Abstract
Fundo
A vertente ricas em guanina dentro do promotor do
gene KRAS
pode dobrar em uma estrutura G-quadruplex intra-molecular (G4), que tem um papel importante na regulação da
KRAS
transcrição. Temos anteriormente identificados indolo [3,2
b
] quinolinas com um grupo 7-carboxilato e três cadeias laterais de alquilamina (IQ3A) como estabilizadores G4 eficazes e promissoras leads anticancerígenos seletivos. Aqui nós investigamos o mecanismo anticancerígeno de ação desses compostos, o que diminuiria devido à estabilização da sequência G4 no
KRAS
promotor e subsequente diminuição da regulação da expressão gênica.
Metodologia /Principais achados
compostos IQ3A apresentou maior estabilização do G4 em comparação com duplex estruturas de DNA e reduziu
KRAS
atividade do promotor em um ensaio duplo repórter luciferase. Além disso, os compostos IQ3A mostraram alta actividade anti-proliferativa em células de cancro do cólon HCT116 e SW620 (IC
50 2,69 ^ M), sem provocar a morte das células HEK293T em rim embrionário humano não-maligno, e fibroblastos humanos do cólon CCD18co. IQ3A compostos reduzidos significativamente
KRAS
mRNA e os níveis de estado estacionário de proteína na IC
50 concentrações, e aumento da proteína p53 níveis de estado estacionário e morte celular por apoptose em células HCT116 (mut
KRAS
, em peso
p53
). Além disso, KRAS silenciamento em HCT116 p53 do tipo selvagem (p53 (+ /+)) e nula (p53 (- /-)) linhas celulares isogénicas induziu um maior nível de morte celular, e uma morte celular mais elevada induzida por IQ3A em p53 HCT116 (+ /+) em comparação com p53 HCT116 (- /-).
Conclusões
Aqui nós fornecemos evidências de que ligantes G4 tais como compostos IQ3A pode alvejar motivos G4 apresentar no
KRAS
promotor, infra-regular a expressão do mutante
gene KRAS
através da inibição da transcrição e da tradução, e induzir a morte celular por apoptose em linhas celulares de cancro do cólon. Assim, visando KRAS no nível genômico com ligantes G4 pode ser uma nova estratégia de terapia antineoplásica para câncer de cólon
Citation:. Brito H, Martins AC, Lavrado J, Mendes E, Francisco AP, Santos SA, et al . (2015) Segmentação
KRAS
Oncogene em células de cancro do cólon com 7-carboxilato indolo [3,2-
b
] quinolina Tri-alquilamina Derivativos. PLoS ONE 10 (5): e0126891. doi: 10.1371 /journal.pone.0126891
Editor do Academic: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos
Recebido: 06 de janeiro de 2015; Aceito: 08 de abril de 2015; Publicado em: 29 de maio de 2015
Direitos de autor: © 2015 Brito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Autores de iMed-ULisboa reconhecer Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal, para o apoio financeiro por subvenções a projectos EXPL /QEQ-MED /0502 /2012, HMSP-ICT /0018/2011, e Pest-OE /SAU /UI4013 /2014. HB, CMPR e PMB também agradecer Sociedade Portuguesa de Gastroenterologia e da Coreia do Human Gene Bank (KHGB), Medical Genomics Research Center, KRIBB, República da Coreia. JL reconhece FCT para o Pós-Doutorado conceder SFRH /BPD /72903/2010 e SAS para PhD concessão SFRH /BD /80162/2011. O laboratório Neidle reconhece o apoio do Fundo de Investigação do cancro do pâncreas e do Conselho de Investigação Médica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o
gene KRAS
codifica uma proteína G que serve como um interruptor molecular entre o receptor do factor de crescimento endotelial e o núcleo, controlar várias vias de sinalização importantes para o crescimento e sobrevivência celular. KRAS GTPase existe em dois estados, um estado ativo ligada a GTP e um estado inactivo ligada a GDP. Além disso,
KRAS KRAS mutações aumentar a afinidade para a GTP conduz à activação constitutiva da proteína. É importante ressaltar que a exclusão de mutante
KRAS
alelo em linhas celulares de cancro do cólon reduz drasticamente a proliferação celular [1], destacando o fato de que muitos tumores abrigando mutante
KRAS Quais são KRAS-dependente.
