Sumário

P73, um membro da família p53 supressor de tumor, as ações de similaridade funcional para p53 altamente estruturais e. Como p53, a TAp73 transcricionalmente activa pode mediar a resposta celular a agentes quimioterápicos em células cancerosas humanas em até-que regulamenta as expressões de seus genes-alvo pró-apoptóticos tais como PUMA, Bax, Noxa. Aqui, nós demonstramos um mecanismo molecular da novela para a apoptose mediada por TAp73 em resposta a cisplatina em células de câncer de ovário, e que era independentemente do estado de p53. Descobrimos que TAp73 actuou como um activador da quinase c-Jun N-terminal (JNK) por via de sinalização se-regulação da expressão do seu alvo paragem do crescimento e dano do ADN-alfa-indutível da proteína GADD45 (GADD45α) e subsequentemente activação mitogen- proteína quinase activada quinase-4 (MKK4). A inibição da actividade de JNK por um inibidor específico ou um pequeno ARN interferente (siRNA) revogada significativamente a apoptose mediada por TAp73 induzida por cisplatina. Além disso, a inibição da GADD45α por siARN inactivado actividades MKK4 /JNK e também bloqueou a indução de apoptose mediada por TAp73 pela cisplatina. Nosso estudo demonstrou que TAp73 ativado o JNK apoptótica via de sinalização em resposta a cisplatina em células de cancro do ovário

Citation:. Zhang P, Liu SS, Ngan HYS (2012) Mediada por TAp73 a Ativação de C-Jun N -terminal Kinase Melhora Cellular Chemosensitivity à cisplatina em células de câncer de ovário. PLoS ONE 7 (8): e42985. doi: 10.1371 /journal.pone.0042985

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de fevereiro de 2012; Aceito: 16 de julho de 2012; Publicação: 10 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado conjuntamente pelo Wong Verifique Ela Charitable Foundation e do Fundo de investigação do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, da Universidade de Hong Kong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

P73, um novo membro da família p53 supressor de tumores, é semelhante à p53 quer estruturalmente quer funcionalmente [1], [2]. O gene p73 codifica mais de 20 isoformas da proteína devido à utilização de diferentes promotores e splicing alternativamente pós-transcricional. As isoformas TAp73 transcricionalmente activos, contendo o domínio de transactivação do terminal N completo, pode ligar-se especificamente a elementos responsivos de p53 e transactiva alguns dos genes alvo p53 e, subsequentemente, induzir a paragem do ciclo celular e apoptose, enquanto que as isoformas DNp73, com transactivação N-terminal truncado domínio, actua como um inibidor negativo dominante de ambos TAp73 e p53 [1], [3], [4]. Curiosamente, TAp73 é também um mediador da sensibilidade celular a agentes quimioterapêuticos em células cancerosas humanas [1], [4] – [7]. Muitos genes pró-apoptóticos, como PUMA, Bax e noxa, que actuam como activadores da via apoptótica mitocondrial, e têm elementos de resposta p73 no seu promotor e podem ser sobre-regulada por p73 para induzir a apoptose em resposta a fármacos quimioterapêuticos. Além disso, a p73 mediada por sobre-regulação de CD95 o receptor de morte, um mediador da via apoptótica extrínseco, também contribui para a apoptose mediada por p73 em células cancerosas sob estímulos de stress [8]. No entanto, ao contrário de p53, os mecanismos moleculares que implicam na apoptose celular mediada por p73 estão ainda não claramente compreendido. A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes precisas serão úteis no direccionamento p73 como um bom candidato para a terapia genética do cancro.

