Abstract

Recentemente, demonstramos que as células cancerosas que recuperam de danos apresentam aumento glicólise aeróbica, no entanto, a molecular mecanismo pelo qual as células cancerosas sobreviver a danos e mostram aumento da glicólise aeróbica continua a ser desconhecido. Aqui, demonstramos que diversas células cancerosas que sobrevivem hipóxica ou a proliferação celular rápida dano oxidativo show, e desenvolver tolerância a danos associados com o aumento da produção de sulfeto de hidrogênio (H

2S) que impulsiona aumento da regulação do visfatina (Nampt). Consistente com a existência de um H

2S-Nampt circuito energético, em danos recuperados células cancerosas, H

2S, Nampt e ATP exposição de produção uma correlação significativa. Além disso, o tratamento de células cancerosas com H

2S doador, NaHS, coordenadamente Nampt aumenta e os níveis de ATP, e protege as células de danos induzidos pela droga. A inibição da cistationina beta-sintase (CBS) ou cistationase (CTH), enzimas que levam geração de H

2S, diminui a produção de Nampt enquanto supressão de Nampt via pela FK866, diminui H

2S e os níveis de ATP. células recuperadas de danos isoladas a partir de tumores crescidos subcutaneamente em ratinhos atímicos também mostram o aumento da produção de H

2S, Nampt e os níveis de ATP, associada com o aumento da glicólise e de proliferação rápida. Em conjunto, estes dados mostram que após a recuperação do potencial dano letal, H

2S-Nampt dirige o gasto de energia e glicólise aeróbica em células de cancro, conduz ao seu crescimento exponencial, e provoca um elevado grau de tolerância aos danos. Identificação de H

2S-Nampt como uma via responsável para a indução de tolerância a danos nas células cancerosas podem estar subjacentes a resistência à terapia e oferece a oportunidade para alvejar esta via, como meio de tratamento de cancro

citação.: Sanokawa-Akakura R, Ostrakhovitch eA, Akakura S, Goodwin S, Tabibzadeh S (2014) AH

2S-Nampt Dependente Energética circuito é crítica para a sobrevivência e Citoproteção de danos em células cancerosas. PLoS ONE 9 (9): e108537. doi: 10.1371 /journal.pone.0108537

Autor: Stefan Strack, da Universidade de Iowa, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de maio de 2014; Aceito: 27 de agosto de 2014; Publicação: 23 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sanokawa-Akakura et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Nos últimos anos, tem sido demonstrado que gasotransmitters, óxido nítrico (NO), o monóxido de carbono (CO) e de sulfureto de hidrogénio (H

2S), desempenham um papel crítico em diversas funções fisiológicas, incluindo o tónus vascular, a defesa do hospedeiro contra agentes patogénicos, neuromodulação, apoptose, metabolismo de energia e em células de mamíferos [1]. Entre estas moléculas gasosas, H

2S é produzido durante o metabolismo de aminoácidos pelas vias trans-sulfuration e cisteína dessulfuração [2]. Endógena H

produção 2S é catalisada por três enzimas, cistationina beta-sintase (CBS), cistationase (CTH), também conhecidos como cistationina gama-liase e sulfurtransferase 3-mercaptopyruvate (MST) [3] – [5].

H

sub 2S funciona como um estimulador do bioenergética celular, contribui para o aumento da dependência de células cancerosas na via glicolítica para produção de ATP, e promove a angiogénese e citoprotecção [6] – [8]. H

2S protege as células do stress oxidativo [9], que podem afectar as respostas celulares à lesão [10], [11] e foi demonstrado que exibem ambos os efeitos pró-apoptóticos e anti-apoptóticos [12] – [14]. Embora alguns sugeriram que H

2S tem efeitos anti-câncer [15], outros relataram que promove a proliferação de células cancerígenas do cólon SW480 HCT116 e [16]. Fu

et al.

Mostrou que Ca

2 + causas estimulação aumento da expressão CTH e aumenta H

2S e produção de ATP [17]. Foi demonstrado que endógena H

produção 2S impulsionado por 3-MST complementa e equilibra os bioenergética celular e mantém o fluxo de elétrons na mitocôndria [18]. células cancerosas do cólon têm sido mostrados para expor-se-regulado a expressão de CBS e aumento da formação de H

2S, que dirige a proliferação celular e angiogénese no cancro do cólon [6].