KRAS
mutações são na sua maioria predominante no pâncreas (90-60%), carcinomas colo-rectal (30-50%) e do pulmão (20-30%) [2]. Devido à alta incidência destes cancros em todo o mundo [3] e o aumento da resistência à quimioterapia convencional [4], a busca de novos alvos tem sido intensificado nos últimos anos recentes.
A importância da modulação terapêutica de sinalização KRAS tem sido amplamente reconhecido e várias abordagens têm sido relatados no passado, mas nenhum tem proporcionado uma nova droga anticâncer aprovado até à data [5]. Uma abordagem terapêutica inovador a ser estudado é o uso de miARN, uma vez que eles desempenham um papel importante na quimio-sensibilização [6]. Temos anteriormente demonstrado que miRNA-143, o que também reduz
expressão KRAS
, chemosensitizes células cancerígenas do cólon e 5-fluorouracil [7], e reduz o crescimento do tumor
in vivo
, com o aumento da apoptose e proliferação reduzida [8].
Continuando nossos estudos que visam descobrir novas e anticancerígenos seletiva drogas, prosseguido através do desenvolvimento de vários sistemas químicos a serem utilizados em diversas estratégias terapêuticas [9], [10], [11 ], relatamos aqui em uma abordagem de segmentação KRAS sinalização em células cancerosas através da modulação diretamente
expressão KRAS
ao nível do gene. Foi recentemente demonstrado que uma cadeia rica em guanina dentro do promotor de
KRAS
pode dobrar-se em uma estrutura intramolecular de G-quadruplex (G4), que tem um papel importante na regulação de
KRAS
transcrição [12], [13]. arranjos G4 são o ácido nucleico de estruturas de ordem superior, formados por sequências repetitivas contendo guanina (G) ricas em intervalos [14]. Vários estudos têm fornecido provas que sustentam a existência de G4s nos telómeros eucarióticas e promotores de oncogenes, incluindo os de
KRAS
,
HRAS
,
HSP90
,
c-MYC
,
c-KIT
,
BCL-2 Comprar e
VEGF
genes, e que pequenas moléculas de estabilização estruturas G4 é capaz de regular negativamente a transcrição oncogene no tumor linhas de células, inibem a actividade da telomerase e induzem a paragem do crescimento de células cancerosas [15], [16], [17]. estruturas G4 também foram encontrados em sequências de ARN, incluindo na região 5 ‘não traduzida (UTR) de
KRAS
ARNm, e mostraram ter as funções de regulação de tradução [18], [19], [20].
Indoloquinolines são alcalóides naturais capazes de atingir estruturas de DNA, alguns dos quais têm potencial de desenvolvimento em fármacos anti-cancerígenos [21], [22]. Indolo [3,2-
b
] derivados de quinolina têm sido mostrados para ser ligandos potentes G4, e para inibir a proliferação celular do oncogene e (
c-myc
) transcrição [21], [23 ], [24]. Além disso, recentemente descobriu que indolo [3,2
b
] quinolinas com um grupo 7-carboxilato e três cadeias laterais de alquilamina (1a e 2a na Figura 1) são promissoras leads anticancerígenos seletivas [25]. Estes compostos inibiram selectivamente (100 vezes) o crescimento de
KRAS
mutantes células de cancro do cólon HCT116 em comparação com hepatócitos primários de rato, ao mesmo tempo, diminuir os níveis de proteína KRAS. A fim de explorar essa andaime para a descoberta de novos e melhores medicamentos anticâncer, nós estendemos a diversidade química desses indoloquinolines e estudou seu mecanismo anticancerígeno potencial de ação. Anteriores estudos estrutura-actividade com mono-alquilamina indolo [3,2
b
] quinolinas têm mostrado que a estabilização G4 óptima foi induzida por compostos com cadeias laterais propil e grupos amina básicos (p
Ka
≥ 8) [25]. Assim, os compostos foram concebidos, sintetizados e avaliados para a estabilização térmica G4 selectiva em comparação com duplex de ADN 1a-d e 2a-d (Fig 1), juntamente com a inibição da proliferação de células de cancro, indução de apoptose e regulação negativa de
KRAS Comprar e
HSP90
expressão transcrição e proteínas. A fim de melhorar o perfil de atividade anticancerígena e
KRAS
oncogene down-regulação da capacidade dos nossos indoloquinolines alvo, utilizou-se quatro linhas de células com diferentes
KRAS Comprar e
TP53
genótipos , bem como dois controlos positivos, o fármaco anti-cancro 5-fluorouracilo (5-FU) e o ligando G4 TMPyP4 (Fig 1).