A JNK pertence a uma superfamilia de (MAP) quinase de proteína activada por mitogénio. As proteína-quinases JNK conter JNK1, JNK2 e JNK3. JNK1 e JNK2 são ubiquamente detectável. O JNK3 é restrita principalmente ao cérebro, coração e nos testículos [9]. A sinalização JNK, respostas das vias a vários estímulos de stress, através da transdução do MAPKKK a montante incluindo MEKKs, e subsequentemente activação da JNK por fosforilada em locais de Thr e Tyr pelas quinases JNK a montante directos MKK4 /MKK7. A activação de JNK, fosforila e activa o factor de transcrição a jusante de c-Jun e outros factores de transcrição [9], [10]. A via de sinalização JNK, actua como um modulador positivo chave de resposta apoptótica de células de salientar estímulos [9] – [11]. Além disso, a via de sinalização JNK contribui de forma crítica à apoptose dependente da cisplatina em células de câncer [12] – [15]

Neste estudo, objetivou-se estudar o efeito da TAp73 (TAp73α) na resposta celular a. cisplatina em células de cancro do ovário e os mecanismos moleculares subjacentes. Nós estávamos interessados ​​em saber se TAp73 teria qualquer papel regulador em outras vias de apoptose, tais como a via de sinalização JNK, após o tratamento com cisplatina.

Resultados

TAp73α aumenta a sensibilidade celular à cisplatina em células de cancro do ovário

para investigar o papel de TAp73 em células de cancro do ovário, em resposta à cisplatina, resistentes à cisplatina linhas celulares de cancro do ovário humano SKOV3 (null-p53) e OVCA433 (p53 de tipo selvagem) foram estavelmente transfectadas com o plasmídeo pEGFP -TAp73α (Figura 1A). O efeito de TAp73α na resposta celular a cisplatina foi avaliada tanto por ensaio de viabilidade celular XTT e ensaio clonogénico. Como mostrado na Figura 1B e 1C, TAp73α aumentou significativamente a sensibilidade celular à cisplatina em ambos null-p53 células SKOV3 e p53 OVCA433 do tipo selvagem, quando comparados com os controlos vector. Observou-se tal efeito, tanto de curto prazo (por ensaio XTT) e longo prazo (pelo ensaio clonogênica) ensaios de cultura. Além disso, a apoptose celular induzida por cisplatina também foi aumentada por sobre-expressão de TAp73α, como evidenciado pelo ensaio de TUNEL e análise de expressão de PARP clivada (Figura 2A e 2B). Estes resultados indicaram que TAp73 promovido sensibilidade celular à cisplatina através da indução da apoptose das células, e como função TAp73 era independente de p53, como os efeitos foram semelhantes em ambas as células e p53 null-p53 de tipo selvagem.

( A) O-GFP sobre-expressam TAp73α clones estáveis ​​em SKOV3 (C8, C24 e C28) e OVCA433 (C1, C7 e C12), as células foram verificadas por análise de western blot. (B e C) Ambos ensaio de viabilidade de XTT e ensaio clonogénico mostrou reduzida significativamente a proliferação celular em células TAp73α-sobre-expressos de SKOV3 e OVCA433 em comparação com os controlos vector vazio (V), em resposta ao tratamento com cisplatina. A percentagem de células sobreviventes em /colónias de cisplatina em relação a células /colónias em meio de controlo isento de fármaco foi medida. Os dados foram apresentados como média ± DP de três experiências independentes (*: p 0,05; **: p 0,01)

células (A) TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8, C24 e C28 e. OVCA433 C1, C7 e C12) e os controlos vector vazio (V) de SKOV3 e OVCA433 foram tratados com 4 ug /mL de cisplatina durante 48 h. As células apoptóticas foram avaliadas por ensaio de TUNEL. Mais de 500 células foram contados para cada grupo, os resultados apresentados foram a relativa das células apoptóticas de células totais e pelo menos três experiências independentes foram realizados (**: p 0,01). células (B) TAp73α-sobre-expressos e controle de vetores vazios foram tratados com doses diferentes (indicadas) de cisplatina durante 24 h, e a clivagem de PARP foi detectada por análise de Western blot.