Sabe-se que as células de tumor pode recuperar de potencial dano letal induzido por hipoxia, acidose, ou por radiação e tratamento com drogas [19] – [22]. Nós informou recentemente que as células cancerígenas que se recuperar de danos induzidos pela hipóxia, acidose e glicose privação show de remodelação mitocondrial, aumento da glicólise aeróbica, e apresentam uma alta taxa de produção de ATP [23]. Neste estudo, exploramos a função de H

2S no processo de recuperação das células cancerosas de danos. células cancerosas danificadas esgotar seu suprimento de energia devido a mecanismos de reparação. Ambos ATP e NAD

+ (nicotinamida adenina) são as principais fontes de energia. visfatina (Nampt), uma enzima necessária para NAD via de salvamento sintéticos [24], é essencial para a manutenção do fornecimento de energia celular. Portanto, nós examinamos o papel da Nampt em conjunto com H

2S em células cancerosas que recuperam de danos. Nós demonstramos que H

2S controla a recuperação das células cancerosas de danos através da regulação Nampt mudança dirigida no gasto de energia, o que impulsiona a adoção da glicólise aeróbica e aumento da ATP e NAD

+ síntese. A interacção de H

2S Nampt e confere as células cancerosas uma elevada taxa de proliferação e um elevado grau de tolerância aos danos.

Materiais e Métodos

Materiais

H

2O

2, NaHS, bleomicina,

O

– (carboximetil) hidroxilamina hemi-hidrocloreto de (CHH) DL-propargilglicina (PAG) e FK866 foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Os anticorpos contra o CBS (A-2), CTH (L-1) e β-Actina (C-2) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra Nampt (visfatina, PBEF) e Bax foram adquiridos a Abcam (Cambridge, MA). Anticorpo contra γ-H2AX foi adquirido a partir da Millipore (Billerica, MA). anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram adquiridos a Jackson ImmunoResearch Laboratories (Baltimore, PA).

cultura celular

HepG2, MDA-MB-231 e MDA-MB-435S foram obtidas de ATCC ( Manassas, VA), cultivadas em DMEM com glutamina 2 mM, glucose 25 mM e soro bovino fetal a 10%, em 37 ° C incubadora com 5% de CO

2. Danos foi induzida em células cancerosas por hipoxia, privação de glicose e água oxigenada. Para a indução de hipoxia (DR

H), as células foram incubadas durante 18 horas em 1% de O

2. Para a privação de glicose (DR

G-), as células foram cultivadas durante 18 horas num meio sem glucose na presença de 5% de CO

2. Para a indução de dano por peróxido de hidrogênio (DR

H2O2), as células foram tratadas com 800? M H

2O

2 para 3 horas.

Experiências com animais

Animal Care e todos os procedimentos foram realizados após a aprovação dos Comitês de cuidados com animais institucionais da Universidade da Califórnia, Irvine (protocolo nº 2012-3042). Oito semanas de idade, ratinhos macho nu atímicos (nu /nu) (n = 10) foram adquiridos a Charles River Laboratories (San Diego, CA). Os ratinhos foram anestesiados por inalação de isoflurano antes da injecção de células tumorais. Cada ratinho recebeu uma × 10

5 células tumorais num volume total de 100 ul subcutaneamente em quatro locais nas áreas de flanco mid-abdominais e inferior. Os ratinhos foram monitorizados 2 vezes por semana durante a experiência de crescimento do tumor. Vinte dias após a injecção das células, os murganhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono quando os tumores cresceram até o tamanho de 10-15 mm de diâmetro. Os tumores foram removidos para o isolamento das células cancerosas viáveis ​​(T

V) ou danos células de

in vivo

tumor cresceu (T

DR).