7-carboxilato de indolo [3,2
b
] quinolina derivados tri-alquilamina (IQ3A) 1a-d e 2a-d; G4 ligando porfirina derivado TMPyP4 e 5-fluorouracil (5-FU) droga anticâncer.
Resultados e Discussão
Compostos 1a-d e 2a-d foram sintetizados em quatro etapas seguintes do procedimento descrito anteriormente [25], com algumas modificações (S1 texto). Estruturas de 1a-d e 2a-d foram completamente elucidados pelo bidimensional
1H (COSY e NOESY) e
13 C heterocorrelation experiências de RMN (HMQC e HMBC) e pureza ( 95%) confirmada por HPLC-ELSD- MS (S1 figura).
a capacidade dos compostos 1a-d, 2a-d e o ligando padrão G4 TMPyP4 (figura 1) [16] para se ligar e estabilizar
KRAS
[26] e
HSP90A
[27] estruturas de DNA G4, assim como DNA duplex (T-circular) foi avaliada por um ensaio de fusão de transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET). O aumento das temperaturas de fusão induzidas por diferentes concentrações de compostos é apresentado na Tabela 1 e S2 Fig. Nossos resultados mostram que tri-alquilamina indolo [3,2
b
] quinolinas (IQ3A) são ligandos potentes e selectivos para o
KRAS Comprar e
HSP90A
estruturas G4. Como previamente observado para os análogos mono- e di-alquilamina [25] e outros ligandos G4 poliaromáticos-fundido [28], [29], compostos com cadeias laterais propilamina (1D e 2D) são estabilizadores G4 superiores (Δ
T
m entre 18 e 23 ° C a 2 m de ligante) do que compostos com cadeias mais curtas laterais alquilamina (1a-b e 2a-b; Δ
T
valores m entre 7 e 17 ° C, a concentração do ligando 2 uM). Observou-se que a basicidade das cadeias laterais se correlaciona positivamente com a estabilização térmica G4 de todas as sequências de ADN até um pKa óptima ~ 8,0-9,0 (Figura 2). As aminas heterocíclicas no final da cadeia lateral de alquilo (1b e 2b) parecem melhorar a ligação e estabilização G4 complexo em comparação com o grupo de di-etilamina (1a e 2a), que não pode ser explicada pelas diferenças na basicidade entre grupos terminais. Além disso, e em consonância com o que foi anteriormente observado para indoloquinolines di-alquilamina [25], este estudo sugere que N5, N10, COO tri-substituição com grupos amina heterocíclicos em alquilo lado aumento terminais cadeia ligando de afinidade para G4, como 2b, d complexos de ADN -G4 têm temperaturas de fusão mais elevados do que os complexos da correspondente isómeros 1b, d. No entanto, isso não foi observado para o isômero par 1a /2a. Apesar do aumento da capacidade de estabilização G4, ligantes 2b e 2d não foram capazes de discriminar significativamente entre as duas estruturas DNA G4 (Tabela 1).
A. Calculado p
K of a valores de grupos amina da cadeia lateral por SPARC (v. 4.6). B. A parcela de variação de estabilização térmica G4 por compostos (Δ
T
m) com basicidade (p
K
a) de grupos de cadeias laterais.
Para estudar o efeito dos compostos IQ3A em células cancerosas e não-cancerosas, foram selecionados 2d composto mostrando o melhor capacidade de estabilização G4
in vitro
eo par 1a e 2a, que apesar de apresentar menor Δ
T
valores m para os respectivos complexos com DNA G4, são capazes de reduzir
KRAS
expressão quando incubadas em células de cancro colo-rectal HCT116, como mostramos anteriormente [25].