TAp73α medeia a activação da via de sinalização JNK

relatórios anteriores demonstraram que a activação de JNK, contribui de forma crítica para a apoptose induzida por cisplatina células [12] – [15]. Nós, assim, a hipótese de que a apoptose de células TAp73α-mediada, em resposta à cisplatina pode actuar através da activação da via de sinalização JNK. O efeito de TAp73α sobre a activação de sinais de JNK foi primeiramente analisado medindo o nível de fosforilação de JNK (p-JNK) e o seu substrato c-Jun (p-c-jun) em células TAp73α-sobre-expressos. Como mostrado na Figura 3A, ambos p-JNK e P-c-Jun foram, obviamente, elevados em células TAp73α-sobre-expressos, quando em comparação com as células de controlo. O aumento de p-JNK e P-c-Jun foram adicionalmente aumentada nestas células em resposta à cisplatina, apenas um ligeiro aumento de p-JNK e P-c-Jun foi observado nas células de controlo. O tempo e a dose-dependentes experiências demonstraram que a activação de JNK induzida por cisplatina ocorreu em tão cedo quanto 6 horas, e até 48 h após as células tratadas com 4 ug /ml de cisplatina, e a dosagem de cisplatina eficaz para a activação de JNK foi tão baixo como 2 ug /ml para 12 h de tratamento em células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8; OVCA433 C1; Figura 3B). Além disso, a activação da JNK foi dependente da actividade transactivacional de TAp73α como o nível de p-JNK não foi alterado de forma estável nas células que sobre-expressam DNp73α (Figura 3C e 3D), uma isoforma truncada da p73 sem actividade de transactivação. Para verificar se o efeito da sobreexpressão TAp73α na promoção da sensibilidade celular era específica para a cisplatina, nós também realizadas as experiências semelhantes com o tratamento de Taxol, que também é uma primeira linha de drogas anticancro utilizado para o tratamento do cancro do ovário. Descobrimos que o taxol não foi capaz de activar a via da JNK em TAp73 overexpressed células de cancro do ovário, embora TAp73α poderia aumentada a sensibilidade de células em resposta a Taxol (Figura S1).

(A) Aumento de p-JNK e pc -Jun foi detectada em células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8, C24 e C28 e OVCA433 C1, C7 e C12) e reforçada mediante tratamento com cisplatina (4 mg /ml durante 24 h), quando comparados com os controlos (P: células parentais ; V: controle do vetor vazio). células (B) TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8 e OVCA433 C1) foram expostas a 4 ug /mL de cisplatina durante diferentes períodos de tempo, ou a diferentes doses de cisplatina durante 12 h. O nível de p-JNK foi medido por análise de Western blot. (C) DNp73α (GFP-DNp73α) foi sobre-expresso em células SKOV3 (D2) e OVCA433 células (D18). (D) Não foi observada activação JNK em células DNp73α-sobre-expressos (SKOV3 D2 e ​​OVCA433 D18).

A inibição da actividade JNK atenua apoptose TAp73α mediada em resposta a cisplatina

Para explorar a possibilidade TAp73α mediada por activação de JNK, contribuíram para a indução de apoptose em resposta à cisplatina, um inibidor específico da actividade de cinase de JNK, SP600125, foi usado. Após o tratamento de 20 SP600125 uM por 8 horas, o nível de p-JNK foi reduzida até 60% nas células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8 e OVCA433 C1, Figura 4A). Além disso, a inibição da activação de JNK por SP600125 reduziu significativamente a apoptose celular induzida por cisplatina em células TAp73α-sobre-expressos, como evidenciado pelo ensaio de TUNEL e análise de expressão clivado PARP (Figura 4B e 4C).

(A) TAp73α- células sobre-expresso (SKOV3 C8 e OVCA433 C1) foram tratadas com 20? M SP600125 por diferentes períodos de tempo (indicada). Os níveis de fosforilação de JNK e c-Jun foram medidos. (B e C) células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8 e OVCA433 C1) e os controlos vector vazio (V) foram tratadas com 20? M SP600125 ou DMSO e, em seguida, com a cisplatina. A apoptose de células foram avaliadas pelo ensaio de TUNEL (barras de erro indicado ± SD média de três experiências independentes; *: p 0,05) e a clivagem de PARP análise. A inibição da JNK atenuada TAp73α apoptose mediada em resposta à cisplatina. células (D) TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8 e OVCA433 C1) foram tratadas com ARNsi de JNK (Si-JNK) ou o controlo scrambled siRNA (Controlo). As activações de JNK e c-Jun foram ausente mediante tratamento com cisplatina, e associada com apoptose de células marcadamente reduzida (E e F).