Medição do H

produção 2S em extra e intra-células

Medição da extracelular H

nível 2S foi realizada utilizando Analyzer Free Radical (TBR4100 e ISO-H2S-2, Instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL) seguindo as instruções do fabricante . Resumidamente, o número de células foi ajustado a 1 × 10

6 células viáveis ​​em PBS e as suspensões de células foram incubadas a 37 ° C durante 1 h. As células foram então centrifugadas e os sobrenadantes foram submetidas a medições. Antes de cada medição, o sensor foi polarizado e calibrada pela adição de quatro alíquotas da Na

2S solução estoque em concentrações finais de 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 uM. Detecção de intracelular H

2S foi realizada por H

2S sonda fluorescente HSN2 (a simpática oferta do Professor Michael D. Pluth, da Universidade de Oregon, Departamento de Química, Eugene, Oregon).

Whole extracção de proteína celular e Western blotting

proteínas de células foram extraídas em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 2 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 1 mM na

3VO

4, NaF 50 mM e inibidor de protease de cocktail). medições de proteína foram realizadas pelo ensaio de proteína Bio-Rad com base no método de Bradford de ligação de corante (Bio-Rad Lab, Hercules, CA).

bandas blot foram detectados por quimioluminescência ECL melhorada (Amersham ECL Além disso Ocidental Blotting Detection Reagentes GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) usando C-Digit digital Imager (LI-COR, Lincoln, NE) e análise de densitometria foi realizada utilizando software análise myImage (Thermo Scientific). β-actina serviu como um controlo de carregamento.

A viabilidade celular medida

número relativo de células foi medido pelo ensaio de XTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As células foram incubadas com XTT e metossulfato de fenazina (PMS), a 37 ° C durante 2 h e a absorvância foi lida a 450 e 650 nm como uma referência.

Inverter reacção de polimerase em cadeia (PCR) e PCR quantitativa ( qPCR)

O ARN total foi isolado utilizando o kit de ARN total GenElute Mammalian Miniprep (Siγma-Aldrich, St. Louis, MO). A transcrição reversa foi realizada utilizando High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). RT-PCR foi realizada utilizando os primers específicos para a CBS humana (forward: GAACCAGACGGAGCAGACAA; inverso: GTCGCTCAGGAACTTGGTCA), para o CTH humana (forward: AAAGACGCCTCCTCACAAGG; reversa: AAGGCAATTCCTAGTGGGATTTC) e para o MTS humana (forward: CGCCGTGTCACTGCTTGAT; reversa: CAGGTTCAATGCCGTCTCG ). A expressão de genes foi avaliada por PCR utilizando

Taq

5 × Mistura Principal (New England Biolabs. Ipswich, MA) com um passo inicial de desnaturação a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos, com cada um a 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, e 68 ° C durante 1 min.

a avaliação quantitativa foi realizada usando software de análise myImage (Thermo Scientific, New Hampshire). Para a normalização dos dados,

β-actina

foi amplificado com primers específicos (para a frente: AAGCCACCCCACTTCTCTCT; reversa: GAGACCAAAAGCCTTCATACATCT). qPCR foi realizado utilizando o kit Quanti Tect SYBR Green PCR. qPCR foi realizada utilizando os primers específicos para a NAMPT humana (forward: ATC CTG TTC CAG GCT ATT CTG; inverso: CCC CAT ATT TTC TCA CAC GCA T).

XF (fluxo extracelular) análise bioenergética

XF24 extracelular Flux Analyzer a partir Seahorse Bioscience (N. Billerica, MA) foi utilizado para análise bioenergética líquido extracelular [25]. Sob típica

in vitro

condições de cultura celular, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é uma contribuição de produção de ácido láctico gerado pela glicólise. Para examinar a glicólise aeróbica, cinco culturas réplica biológicos de controlo (3 × 10

4) e cinco células DR gerados independentemente, (3 × 10

4) foram semeadas em cada poço da placa de cultura de XF 24 e as células eram incubadas durante a noite a 37 ° C na presença de 5% de CO