O efeito de curto prazo de compostos às 72 h no crescimento celular foi estudada utilizando linhas celulares de carcinoma colorretal com diferentes
KRAS Comprar e
TP53
genótipos: HCT116 carcinoma colorectal humano (mut
Kras
, do tipo selvagem (wt)
p53
) e adenocarcinoma humano metastático colorectal SW620 (mut
Kras
, mut
p53
). Em paralelo, também usou o embrionária HEK293T linha de células de rim humano imortalizado (peso
Kras
, em peso
p53
) e células de cólon humano fibroblastos normais CCD18co (peso
Kras
, wt
p53
). A IC
50 e IC
65 valores da Tabela 2 mostram que os compostos 2a e actividade anti-proliferativa superiores 2D em comparação com 1a e 5-FU, particularmente em células SW620 metastáticas, onde 2d deu um IC
50 valor (0,28 uM), quase 20 vezes mais baixa do que a do padrão de fármacos no tratamento de 5-FU (IC
50 = 5,39 uM). Interessantemente, as células de cancro colo-rectal HCT116 e SW620, que expressam mutante KRAS, foram particularmente insensível ao derivado de porfirina TMPyP4, em contraste com as células HEK293T não-malignas que expressam KRAS tipo selvagem. Além disso, os compostos IQ3A e 5-FU, não eram selectivos para células cancerosas que expressam KRAS mutante, uma vez que eles eram igualmente activos contra HCT116, SW620 e células HEK293T. No entanto, observou-se alguma selectividade (SI 2,4; Tabela 2). Para a linha celular HCT116 do cancro do cólon em comparação com os fibroblastos normais de cólon (CCD18co)
Subsequentemente, o ensaio de goiaba ViaCount foi utilizado para avaliar os efeitos dos compostos IQ3A na indução de morte celular em células cancerosas (HCT116 e SW620) e não-maligna (HEK293T e CCD18co), em comparação com 5-FU e TMPyP4 em concentrações equitóxica (IC
50 e IC
65) . A regulação negativa do mutante
expressão KRAS
por oligonucleótidos anti-sentido em células de cancro colo-rectal [7], [8], [30] e por um chamariz oligonucleótido MAZ de ligação em células de cancro pancreático [31] tem sido associada com aumento da apoptose e paragem do crescimento celular. Além disso, os fármacos anti-cancerígenos, tais como 5-FU e estabilizadores G4 de sequências teloméricas e promotor de oncogene, tais como TMPyP4, são conhecidos por induzir uma resposta generalizada célula levando à paragem do crescimento celular e a morte celular por apoptose (resposta a danos no ADN) [15], [32], que envolve a activação do factor de transcrição p53 pró-apoptótico entre outras vias, no caso do 5-FU [34]. Figura 3 mostra que os compostos de teste têm efeitos distintos sobre as células, dependendo da estrutura do composto e, provavelmente, também no fundo genético de uma linha de célula individual. Em células HCT116, todos os compostos induziu a morte celular por apoptose, mas os compostos IQ3A mostrou o efeito apoptótico mais significativo, com uma tendência de 1a 2a 2D, e causando a morte celular 30-70%, em concentrações que variam 0,58-3,42 uM (IC
65) (Fig 3B, painel superior esquerdo). Por outro lado, todos os compostos foram incapazes de induzir a morte celular significativa em HEK293T e células CCD18co (Figura 3A e 3B, painéis inferiores), ao passo que em SW620 células única de 5-FU foi capaz de induzir apoptose de um modo dependente da dose (Figura 3A e 3B , painéis superior direito). O efeito de TMPyP4 em SW620 não foi estudada, como esta linha celular não foi sensível a este composto a uma concentração de 20 uM.
populações de células foram obtidos por citometria de fluxo goiaba ViaCount seguinte 72 h de incubação de cancro do cólon HCT116 , SW620 câncer de cólon metastático, CCD18co fibroblastos de cólon humano e HEK293T linhas embrionárias de rim celulares com 5-FU, TMPyP4 e IQ3A em equitóxica (IC
50 e IC
65) concentrações, ou DMSO (controlo do veículo). Os resultados são expressos como a média percentual (%) de células viáveis, apoptóticas e meados de mortos ± SEM, de pelo menos três experiências diferentes, para A. IC
50, e para B. IC
65 concentrações do composto. a, p 0,05; b, p 0,01 de DMSO (controlo do veículo); c, p 0,05; e d, p 0,01 a partir de 5-FU.
