Abstract

são inerentemente heterogênea e muitas vezes apresentam adesão reduzida, resultando em o derramamento de células tumorais para a circulação para formar células tumorais circulantes (CTCs). Uma fração destes são CTCs ao vivo com potencial de colonização metastática, enquanto outros estão em vários estágios de apoptose tornando-os propensos a ser menos relevante para a compreensão da doença. Isolamento e caracterização de CTCs ao vivo pode aumentar dados apurados por enumeração padrão para ajudar os médicos para estabelecer com mais precisão do diagnóstico, escolher terapia, monitorar a resposta e oferecer um prognóstico. Nós relatado anteriormente em um grupo de infravermelho próximo corantes (NIR) heptamethine carbocianina que são especificamente e ativamente transportada para as células vivas de câncer. Neste estudo, esse comportamento específico de células tumorais viáveis ​​foi utilizado para detectar CTC vivo em doentes com cancro da próstata. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) a partir de 40 pacientes com cancro da próstata localizado em conjunto com 5 doentes com doença metastática foram coradas com IR-783, o protótipo de corante de cianina heptamethine. As células coradas foram submetidas a análise citométrica de fluxo para identificar vivo (NIR

+) CTC a partir do conjunto dos CTC total, que foram identificadas por coloração EpCAM. Em pacientes com tumor localizado, a contagem CTC ao vivo correspondeu com o total de números de CTC. Maiores contagens CTC vivos foram vistos em pacientes com tumores maiores e aqueles com características patológicas mais agressivas, incluindo margens positivas e /ou invasão de linfonodos. números ainda mais elevados do CTC (vivos e totais) foram detectados em pacientes com doença metastática. contagens vivo CTC diminuiu quando os pacientes estavam a receber tratamentos eficazes, e por outro lado as contagens tendem a subir no momento da progressão da doença. Nosso estudo demonstra a viabilidade da aplicação desta técnica de coloração para identificar CTCs ao vivo, criando uma oportunidade para mais interrogatórios molecular de uma população CTC biologicamente mais relevantes

Citation:. Shao C, Liao CP, Hu P, Chu CY , Zhang L, Bui MHT, et ai. (2014) Detecção de US Jogos de circulação Células Tumorais por uma classe de infravermelho próximo Heptamethine carbocianina Corantes em Pacientes com localizado e metastático cancro da próstata. PLoS ONE 9 (2): e88967. doi: 10.1371 /journal.pone.0088967

editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria

Recebido: 19 de setembro, 2013; Aceito: 14 de janeiro de 2014; Publicação: 14 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação da Fundação do cancro da próstata, Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer (2PO1CA098912 e 1RO1CA122602) e do Conselho de Governadores Cancer Research Chair (LWKC) e pelo Programa de Cooperação Internacional em Ciência e Tecnologia da China (Sem . 2011DFA33110). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os tumores sólidos estão em um estado constante de evolução com a heterogeneidade progressiva [1], [2]. O processo de progressão metastática é acompanhada por várias alternâncias fenotípicas que resultam na diminuição da adesividade e aumento da motilidade celular, entre outras alterações [3]. Algumas células cancerosas com motilidade têm a capacidade de difundir para locais distantes através dos canais e da vasculatura linfática e invadir o tecido que conduz à formação de uma lesão metastática [4]. células tumorais circulantes (CTCs) formam assim uma ligação chave entre os tumores primários e as suas metástases distantes, demarcando irreversível progressão da doença. Isolamento e caracterização dessas células cancerosas vivas e activos podem melhorar o prognóstico da doença, como já foi demonstrado em cancro da próstata (CaP) [5].

O derramamento de CTC é um processo dinâmico que ocorre com o primário e metastático tumores. O facto de as células tumorais disseminadas pode ser detectada no sangue de pacientes com CaP após a prostatectomia [6] sugere que CTC pode ser eliminado a partir de qualquer tumor residual no leito da próstata ou a partir de depósitos metastáticos. Estudo molecular destas células pode proporcionar informação em tempo real sobre o estado de progressão maligna. Como a coleção de CTCs normalmente requer baixo volume phlebotomy padrão, alguns propuseram que CTCs podem ser explorados como um tecido substituto ideal ou biópsia líquida para avaliar o estado da doença [7]. Essa fonte de tecido forneceria uma fonte de tecido simples, minimamente invasivo, que pode ser acessado em série para proporcionar uma definição temporal, alta da evolução da doença subjacente.