2. Todas as culturas foram examinadas em meios XFAssay na ausência de CO

2. Nível de ECAR foi normalizado para o teor de proteína.

A determinação quantitativa de Nampt, ATP e NAD

+ /NADH

níveis intracelulares Nampt foram medidos usando um visfatina C-terminal (Humana) EIA kit (farmacêuticos Phoenix, Belmont, CA, EUA). os níveis de ATP em células foi ensaiada utilizando o kit ATP Bioluminescent Somatic cell assay (empresa FLASC, Sigma-Aldrich) e estojo de ensaio colorimétrico de ATP (Abcam, Cambridge, MA) de acordo com as instruções do fabricante. NAD níveis

+ /NADH foram medidos utilizando NAD

+ ensaio /NADH kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan e Bio Ensaio Systems, Hayward CA) seguindo as instruções do fabricante. Níveis de Nampt, ATP e NAD

+ /NADH foram normalizados para o teor de proteína.

Estatísticas

Todos os ensaios foram realizados em 3-6 replica em pelo menos três experiências independentes. Os dados são apresentados como média ± EPM (erro padrão da média).

P

valores foram determinados pela comparação dos dados da experimental contra as células de controlo a partir de pelo menos três experiências independentes ou seis repetições da mesma experiência. Meios e

P valores Compra de dados experimentais foram analisados ​​por sujeitando os dados para o teste t de duas caudas. Dados que envolvem mais de dois grupos foram acessados ​​por one-way ANOVA com teste de Bonferroni para análise post hoc.

p

valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

p

Valores são mostrados como 0,05 (*), 0,005 (**) ou . 0,0005 (***)

Resultados

A geração de H

2S aumenta em resposta ao estresse

em contraste com relatórios anteriores em que H

2S foi medido em lisado celular, utilizou-H

eletrodo 2S-sensível para medir a liberação de H

2S a partir de células intactas. Descobrimos que a quantidade de H

2S libertados a partir de células foi significativamente maior do que a medida em extractos de células homogeneizadas (dados não mostrados). Em comparação com os níveis de H

2S libertado a partir de células 293 e fibroblastos, células cancerosas (células HepG2, MDA-MB-231, MDA-MB-435S) produziram significativamente mais H

2S (Figura 1A). Nós submetido células cancerosas epiteliais de diferentes origens (fígado, mama e melanócitos) para as duras condições que existem no microambiente do tumor, o que todos levam a danos celulares, incluindo a hipóxia (

H), privação de glicose (

G-) e peróxido de hidrogênio (

H2O2). O H

2S geração foi aumentada em células do cancro em resposta ao stress aguda, tais como a hipoxia, a bleomicina, o peróxido de hidrogénio e privação de glicose (Figura 1B). aumento relacionado estresse em H

2S lançado a partir de células de câncer foi associado com o aumento da cistationina beta-sintase (CBS), uma das enzimas que impulsiona H

produção 2S, concomitante com aumento do estresse e Bax e γH2AX relacionados com a apoptose , o que é um factor crítico do S /L

2-ADN danos complexo do ponto de verificação (Figura 1C, D). Curiosamente, estresse induzido elevação H

produção 2S correlacionados com a gravidade da lesão (Figura 1E).

(A) Quantidade de H

2S liberada pelas células 293, fibroblastos (fibro.), HepG2, MDA-MB-231 e MDA-MB-435S células. (B) Os níveis de H

2S em HepG2, células MDA-MB-435S Pc MDA-MB-231 e submetidos à hipóxia (0,5% O

2, 18 horas), a privação de glicose (meio de glicose livre, 18 horas) ou tratamento com bleomicina (35 nM, 18 h), H

2O

2 (800 mM, 3 h). Os dados são expressos como percentagem de H

2S libertados a partir de células não tratadas. células (C) intracelular CBS e Bax (painel esquerdo) avaliada por análise western blot em células MDA-MB-435S PC e do PC tratados com 400 ou 800? M de H

2O

2 para 3 horas. (D) O nível de CBS e γH2AX com ou sem tratamento com H

2O

2 (800 mM, 3 h) em células MDA-MB-435S. densidade de proteína foi normalizada utilizando β-actina. (E) O valor de H

2S e a viabilidade das células após o tratamento com uma gama de concentração de H