Para validar ainda mais o efeito dos compostos IQ3A na indução de apoptose em células HCT116, a apoptose foi determinada por avaliação de alterações na morfologia nuclear por coloração Hoechst, e também pela nexina ensaio, após 72 h de incubação com compostos IQ3A no ic
50 concentrações. células CCD18co foram usadas em paralelo para confirmar que IQ3A não induzir a morte celular em células normais. Estes resultados mostraram que IQ3A induzir de forma significativa a apoptose em células HCT116, com o composto de 1a a produção de um aumento da apoptose em comparação com veículo (Figura 4A e 4B). Além disso, também confirmou que os compostos IQ3A não induzir a apoptose em fibroblastos normais do cólon CCD18co. A proteína p53 desempenha um papel central e central em cancros humanos [33], que possui uma actividade supressora de tumor potente através de mecanismos pleiotrópicos. Portanto, os níveis do estado estacionário da proteína p53 foi avaliada por imunotransf erência, após 72 h de incubação com compostos IQ3A no ic
50 concentrações, para determinar o seu envolvimento no mecanismo de apoptose induzida por IQ3A. Os nossos dados (Fig 5A) demonstram claramente que IQ3A aumento dos níveis de estado estacionário da proteína p53 em HCT116 por 4-7 vezes (
P
0,01) (Figura 5A, painel esquerdo), o qual pode ser correlacionada com a maior morte celular verificada por ensaio de goiaba ViaCount. Em células SW620, foi detectado nenhum aumento significativo na expressão de p53 em estado estacionário, possivelmente devido ao estado da p53 mutante (Fig 5A, painel do meio). Finalmente, em células HEK293T, IQ3A não mostraram influência sobre a expressão da proteína p53, de acordo com a ausência de morte de células no ensaio de viabilidade (Fig 5A, painel da direita). Além disso, exploramos ainda mais a relevância da p53 no mecanismo de apoptose induzida por IQ3A, silenciando KRAS em HCT116 p53 do tipo selvagem (p53 (+ /+)) e nula (p53 (- /-)) linhas celulares isogénicas, e avaliar o seu impacto sobre a morte celular, e sobre a morte celular induzida por IQ3A (Fig 5B). Os nossos resultados mostram claramente que KRAS silenciamento induzido um nível mais elevado de morte celular em comparação com ARNsi de controlo (
P
0,05), e um nível mais elevado de morte celular induzida por p53 IQ3A em HCT116 (+ /+) comparado HCT116 à p53 (- /-) (
P
0,05 para 2a e 1a). Além disso, em células transfectadas ARNsi de controlo, todos IQ3A induzida significativamente um nível mais elevado de morte celular em p53 HCT116 (+ /+) comparado com p53 HCT116 (- /-) (
P
0,05). No entanto, em células mutante p53 SW620, compostos IQ3A não provocar significativamente a morte celular (Fig 3), nem eles aumentar a proteína p53 expressão steady-state (Fig 5). Em acordo, KRAS e /ou silenciamento HSP90 foram incapazes de induzir a morte celular nesta linha de células, ao passo que silenciamentos KRAS induziu um efeito dependente da dose na redução da proliferação de células SW620 (Fig S3). Colectivamente, estes dados confirmam ainda mais a importância de p53 para a indução de apoptose IQ3A.
A. morfologia nuclear e imagens representativas de HCT116 células de cancro de cólon humano e CCD18co fibroblastos de cólon humano após coloração Hoechst, avaliada por microscopia de fluorescência após 72 h de exposição para equitóxica (IC
50) concentrações de 5-FU, TMPyP4 e IQ3A ou DMSO (veículo controlo) com uma ampliação de 400x. Branco As setas indicam a fragmentação nuclear e a condensação da cromatina, e as populações de células apoptóticas B. goiaba obtido por citometria de fluxo nexina seguinte 72 h de incubação de células HCT116 e CCD18co com 5-FU, e TMPyP4 IQ3A em equitóxica (
50) concentrações IC, ou DMSO (controlo de veículo). Os resultados são expressos como a média percentual (%) de início (QID) e tardia (UR quadrante) células apoptóticas. Os resultados são expressos como média ± SEM de pelo menos três experiências independentes; * P 0,05 e §p 0,01 de DMSO (controlo do veículo); e † P 0,05 e P 0,01 a partir de 5-FU.