A activação da via de JNK por TAp73α implicada na apoptose induzida por cisplatina era também demonstrado pela observação de que o silêncio de JNK1 e -2 em células TAp73α-sobre-expressos bloqueou significativamente a morte celular induzida por cisplatina. Como mostrado na Figura 4D, o tratamento de ARNsi contra JNK1 e -2 em células cancerosas (SKOV3 C8; OVCA433 C1), obviamente, regulada negativamente a expressão de JNK1 /2 em comparação com os controlos de ARNip mexidos, e o tratamento subsequentemente suprimiu os níveis de fosforilação de JNK e o seu substrato C-junho Como evidenciado pelo ensaio de TUNEL e análise de expressão de PARP clivada, a apoptose induzida por cisplatina em células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8; OVCA433 C1) foi significativamente atenuado por JNK tratamento silenciando (Figura 4E e 4F). Estes resultados confirmam ainda que a activação de JNK por via TAp73α contribui para a apoptose mediada por TAp73α em células de cancro do ovário, em resposta à cisplatina.

TAp73α mediada por sobre-regulação de GADD45α é responsável pela activação da via de sinalização JNK

GADD45α tem sido identificada como um parceiro de ligação e o activador da quinase a montante de JNK MEKK4 /MTK1, e a sua ligação a MEKK4 /MTK1 pode activar o gene de MKK4 e a jusante de JNK, [17], [18]. Por outro lado, GADD45α é um gene alvo bem definido de p73 [19], [20]. Assim, a hipótese de que GADD45α pode desempenhar um papel na activação da via de sinalização JNK mediada por TAp73. O efeito da TAp73 na expressão GADD45α foi avaliada pela primeira vez. Como mostrado na Figura 5A e 5B, a expressão de GADD45α foi regulado para cima em ambos os níveis de proteína e ARNm em células TAp73α-sobre-expressos. Em resposta à cisplatina, TAp73α mediada por sobre-regulação de proteína GADD45α foi ainda aumentada (Figura 5B). Como GADD45α pode interagir diretamente com MEKK4 /MTK1 para ativar seu substrato MKK4 quinase [17], [18], que, em seguida, mediram o nível de fosforilação de MKK4 em células TAp73α-sobre-expressos. Como mostrado na Figura 5B, foi observado aumento de MKK4 fosforilado em células TAp73α-sobre-expressos e aumentado em resposta ao tratamento com cisplatina. Estes resultados sugerem que a activação mediada TAp73α da via de sinalização JNK, possivelmente através de regulação positiva do seu gene alvo GADD45α e subsequente activação de MKK4, um componente a montante da via de sinalização JNK.

(A) aumento da expressão de mRNA GADD45α em células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8, C24 e C28 e OVCA433 C1, C7 e C12). (B) Aumento da expressão da proteína GADD45α eo nível de fosforilação MKK4 em células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8, C24 e C28 e OVCA433 C1, C7 e C12). (C) GADD45α foi derrubado em células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8 e OVCA433 C1) por siRNAs (SI1-GADD45α e Si2-GADD45α) de tratamento. A ativação de MKK4, JNK e c-Jun foram diminuídos, mesmo sob o tratamento com cisplatina.

Para verificar esses achados, um par de siRNAs contra GADD45α (SI1-GADD45α e Si2-GADD45α) foi usada para knockdown de forma transiente a expressão GADD45α. Os níveis de fosforilação de MKK4, JNK e c-Jun foram consequentemente reduzida sobre a sub-regulação de GADD45α, mesmo em resposta ao tratamento com cisplatina (Figura 5C). Portanto, confirmamos que TAp73α mediada por aumento da regulação do GADD45α foi responsável pela ativação da via de sinalização JNK em células de cancro do ovário.