2O

2. *;

p Art 0,05, **;

p Art 0,005, ***;

p

. 0,0005

O aumento da geração de H

2S em células-recuperado de danos aumenta a tolerância aos danos

O regime em mostras Figura 2A o método que foi utilizado para gerar o dano recuperado células cancerosas. Dentro de 24 horas após a lesão, poucas células viáveis ​​permaneceu ligado ao frasco de cultura, enquanto maioria das células separado da superfície da cultura. células destacadas danificados apresentam um nível elevado de H

2S susceptível de limitar a lesão e pode melhorar a sobrevivência potencial (Figura S1). Para remover as células mitóticas, que células cultivadas em novos recipientes de cultura durante 24 h. Para isolar as células danificadas que não conseguiram ligar-se a recipientes de cultura, mas tinha o potencial de recuperar de danos, que transferido para células de cultura de novos vasos flutuante para permitir que as células que se recuperam de se ligarem aos substratos de cultura. Serial passagens semanais de células flutuante para novos recipientes de cultura permitiu o isolamento de células de danos com o tempo de recuperação diferente recuperado. Ao longo deste trabalho, nós nos referimos a essas células como células-recuperado de danos (RD) com o tempo de recuperação indicada de um (DR

W1), dois (DR

W2) ou três semanas (DR

W3) de danos, ao mesmo tempo que se referem às células de controlo parental como PC células (Figura 2A). Este método permitiu-nos separar três populações de células que reflectem o período de tempo necessário para a recuperação. A fim de avaliar se as células DR isolados recuperados de danos, que examinaram a expressão da molécula do pró-apoptótica, Bax. células DR mostrou uma diminuição na expressão do Bax de uma forma dependente o tempo de recuperação como uma indicação de reparação, enquanto que, como previsto, as células PC expostas a H

2O

2 durante 3 horas (danos agudos) expressa um elevado nível de Bax (Figura 2B). Além disso, as células cancerosas recuperados a partir de danos também apresentaram um aumento da produção de H

2S, em comparação com as células PC intactas de uma forma dependente o tempo de recuperação (Figura 2C, D). Desde o sulfeto de hidrogênio endógena é gerado por três enzimas, CBS, CTH e MST, examinamos de mRNA e proteína níveis destas enzimas em células PC e DR. Tal como mostrado na Figura 2E, os níveis de ARNm de CBS e CTH aumentada nas células DR também de uma forma dependente o tempo de recuperação. No entanto, o MST estava ausente em células PC ou DR. Em comparação com células PC não danificadas parentais, as células cancerosas recuperados de danos tinha aumentado proteínas CBS e CTH em correlação direta com o período de recuperação. Entre as células DR, essas células com um tempo de recuperação de danos mostram o maior aumento da regulação da CBS e CTH (Figura 2F). CBS foi regulado para cima até duas vezes após a recuperação de lesão induzida por privação de glucose, hipoxia e peróxido de hidrogénio (Figura 2G). Em comparação com células PC, células DR gerando níveis mais elevados de H

2S tinha uma taxa de proliferação mais elevada e mostrou um nível mais alto de tolerância a danos induzidos por bleomicina (Figura 2H, I). Estes resultados mostram que, em células recuperados de lesão, H

produção 2S pode desempenhar um papel na sua maior tolerância ao dano.

(A) Um regime de isolamento de células-recuperado de Danos (RD). (B) a expressão Bax em H

2O

2 tratados

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2 Pc, DR

H2O2 W1, DR. (C) Quantidade de H

2S divulgados pelo DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2. Significância entre PC e três células DR era

p Art 0,0005 na análise estatística ANOVA. (D) H

coloração 2S de Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2 com 5 � H

2S sonda fluorescente, HSN2. As barras de escala, 50 | im. análise (E) PCR de

CBS

,

CTH

e

MTS

genes em Pc, DR

H2O2 W1 e DR

células H2O2 W3 HepG2. (F) Análise Western blot da CBS e CTH no Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2. (G) análise de Western blot da CBS no PC e DR