A. expressão da proteína p53 em estado estacionário avaliada por imunotransf erência em relação ao DMSO (controlo de veículo), após 72 h de exposição a concentrações equitóxica (IC
50) de 5-FU, e TMPyP4 IQ3A. B. As populações celulares obtidas por goiaba ViaCount citometria de fluxo seguintes 72 h de incubação de 5-FU, e TMPyP4 IQ3A em equitóxica (
50 IC), ou concentrações de DMSO (controlo de veículo), em p53 HCT116 (+ /+) e p53 (- /-) linhas celulares isog�nicas transfectadas com 40 nM siRNA KRAS ou controle de siRNA. Os resultados são expressos como média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. A. §p 0,01 de DMSO (controlo do veículo); e ‡ p 0,01 a partir de 5-FU. B. * p 0,05 de ARNsi de controlo em células p53 (+ /+); §p 0,05 de ARNsi de controlo de p53 (- /-) células; e † p 0,05 de siRNA KRAS em p53 células
Finalmente, a capacidade de compostos IQ3A para reprimir
KRAS
expressão foi avaliada pela quantificação de proteína KRAS (- – /). em linhas celulares de cancro. Desde IQ3As também têm mostrado ser eficazes estabilizadores de sequências G4 em HSP90 região promotora do oncogene (Tabela 1), também foi avaliada a expressão dessa proteína. Fig 6A mostra que ligantes G4 1a, 2a, 2d e TMPyP4 regulada a expressão de KRAS mutante por 35-60% em células HCT116 e SW620, com excepção da 2a (
p Art 0,01). Além disso, IQ3A também reduziu os níveis de proteína HSP90 estáveis, mas em menor grau, em relação ao KRAS. Portanto, o próximo investigaram a capacidade de compostos IQ3A para regular
KRAS
transcrição em células de câncer de cólon.
KRAS
níveis de estado estacionário de ARNm foram avaliados por RT-PCR após 72 h de incubação das células com os compostos nos seus IC
50 concentrações e comparado com o efeito de TMPyP4 em concentrações equitóxica. ligantes, tais como G4 TMPyP4 ter sido demonstrado que se ligam a estruturas de G4
KRAS e região do promotor e do 5′-UTR de
KRAS
ARNm, e também ambos reprimir a transcrição de genes e tradução [ ,,,0],13,19]. Figura 6B mostra que a 1a, 2a e 2d foram capazes de regular negativamente a transcrição KRAS até ca 40% em células HCT116, mas não de forma significativa em células SW620. Uma possível explicação é o ponto de tempo em que nós avaliamos
KRAS
mRNA e os níveis de estado estacionário de proteína. Após 72 h de exposição IQ3A, não pode já não ser repressão significativa de
KRAS
actividade de promotor na linha de células SW620, ao passo que os níveis de proteína permanecem reduzida como resultado de efeitos IQ3A acumulados. Além disso, TMPyP4 era incapaz de reduzir
KRAS
ARNm níveis de estado estacionário na linha de células HCT116, em contraste com uma redução de ca 80% dos niveis de estado estacionário de proteína (Fig 6A e 6B). Estes resultados estão de acordo com a capacidade relatada de TMPyP4 a acumular-se, preferencialmente, no citoplasma das células [19], onde ele pode inibir
KRAS
tradução do mRNA.
A. proteína KRAS e HSP90 expressão em estado estacionário avaliada por imunotransf erência em relação ao DMSO (controlo de veículo), após 72 h de exposição para equitóxica (IC
50) concentrações de 5-FU, TMPyP4 e tratamento IQ3A; B.
KRAS
expressão em estado estacionário de ARNm foi avaliada por Taqman em tempo real de RT-PCR utilizando ensaios Taqman específicos para KRAS e β-Actina para normalização.
KRAS
níveis de expressão em estado estacionário de ARNm foram calculados pelo método ΔΔCt, utilizando DMSO (controlo do veículo) para a calibração; e as células C. HEK293T foram co-transfectadas com vector pGL3-basic (controle do vetor vazio), ou com o
KRAS
repórter luciferase promotor construir PGL-Ras0.5 ou PGL-Ras2.0, juntamente com pRL- TK. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram novamente plaqueadas em placas de 96 poços, a 5.000 células por poço. Subsequentemente, 24 h após a replating, as células foram expostas a IC
50 equitóxica concentração dos compostos de teste IQ3A, TMPyP4 e veículo (DMSO); D. HCT116, células SW620 e HEK293T foram co-transfectadas com o vector pGL3-basic (controlo de vector vazio), ou com o repórter luciferase KRAS promotor construir PGL-Ras0.5, em conjunto com pRL-TK. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram novamente plaqueadas em placas de 96 poços, a 5000 células por poço e expostos a IC
50 equitóxica concentração de compostos de teste IQ3A, TMPyP4 e veículo (DMSO).