O valor preditivo das CTCs depende de avanços técnicos para permitir confiável detecção e isolamento. CTC constituem apenas uma pequena fracção de células mononucleares do sangue periférico (PMBC). Muitas novas tecnologias estão actualmente a ser testados para detecção e isolamento [8] CTC. A estratégia mais comumente empregue depende de marcadores específicos de linhagem, tais como epiteliais EpCAM [9] ou em diferenças de tamanho em relação aos PBMC [10]. O único ensaio de CTC aprovado pela FDA utiliza uma técnica de separação imunomagnética com base na expressão de marcadores de superfície epitheial [11], [12]. A relativamente baixa sensibilidade do ensaio, juntamente com a necessidade de pré-fixação faz com que os isolados inapropriados para análise molecular para além de imunofluorescência. A dependência de expressão do marcador de não permitir a detecção global da piscina CTC heterogénea. Sabe-se também que nem todos os CTC vai resultar em uma nova lesão metastática. A piscina de CTC é composto de células e passantes vivos e metástase activamente que são passivamente derramado na circulação [5], [13] – [15], em combinação com resíduos de apoptose de células de tumor [16] – [18]. São necessárias estratégias alternativas de detecção de CTC, para isolar a fração metástase, que é mais provável de ser encontrado na piscina CTC ao vivo.

Para desenvolver um método de baixo custo para identificar CTCs ao vivo, foi estudada a possibilidade de utilizar um grupo de infravermelho próximo (NIR) corantes heptamethine carbocianina sintéticos. Temos demonstrado anteriormente que estes corantes orgânicos são especificamente transportada para as células tumorais e pode distinguir maligna de células não malignas em modelos de xenotransplante ou tumores espontâneos

in vivo, Comprar e em amostras de tumor cirúrgicos

in vivo

ou

ex vivo

[19], [20]. Estes corantes são absorvidos e acumulados pelas células cancerosas através de um sistema independente de transporte ativo do marcador superfície epitelial convencionalmente utilizados (EpCAM). Além disso, a absorção do corante requer o transporte activo (accionada pelo ATP) e, assim, podem ser vistos como um ensaio funcional para a viabilidade de células tumorais. Os resultados do presente estudo sugerem que a RI-783, o protótipo deste grupo de corantes NIR seleccionados, podem ser incorporados em vários protocolos de detecção para identificar CTC vivo. Estes CTC vivo podia ser isolado a partir de doentes com cancro antes e durante a intervenção terapêutica dado os meios relativamente não invasivos de aquisição. Além disso interrogatório molecular poderia, então, seguir-se mesmo ao nível de uma única célula [21].

Materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

fluoresceína isotiocianato (FITC) monoclonal -conjugated de anticorpos (mAb) para o EpCAM humano (clone 9C4) e ficoeritrina (PE) de mAb de rato -conjugated a CD45, purificada, juntamente com isotipo-emparelhado IgG1 e IgG2b, foram adquiridos a BioLegend (San Diego, CA). A fonte e a utilização de outros anticorpos foi previamente relatado, incluindo aquelas contra RANKL humana, HIF-1α, NRP-1, e o VEGF, assim como aqueles que fosforilada c-Met e a subunidade p65 de NFkB [22]. As fontes e purificação de corantes de carbocianina heptamethine foram relatados anteriormente [19], [20]. Ficoll-Paque PREMIUM 1,084 foi comprado de GE Healthcare (Piscataway, NJ), e Histopaque-1077 foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cultura celular

PC Humana -3 células foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS, gemini Bio-Products, West Sacramento, CA), penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 ug /ml). As células foram separadas com 0,05% de tripsina /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), lavadas em Ca

2 + – e Mg

2 + livre de tampão fosfato salino (PBS, Invitrogen), e ressuspensas em meio de cultura completo . As células foram contadas em um celular Contador TC10 Automated (Bio-Rad, Hercules, CA), com exclusão de azul tripano para confirmar a viabilidade celular.