H2O2 W1, DR

H W1 e DR

células G W1 HepG2. (H) Proliferação de HepG2 recuperado de H células

2O

2, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 como uma porcentagem do que em células PC. (I) Viabilidade de Pc, DR

células H2O2 W1 e DR

H2O2 W2 HepG2 com e sem tratamento com bleomicina. *;

p Art 0,05, **;

p Art 0,005, ***;

p

. 0,0005

células DR apresentam maior glicólise e bioenergética celular reforçada

Como as células que se dividem rapidamente adotar glicólise aeróbica para promover um aumento da biomassa seguido por celular divisão, examinou-se o nível de intermediários chave e enzimas glicolíticas em células recuperadas a partir de danos. células DR mostrou uma elevada taxa de acidificação extracelular (ECAR), que é um indicador de nível de glicólise (Figura 3A). células DR gerando níveis elevados de H

2S teve um melhor perfil bioenergética tal como evidenciado pelo aumento do nível de ATP celular (Figura 3B).

(A) ECAR em células PC HepG2 tratadas com ou sem 800 uM de

células 2O

2 e DR

H2O2 W2 HepG2 H. (B) os níveis de ATP em Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2. Significância entre PC e três células DR era

p Art 0,005 na análise estatística ANOVA. (C) NAD

+ níveis em Pc HepG2 (com ou sem H

2O

2), DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2. NAD

+ foram normalizados para o nível de proteína total. Significância entre PC e há células DR era

p Art 0,005 na análise estatística ANOVA. (D) NAD

+ níveis no PC e DR

células H W1 HepG2. (E) a análise Western blot de intracelular Nampt e CBS no PC e DR

H2O2 células MDA-MB-231. níveis (F) Nampt avaliadas por ELISA em Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2. Significância entre PC e três células DR era

p Art 0,05 em análise estatística ANOVA. (G) Correlação entre a expressão Nampt e produção de H

2S e do nível de ATP no Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2. Significado do H

2S e Nampt era

p Art 0,05, eo significado da ATP e Nampt era

p Art 0,05 em análise estatística ANOVA. *;

p Art 0,05, **;

p Art 0,005, ***;

p

. 0,0005

A fim de resolver se a supressão da glicólise atenua H

produção 2S, medimos H

nível 2S em células DR tratado com HK1 inibidor, 100 pM de ácido bromopirúvico, ou inibidores de LDH-A, oxamato de sódio 1 mM, durante 15 h. Como mostrado na Figura S2, não houve diferença estatisticamente significativa no nível de H

2S após o tratamento com ácido bromopirúvico ou oxamato de sódio, enquanto que, como esperado, a actividade glicolítica foi substancialmente diminuída por ambos os inibidores. Estes dados indicam que as enzimas glicolíticas não regulam H

Circuito de 2S-Nampt.

Células recuperados de danos fortemente invocado glicólise que o aumento da demanda por NADH /NAD

+. Portanto, como uma medida do estado bioenergético, avaliamos os níveis de NAD

+ e NADH. Embora o dano agudo levou a uma diminuição do nível de NAD

+, NAD

+ foi significativamente aumentada em células de cancro que recuperaram de danos induzidos por H

2O

2 e hipoxia (Figura 3C, D ; Figura S3). Reduzido forma de NAD

+, NADH, foi significativamente aumentada em células DR (Figura S4).

Nampt, o que é necessário para NAD

+ via de salvamento sintética [24], foi significativamente aumentada em cima recuperação em células DR e este aumento coincidiu com aumento da regulação do H

2S gerando CBS (Figura 3E). As células DR com tempo de recuperação de danos mostraram o maior aumento na Nampt (Figura 3F). Além disso, descobrimos que os níveis Nampt correlacionada tanto com o nível de H

2S liberados a partir de células (R

2 = 0,9,

p Art 0,05) e o nível intracelular de ATP (R

2 = 0,94,

p

. 0,05) (Figura 3G)

em conjunto, estes resultados mostram que as células cancerosas recuperados de danos gerar um alto nível de H

2S e Nampt, e que elas são fortemente dependentes da produção de H

2S e glicólise aeróbica para o seu metabolismo eficiente.