GADD45α é responsável por apoptose TAp73α mediada

Para determinar se o silêncio de GADD45α tem um efeito sobre a apoptose induzida por cisplatina em células TAp73α-sobre-expressas, as células foram tratadas com ARNsi GADD45α e apoptose celular foi medida. Como mostrado na Figura 6, a apoptose induzida por cisplatina foi drasticamente diminuída em GADD45α-silenciados células TAp73α-sobre-expressos (SKOV3 C8; OVCA433 C1). Estes achados sugerem que o TAp73α mediada por sobre-regulação de GADD45α era responsável pela activação da JNK e via de apoptose celular em células cancerosas de ovário de sinalização.

apoptose celular foi diminuída em células TAp73α-sobre-expressos (C8 e SKOV3 OVCA433 C1) em resposta à cisplatina após o tratamento GADD45α ARNsi. A apoptose das células foi medida por (a) ensaio de TUNEL (barras de erro indicam a média ± SD de três experiências independentes; *: p 0,05; **: p 0,01) e (B) a clivagem de ensaio de PARP

Discussão

neste estudo, foi demonstrado que, pela primeira vez, para o nosso conhecimento, TAp73 parcialmente mediada por apoptose celular em resposta cisplatina através da activação da via de sinalização JNK em células de cancro do ovário. Descobrimos que, em resposta à cisplatina, TAp73α activado a via de sinalização JNK, através do aumento da regulação do seu gene a jusante GADD45α, e a resposta foi TAp73-dependente e independente de p53.

Estabelecida evidência mostrou que a transcricionalmente activo TAp73 aumento da sensibilidade celular à cisplatina fármaco quimioterapêutico em células cancerosas humanas [5] – [7], [21]. Além disso, um estudo recente demonstrou que a expressão TAp73 em cancros do ovário foi muito maior em cancros que respondem comparado com cancros que não respondem [22]. Nosso estudo confirmou que TAp73 fez aumentar a sensibilidade celular à cisplatina em células de cancro do ovário. Embora TAp73 é funcionalmente semelhante ao de p53, a expressão de p53 funcional foi demonstrado ser necessário para a apoptose mediada por células-TAp73 sob estimulação danos no ADN [23]. Por outro lado, alguns estudos sugeriram que a quimiossensibilidade mediada por p73 é independente da expressão de p53 em algumas células cancerosas [5], [24]. Em nosso estudo, a apoptose TAp73α mediada foi observado em células SKOV3 p53, indicando que a apoptose mediada por TAp73 era independente de p53, pelo menos no nosso modelo de células, enfatizando ainda mais o papel independente da p73 entre os seus membros da família em danos DNA resposta.

As funções de via de morte celular de JNK como um importante regulador da apoptose celular em resposta a vários estímulos de stress e na verdade desempenha um papel central em vias apoptóticas, incluindo extrínseca (receptores de morte) [11] e intrínseca (mitocondrial ) caminhos [11], [25]. Estudos anteriores têm demonstrado que a activação mediada pela cisplatina da JNK em células cancerosas via de sinalização contribuiu de forma crítica para a apoptose dependente de cisplatina [12] – [15]. A regulação positiva de Fas L expressão resultou da activação de JNK e o seu substrato c-Jun desempenhou um papel-chave na apoptose induzida por cisplatina em células de cancro do ovário [15]. Os nossos resultados mostraram que a JNK e o seu substrato c-Jun foram activadas em células TAp73α sobre-expresso, e ainda mais aumentada em resposta ao tratamento com cisplatina. A supressão da activação de JNK por inibidor de JNK ou JNK nestas células siRNAs revogada TAp73α apoptose mediada. Estes resultados sugerem que a sobre-regulação da actividade de JNK contribuiu para a indução de apoptose mediada por TAp73 em células de cancro do ovário, em resposta à cisplatina. Esta foi a primeira vez para mostrar que TAp73 funcionava como um activador a montante da via JNK para activar os sinais de JNK para induzir a apoptose celular.

