi realizado. As células HCT-116 (A); (B) e células HT29 (C). Os resultados são apresentados como média ± DP de pelo menos quatro experiências independentes (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001)

induzida por TSA UGT1A Compromises apoptose de cólon. as células cancerosas

Para explorar ainda mais o papel de UGT1A total e UGT1A9 na actividade anti-câncer TSA-mediada, a morte por apoptose celular foi analisada pelo ensaio de anexina V-FITC /PI coloração. Quando as células HT29 foram expostas à concentração indicada de TSA durante 72 horas, havia poucas células apoptóticas detectáveis ​​(Figura 6B). No entanto, a morte por apoptose foi observada em células HCT116 depois de 48 horas de exposição TSA de uma forma dependente da dose. A morte celular apoptótica foi de 20,7 ± 1,7%, 30,8 ± 2,4% e 48,7 ± 3,0%, com concentrações de TSA de 5, 20, e 40 uM, respectivamente (Figura 6A). O propofol (100 uM) restaurado significativamente a susceptibilidade das células HT29 a morte apoptótica induzida por TSA, a partir dos níveis de apoptose basal a um rácio apoptótica de 27,8 ± 4,5%, 45,0 ± 3,5% e 53,5 ± 14,7% aos 5, 20, e 40 uM de TSA, respectivamente (Figura 6B). -Propofol apoptose aumentada não foi observada em células HCT116 (Figura 6A). Da mesma forma, UGT1A siARN transfecção aumento da apoptose celular induzida por TSA em células HT29, caracterizando com 16,2 ± 1,4%, 40,3 ± 4,3% e 48,5 ± 3,2% de células apoptóticas em concentrações de TSA de 5, 20, e 40 uM, respectivamente (Figura 6C ).

As células foram pré-tratadas com siRNA UGT1A ou siRNA não específico (controlo negativo) durante 72 horas, ou pré-tratados com propofol (100 uM) durante 1 hora. Em seguida, as células foram expostas a TSA (5, 20, 40 uM) durante o tempo indicado e recolhido. As células foram coradas por anexina V-FITC /PI e examinadas por citometria de fluxo um. As células HCT-116 (A); (B) e células HT29 (C). Os resultados são apresentados como média ± DP de pelo menos três experiências independentes (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, tratamento de TSA contra as células de controlo;

# P 0,05,

# # P 0,01,

### p . 0.001, propofol pré-tratamento vs TSA apenas, ou UGT1A siRNA pré-tratamento vs controlo negativo pré-tratamento siRNA)

Discussão

Muitos anti -Câncer agentes são substratos de UGTs, e por esta razão, a importância funcional do UGTs em causando resistência quimioterapêutica tornou-se uma preocupação importante. Apesar dos esforços anteriores para resolverem esta questão importante, pouco se sabe sobre o efeito directo do UGTs expressos em tumores tecidos /células para determinar a acumulação intracelular eo efeito anticancerígeno resultante de tais agentes que são substratos ‘UGTs. Mostramos neste estudo que o nível de UGT1A expressão, e em particular UGT1A9, é um fator importante na determinação da acumulação intracelular eo efeito apoptótica de TSA em células cancerígenas do cólon humano.

O nosso estudo anterior identificou que isoformas UGT1A, incluindo UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A10 e, em particular UGT1A9, são as enzimas dominantes envolvidos na glucuronidação da TSA seguintes a sua redução por NQO1. Embora UGT2B7 pode estar envolvida na produção de M1 e contribuir para a glucuronidação total de TSA, o valor CL

int (M1 + M2) de UGT1A9 foi muito mais elevada do que a de UGT2B7 [24]. E em células HT29, a expressão basal de UGT2B7 é muito menor do que UGT1A9 (Figura S1). Com base nesta constatação, o silenciamento de UGT1A por UGT1A siRNA ea inibição da UGT1A9 por propofol foram examinados em TSA metabolismo e toxicidade no presente estudo.

HT29 células possuem atividade enzimática UGT suficiente para glucuronidate TSA, tanto no fracções S9 e células vivas (Figura 1, 2, 3).