H

2S, de uma forma dependente da dose, up-regula Nampt, aumentos glicólise aeróbica e oferece citoproteção

Para avaliar ainda mais a importância do H

2S na aquisição de novas características metabólicas, as células PC foram tratados com H

2S doador, NaHS. Semelhante a nossas observações em células DR (Figura 3A), o tratamento com NaHS ECAR em uma maneira dependente da dose melhoradas, aumento da ATP e NAD

+ saída e levou a aumento significativo no nível de Nampt (Figura 4A-F). Consistente com relatórios anteriores que mostram que H

2S proporciona citoprotecção [8], [26], células PC pré-tratados com NaHS exibiu uma maior resistência ao dano induzido pelo peróxido de hidrogénio ou qualquer bleomicina (Figura 4G).

(a) ECAR em células PC HepG2 tratadas durante 48 h com 0, 1, e 100 ^ M de NaHS e DR

H W1 células HepG2. (B) A comparação dos níveis de ATP em células PC HepG2 tratadas durante 48 h com 0, 10 e 100 uM de NaHS, DR

células H2O2 W1 HepG2 e PC MDA MB-231 células tratadas durante 48 h com 0, 10 e 100 uM de NaHS. Os dados são expressos como uma percentagem do nível de ATP em células não tratadas. (C) Os níveis de NAD

+ em células HepG2 e MDA-MB-231 PC tratadas com 0, 10, e 100 uM de NaHS durante 48 h. (D) Análise de transferência de Western de Nampt intracelular em células MDA-MB-231 PC tratadas durante 48 h com 0 e 100 | iM de NaHS. análise (E) qPCR de

expressão NAMPT

em células Pc HepG2 tratadas durante 48 horas com 0 e 100? M de NaHS. (F) A determinação quantitativa de Nampt intracelular por meio de ELISA em células PC HepG2 tratadas durante 48 h com 0, 10 e 100 uM de NaHS. (L) a viabilidade em células HepG2 pré-tratado durante 24 h com 0, 1, e 10 mM de NaHS e, em seguida, submetido a H

2O

2 (800 uM) ou bleomicina (35 nM, 18 h). A viabilidade foi avaliada por exclusão de azul de tripano. *;

p Art 0,05, **;

p Art 0,005, ***;

p

. 0,0005

Em conjunto, os nossos resultados mostram que o aumento da regulação do H

2S e Nampt levando a glicólise e bioenergéticos mudanças são mecanismos importantes no desenvolvimento de resistência aos medicamentos e sobrevivência das células cancerosas.

H

2S-Nampt via regula bioenergética em células DR

para aprofundar a relação entre

produção 2S, células DR Nampt e H foram tratados com um inibidor de Nampt, FK866. O tratamento de células com 200 nM de FK866 não afectou a viabilidade celular, indicando a ausência de FK866 citotoxicidade a esta dose em HepG2 (Figura S5). Supressão de Nampt pelo seu inibidor, FK866, bem como a inibição de CTH por D, L-propargilglicina (PAG), levou à diminuição H

2S produção (Figura 5A). Consistente com essa alteração em H

2S produção, a expressão de ambos CBS e HCT foi atenuada por tratamento de células com FK866 (Figura 5B, C). O nível de ATP também foi significativamente reduzida por tratamento de células DR com PAG e FK866 (Figura 5D, E). Esta redução do ATP foi consistente com o estudo anterior que mostra que a inibição da Nampt por FK866, suprime a produção de ATP em células de cancro do ovário [27]. Curiosamente, o tratamento de células DR com inibidor da CBS (CHH) e inibidor da CTH (PAG) reduziu Nampt (Figura 5F). Estes dados sugerem que Nampt pode funcionar como um estimulador de H

2S-producting enzimas e assim a produção de H

2S, enquanto H

2S provoca aumento da regulação do Nampt.