Para explorar melhor os mecanismos subjacentes pelos quais TAp73-regulado o nível de fosforilação de JNK, um gene alvo p73 GADD45α estava ciente. GADD45α é um gene bem definida a jusante da TAp73 e p53 [19], [20] e pode ser induzida por agentes de danos no DNA, e desempenha um papel importante na indução da apoptose [26]. Curiosamente, estudos anteriores mostraram que a activação da JNK por via apoptótica GADD45α foi estreitamente implicados na indução da apoptose mediada GADD45α-[27], [28]. GADD45α interagiram directamente com MEKK4 /MTK1 para activar o substrato MKK4 quinase, e, consequentemente, sobre-regular a activação de JNK, um evento que está envolvido na indução de apoptose [17], [18]. Nosso estudo demonstrou que as expressões de ambos GADD45α e MKK4 ativa foram regulados positivamente em células TAp73α-sobre-expressos, e este efeito foi ainda mais agravado após a exposição a cisplatina. Por outro lado, quando GADD45α foi silenciada, as activações de MKK4, JNK e c-Jun foram suprimidos, mesmo sob o tratamento de cisplatina, e a apoptose induzida por cisplatina TAp73α mediada também foi significativamente bloqueada. Estes resultados indicaram que TAp73 era capaz de activar o circuito apoptótico da JNK por cima de regulação da expressão GADD45α em células de cancro do ovário, em resposta à cisplatina.

Curiosamente, relatório anterior propôs uma conversa cruzada entre a via JNK e p73, e sugeriu que a JNK foi um regulador importante na apoptose mediada por p73, em resposta à cisplatina [13]. Eles mostraram que p73 era um substrato de cinase de JNK. JNK, p73 fosforilado em determinados locais para aumentar a actividade de transcrição p73 e apoptose mediada por p73 em células de cancro, na presença de cisplatina. No presente estudo, nós demonstramos que a sobre-expressão de TAp73 activada a actividade de JNK em células de cancro do ovário, em resposta à cisplatina. TAp73 actuou como um activador a montante da via de JNK apoptótico através da sobre-regulação de GADD45α, e a subsequente activação de MKK4 (Figura 7). Assim, os nossos resultados proporcionado um novo ângulo para a diafonia entre a p73 e a via JNK, em resposta a apoptose celular.

agente de danos no ADN, a cisplatina induz a acumulação TAp73 e a subsequente sobre-regulação de genes alvo seus pró-apoptóticos para induzir a apoptose celular. Ao mesmo tempo, aumento da regulação do gene alvo TAp73, GADD45α ativa a via apoptótica JNK através da sua interacção com MEKK4 /MTK1 para induzir a apoptose.

Em conjunto, os nossos resultados apoiam claramente uma nova via de celular mediada por TAp73 sensibilidade à cisplatina em células de cancro do ovário. Nós demonstramos que TAp73α induziu a resposta apoptótica através da activação da cascata de morte celular GADD45α-MKK4-JNK e proporcionado um cenário de novo para a diafonia entre a p73 e JNK via apoptótica sob tensões. Esta resposta celular independente de p53 dependente de TAp73 e que desempenham um papel importante na resposta a danos no ADN em células de cancro do ovário, como a função de p53 era defeituosa na maioria das células cancerosas. Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes em resposta apoptótica mediada por TAp73 é valioso na segmentação p73 como um gene candidato terapêutico.

Materiais e Métodos

Cultura celular e tratamento de drogas

linhas celulares de cancro do ovário humano SKOV3 (p53 nulo) e OVCA433 (p53 de tipo selvagem) foram o presente do Prof. Tsao, Departamento de anatomia, da Universidade de Hong Kong, onde SKOV3 foi obtido a partir de ATCC, Manassas, VA [29], e OVCA433 foi estabelecida e descrita anteriormente [30]. Eles foram mantidos em Meio Mínimo Essencial (MEM) (Invitrogen Corporation, Grand Island, yn), com 10% de Soro Fetal Bovino (Invitrogen), e incubadas numa incubadora humidificada a 37 ° C que contém 5% de CO

2.