KRAS
níveis de actividade do promotor foram avaliadas pela Dual-Luciferase Assay 72 h (C.) ou 24 h (D.) após exposição ao composto. Os resultados são expressos como a razão sinal da luciferase do PGL-Ras2.0 ou PGL-Ras0.5 a células transfectadas vector pGL3-basic, após normalização com a luciferase da Renilla. Os resultados são expressos como média ± SEM de pelo menos três experiências independentes; * P 0,05 e §p 0,01 de DMSO (controlo do veículo); e † P 0,05 e P 0,01 a partir de 5-FU.
Para validar que o mecanismo da actividade anti-proliferativa e indução de apoptose por compostos IQ3A envolve repressão de
KRAS
a expressão do gene como um resultado de estabilização de sequências presentes no promotor G4-formação, os efeitos dos compostos sobre o
KRAS
promotor do gene foram avaliadas directamente por um ensaio de repórter de luciferase. Para este fim, utilizou-se duas construções de promotor tamanho diferentes que contêm a região do G4 do
KRAS
promotor do gene, clonado no pGL3 espinha dorsal básica: PGL-Ras0.5, PGL-Ras2.0 e pGL3 básico vazio (controlo negativo luciferase de pirilampo /sem promotor), co-transfectado juntamente com pRL-TK (transfecção eficiência normalização) em células HEK293T, como um controlo negativo G4. Esta construção não abriga sequências G4 e é insensível às relacionadas com o G4 /efeitos de regulamentação. Os nossos dados demonstram claramente que os compostos IQ3A, de forma semelhante ao TMPyP4, foram capazes de reduzir significativamente
KRAS
transcrição, sugerimos, interagindo com a região de G4 do
promotor do gene KRAS
, suprimindo Codificação- jusante expressão região de 40 a 60% em relação ao controlo DMSO (
P
0,01) (Figura 6C). Utilizando ambos os plasmídeos, com 500 e 2000 pb a montante do local de início da transcrição, que também mostram que a região alvo dos compostos IQ3A está dentro desta região, coincidindo, assim, com o polipurina-G rico Strand responsável pela montagem da estrutura G-quadruplex [12 ]. Importante, nós também foram capazes de mostrar que os compostos IQ3A, à semelhança do TMPyP4, foram capazes de reduzir significativamente
KRAS
atividade do promotor em células HCT116 e SW620 (Fig 6D).
Conclusões
têm investigado neste estudo, a capacidade de um grupo de 7-carboxilato de indolo [3,2
b
] quinolina tri-alquilamina derivados (IQ3A), que são estabilizadores potentes estruturas de ADN G4 presentes no
promotor KRAS
, para regular
KRAS
expressão e induzir a morte celular por apoptose, particularmente em linhas celulares de cancro do cólon dependente de KRAS. Os compostos mostraram IQ3A marcadamente actividade anti-proliferativa em um IC
50 gama inferior a 2,69 uM em células HCT116 e SW620. Particularmente, em células HCT116, compostos IQ3A no ic
65 concentração morte celular aumentada até 4,7 vezes (
P
0,01) e 2,4 vezes (
P
0,01) em comparação com DMSO ou com 5-FU, respectivamente. Além disso, em linhas de células não malignas, os compostos IQ3A não causou morte celular significativa. Além disso, eles marcadamente reduzida
KRAS
níveis de expressão de mRNA e proteína em células cancerígenas do cólon, possivelmente através de repressão da transcrição directa do
promotor KRAS
. Nossos dados até à data mostra uma relação correlativa entre a repressão da transcrição e de ligação à região do G4 dentro deste promotor, embora mais estudos são necessários a fim de demonstrar uma relação directa entre os dois. O efeito de repressão foi acompanhada por um aumento de proteína p53 níveis de estado estacionário em HCT116, e apenas uma pequena redução dos níveis de HSP90 nas três linhas celulares testadas, indicando que estes compostos não são também ter um efeito sobre alguns outros alvos G4 possíveis, tais como no o promotor de HSP90 [27]. Em vez disso, os compostos IQ3A são dirigidas seletivamente
KRAS
genes motorista nas linhas celulares de cancro do cólon. Colectivamente estes resultados mostram que os ligandos de ligação G4, como estes derivados indoloquinoline, potencial de exibição a ser empregues como novos agentes terapêuticos anti-cancro, especialmente para o tratamento de cancros humanos dirigidos por mutações KRAS, que ainda estão em grandes cancros parte de não satisfeitas alta clínica precisa.