(A ) Quantidade de H

2S libertados de DR

células H W1 HepG2 tratadas com inibidor de CTH, PAG (100? M, 18 h), e inibidor Nampt, FK866 (200 nM, 24 h). (B) Análise de transferência de Western de CBS em células DR na ausência e na presença de FK866 (200 nM, 24 h). (C) análise de transferência de Western de células CTH na DR na ausência e na presença de FK866 (200 nM, 24 h). (D) os níveis de ATP na RD

H2O2 W3 células HepG2 na ausência (-) e presença (+) de PAG (100 uM, 18 hr). níveis (E) ATP em Pc, DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2 na ausência e presença de FK866 (200 nm, 24 h). (F) a análise Western blot de Nampt no DR

H2O2 W2 e DR

células H2O2 W3 HepG2 tratadas com inibidor da CBS, CHH (500? M, 18 h) ou inibidor de CTH, PAG (100? M, 18 h). *;

p Art 0,05, **;

p Art 0,005, ***;

p

. 0,0005

No seu conjunto, os nossos resultados mostram que o aumento da regulação do H

2S e Nampt e sua crosstalk melhorar a eficiência bioenergética e facilitar a recuperação de danos.

a acumulação de H

2S leva a uma maior glicólise, melhores bioenergética e aumento da proliferação em danos recuperados células cancerosas isoladas a partir de

In vivo

tumores cultivados

para identificar se as células semelhante ao

in vitro

existem células DR gerados ou pode ser gerado em tumores, células cancerosas epiteliais foram inoculados em ratinhos nus atímicos. Nós isolado células viáveis ​​de câncer (T

V) e (T

DR) células danos recuperado, conforme descrito em nosso estudo anterior [23]. T

células DR isolados de

In vivo

tumores gerados mostrou a acumulação de H

2S, bem como o aumento da expressão da CBS e CTH (Figura 6A, B). Similar ao

in vitro

dados, os níveis de NAD

+ e Nampt foram aumentados em T

células DR, em comparação com os níveis detectados em PC e T

células V (Figura 6C, D). ECAR foi aumentada no t

células DR e estas células mostraram um melhor perfil bioenergética tal como evidenciado pelo aumento do nível de ATP e uma maior taxa de proliferação (Figura 6E-G).

(a) H

níveis 2S em células DR T

isolados de tumores HepG2 T

V e cresceu

in vivo

. (B) Expressão da CBS e CTH em T

V e T

células DR. (C) NAD

+ níveis em T

T

células DR isolados de tumores HepG2 V e cresceu

in vivo

. (D) os níveis Nampt em T

T

células DR isolados de tumores HepG2 V e cresceu

in vivo

. (E) ECAR em T

T

células DR isolados de tumores HepG2 V e cresceu

in vivo

expressa como a porcentagem do nível ECAR em Pc. (F) o nível de ATP em células tumorais viáveis ​​(T

V) isolado a partir de tumores de HepG2 cultivadas

In vivo

expressos como a percentagem do nível de ATP em PC. (G) A proliferação de células T DR

isolados de tumores HepG2 T

V e cresceu

in vivo

expressa como a percentagem da proliferação de Pc. As células foram semeadas a uma concentração de 2 x 10

4 e o número total de células foi avaliada após 24 e 48 h de cultura. (H) Um esquema para H

2S-Nampt circuito bioenergética dependente. dano celular leva ao aumento do H

2S e Nampt que coordenadamente levar a alterações metabólicas. Estas células exibem crescimento exponencial e tolerância aos danos. *;

p Art 0,05, **;

p Art 0,005, ***;

p

. 0,0005

Com base nestes resultados, propomos um esquema em que as células cancerosas recuperados de danos mudar seu perfil metabólico através de aumento da regulação do H

2S- via Nampt (Figura 6H). Assim, H

2S-Nampt circuito energético dependente é um regulador crítico da tolerância ao estresse, aumento da glicólise, bioenergética melhorados e aumento da proliferação celular.

Discussão

A produção endógena de H

2S é altamente regulados positivamente em células de cancro colo-rectal e da próstata epiteliais e nas células endoteliais derivadas de tumores [28], [29]. Em linha com esta evidência, mostramos que as células cancerosas epiteliais (fígado, mama, pele) innately produzir grandes quantidades de sulfeto de hidrogênio independente da sua origem. H

2S é aumentada ainda mais em células cancerosas a um dano agudo induzido por hipoxia, peróxido de hidrogênio e bleomicina, ou após a recuperação de danos como resultado do aumento da expressão de H

2S produtoras de enzimas,

CBS

e

CTH

.

p Art 0,05, **;