Cis-Diamineplatinum (II) dicloreto de (cisplatina, CDDP) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), e o inibidor específico SP600215-JNK (Calbiochem, San Diego, CA) foram dissolvidos em mili- água Q e sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma), respectivamente, e, em seguida, armazenada a -20 ° C. Estas soluções foram diluídas em meio de cultura de células antes do tratamento. DMSO foi diluída em meio isolado como controlo.

plasmídeos, transfecção siRNA e

Os plasmídeos pEGFP-TAp73α e pEGFP-DNp73α foram construídos por amplificação por PCR do comprimento total da região codificante e TAp73α DNp73α em cDNAs de células de cancro do ovário. E os produtos de PCR foram digeridos e, em seguida, clonado em grelha no vector de expressão pEGFP (Clontech Laboratórios, Mountain View, CA). Para os clones estáveis, os transfectantes pEGFP-TAp73α e pEGFP-DNp73α foram seleccionadas por G418 (Invitrogen) durante 14 dias e, em seguida, as colónias individuais foram recolhidas e verificadas por análise de Western blot. Os ARNsi contra JNK e GADD45α e o siRNA scrambled (controlo negativo) (Applied Biosystems por Life Technologies, Foster City, CA) foram transfectados para células a 20 nM de concentração final. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foi utilizado para transfecção de células de acordo com as instruções do fabricante.

RT-PCR

O ARN total de células foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen), e o ADNc foi sintetizado com alta capacidade kit de ARN-ADNc-a mistura de PCR (Applied Biosystems). Os iniciadores específicos (GGAGGAAGTGCTCAGCAAAG e TCCCGGCAAAAACA AATAAG) foram utilizados para amplificar ADNc GADD45α humano.

análise Western blot

As células foram recolhidas com 0,05% de tripsina /EDTA (Invitrogen) e as proteínas foram extraídas usando convencional tampão de lise RIPA [16]. Os anticorpos contra GFP, JNK e GADD45α foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra MKK4, PARP e c-Jun e as formas activas de JNK, c-Jun (ser63) e MKK4 foram obtidos a partir de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA).

análise de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de XTT (hidróxido de 2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H -tetrazolium-5-carboxanilida sal interno) kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços e tratadas com cisplatina (4 mg /ml) no dia seguinte. A viabilidade celular foi medida após um dia de tratamento durante quatro dias consecutivos.

clonogénicas ensaio

A capacidade de formação de colónias de células foi medido pelo ensaio clonogénico. As células foram plaqueadas em triplicado em meio contendo cisplatina (0,15 ug /ml) ou meio isento de fármaco a uma concentração de 500 células por poço em placas de 6 poços. Após 48 h de incubação, todas estas células foram deixadas crescer em meio isento de drogas durante 10-12 dias. As colónias sobreviventes foram fixadas em etanol a 75% e, em seguida, coradas em 1% de Giemsa (Merck, Damstadt, Alemanha). As colónias constituídas por mais do que 50 células foram contadas.

Ensaio de Apoptose

As células apoptóticas foram examinados por ensaio de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche) segundo as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em lamelas de um dia antes de 4 ug /ml de tratamento com cisplatina durante 48 h. Após a fixação e permeabilização, as células foram coradas com a mistura reaccional de TÚNEL, e contra-coradas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol) (Sigma).

A análise estatística

Os dados foram expressos DP ± como a média de três experiências independentes. SPSS 16.0 (SPSS) foi usada para análise de dados. teste t de Student foi utilizado para avaliar a diferença entre os grupos. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Informações de Apoio

Figura S1..

TAp73α aumento da sensibilidade celular para o Taxol, mas não através da via de JNK. (A) ensaio de viabilidade de células mostrou XTT TAp73α-sobre-expressos de SKOV3 e OVCA433 foram mais sensíveis ao tratamento com taxol, em comparação com os controlos vector vazio (V). (B) Depois de cisplatina ou tratamento com taxol durante 24 horas, o nível de fosforilação de JNK não foi aumentada em células SKOV3 e OVCA433 células tratadas com Taxol, mesmo com TAp73α células sobre-expressão (C: controlo; D: cisplatina: T50 e T500: 50 ng /ml e 500 ng /ml Taxol)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0042985.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Prof. SW Tsao do Departamento de anatomia, da Universidade de Hong Kong para fornecer as linhas de células de câncer de ovário OVCA433 e SKOV3.