Materiais e Métodos
Chemicals
7-carboxilato indolo [3,2
b
] quinolina tri-alquilamina derivados 1a-d e 2a-d (IQ3A) foram sintetizados tal como descrito no texto S1. 5-fluorouracilo (5-FU) e TMPyP4 foram adquiridos da Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA.
Sequências
Oligonucleótidos
Todos os oligonucleótidos foram adquiridos a partir de Eurofins MWG Síntese GmbH, Alemanha. Os oligonucleótidos marcados utilizados nos ensaios de FRET tivesse anexado o FAM fluoróforo dador (6-carboxif luoresceina) e o fluoróforo aceitador TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina): KRAS21R (5′-FAM-AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGA-TAMRA-3 ‘); HSP90A (5’-[FAM] -GGGCCAAAGGGAAGGGGTGGG- [TAMRA] -3 ‘); T-loop (5’-FAM-TATAGCTATATTTTTTTATAGCTATA-TAMRA-3 ‘). Cada oligonucleótido foi inicialmente diluído para uma solução de armazenamento a 100 uM em água livre de nuclease (não tratada com DEPC), adquirido a Applied Biosystems UK Ambion.
FRET fusão ensaio
A capacidade de IQ3A e TMPyP4 para estabilizar G-quadruplex e sequências de ADN duplex foi investigada utilizando o ensaio de uma transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET). Da solução das sequências de oligonucleótidos em 20 uM e diluições subsequentes foram obtidos a partir de soluções de armazenagem de diluição com tampão K-cacodilato pH = 7,4, contendo 60 mM de K
+ (cacodilato de potássio 10 mM, KCl 50 mM). As sequências de sondas de FRET foram diluídos a partir de estoque para a concentração correcta (0,4 uM) e, em seguida, recozida por aquecimento a 95 ° C durante 10 min, seguido de arrefecimento até à TA. Os compostos de teste foram preparados tal como a 1 mM em 10% de DMSO e 10% de HCl a 1 mM em água de grau HPLC. O resto das diluições foram realizadas utilizando tampão de FRET. DNA emparelhado (50 mL) e uma solução de composto (50 uL) foram distribuídos em placas de 96 poços de RT-PCR (BioRad; MJ Research, Waltham, MA, EUA). controles relevantes também foram realizados para verificar se há interferência com o ensaio. As leituras de fluorescência foram efectuadas com um motor Opticon DNA (MJ Research) com excitação a 450-495 nm e 515-545 nm, detecção a, tomadas em intervalos de 0,5 ° C na faixa de 30-100 ° C, com uma temperatura constante mantido durante 30 s antes de cada leitura para assegurar um valor estável. As experiências foram realizadas em triplicado. A análise final dos dados foi realizada com GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, Inc). A avançada função de ajuste de curvas em GraphPad Prism foi utilizado para o cálculo do Δ
T
m valores e desvios-padrão associados
.
cultura celular
SW620 células de adenocarcinoma colorretal humano (European Collection of Cell Cultures, ECACC, Porton Down, Wiltshire, Reino Unido), HEK293T células renais embrionárias humanas (ATCC, LGC Standards, UK) de células de carcinoma HCT116 do cólon humano (ECACC), HCT116 p53 (+ /+) e p53 (- /- células de cancro do cólon humano isogénicas (GRCF célula central e biorrepositório), da Universidade Johns Hopkins, School of Medicine, Baltimore, MD, EUA), foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal, e 1% de antibiótico /antimicótico (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), CCD18co fibroblastos de cólon humano (ATCC, CRL-1459) foram cultivadas em Meio Essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino , 1% de antibiótico /antimicótico, 2 mM de GlutaMax, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais (NEAA) (Invitrogen) e 0,57 mM de recombinante Humana TNF-α (Peprotech, EUA) e mantida a 37 ° C numa atmosfera humidificada de