amostras de sangue clínicos

amostras de sangue dos pacientes foram utilizados com escrita consentimento informado através de Cedars-Sinai Medical Center de revisão institucional protocolos bio-bancárias aprovado bordo (IRB # Pro00025217 e # Pro00030418). amostras de sangue clínicos foram coletados no pré-operatório de 40 pacientes CaP submetidos à prostatectomia radical no Cedars-Sinai Medical Center. Várias amostras de sangue foram obtidas de visitas repetidas de 5 pacientes com doença independente de andrógeno. Foram obtidas amostras de sangue adicionais de 34 doadores saudáveis ​​do sexo masculino com idade entre 32 e 70 anos. Cerca de 7,5 ml de sangue venoso foi recolhida num tubo de topo contendo EDTA alfazema (BD, Franklin Lakes, NJ), e centrifugou-se a 1500 rpm durante 20 minutos à temperatura ambiente numa centrífuga Heraeus CLINIFUGE (Thermo Scientific, Logan, UT). Após a fracção de plasma foi colhido para fins de diagnóstico, a fração de glóbulos embalado foi transportado em gelo para o laboratório de pesquisa dentro de 3 horas após a colheita.

Isolamento de PBMC

PBMC foram isolados com densidade padrão centrifugação em gradiente. A amostra de sangue embalado foi diluída com um volume igual de uma solução de sal equilibrada contendo% de glucose 0,01 (w /v), 5 uM de CaCl

2, 9,8 uM de MgCl

2, 540? M de KCl, NaCl 126 mM, e Tris 14,5 mM, pH 7,6. Uma alíquota de 2 ml da amostra foi diluída em camadas sobre uma almofada de 3 ml de Ficoll-Paque e submetido a centrifugação a 400 x g à temperatura ambiente durante 40 minutos. As células na fracção de células nucleadas foram recolhidas e lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em meio RPMI-1640 contendo FBS a 5% para análises posteriores.

crava o tumor celular e coloração

aliquotas de PBMCs foram feitos de modo que cada um continha um número equivalente de células a partir de 1 ml de sangue de doadores, cerca de 2 × 10

6 células /aliquota. Para cravar com células cancerosas, um número conhecido de células PC-3 vivos em meio RPMI 1640 contendo FBS a 5% foram adicionados à alíquota de PBMC. Em estudos de controlo inoculadas com células cancerosas mortas, PC-3 de células em suspensão de célula única foram mortas em 75% de etanol e recuperado da mesma forma. As amostras misturadas foram depois coradas com corantes NIR de 20 um a 37 ° C durante 30 minutos. Depois de lavar duas vezes em PBS para remover corantes livres, as células foram fixadas em formalina durante 10 minutos à temperatura ambiente, lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em 400 ul de Tampão de Coloração celular (BioLegend). Para mais mancha para marcadores de superfície, as amostras foram primeiro incubadas com IgG de isotipo em gelo durante 10 minutos, e, em seguida, feito reagir simultaneamente com o mAb conjugado com FITC para EpCAM e mAc conjugado com PE ao CD45 durante 20 minutos. A relação de trabalho dos mAbs foi de 0,1 ug /10

6 células. Após lavagem duas vezes com o tampão de coloração celular, as células foram coradas com 4 ‘, 6’-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Invitrogen), antes de ser submetida a detecção.

A detecção de CTC activadas por fluorescência com células de classificação (FACS)

Dois instrumentos de FACS (BD Biosciences, MA) foram usados ​​no estudo. Para isolar CTCs, um FACSAria III foi usado para classificar células marcadas positivamente para um deslize citologia APES-revestido (Bio-Mundial, Dublin, OH). Para enumerar CTC, foi utilizado um LSRII citómetro de fluxo. procedimentos de detecção recomendado fabricante foram seguidas. Em paralelo com a detecção de cada uma das amostras de sangue humano, 1 × 10

4 células PC-3 foram usadas para cravar uma aliquota da amostra de 1 ml. O perfil de citometria de fluxo da amostra enriquecida foi utilizada para guiar o gating positividade. dados de FACS foi ainda analisada com o software FlowJo.

Fluorescência de imagem

células coradas isoladas com o classificador FACS em lâminas foram submetidos a tanto imagens de fluorescência e imagem no infravermelho próximo com o nosso procedimento relatado anteriormente [19] [20], [22], com um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse Ti excitado por uma fonte de luz xenon arc. Perto imagens infravermelhas foram adquiridos através de um filtro INDO (780-840 nm).

Quantum múltipla Dot Labeling (mQDL)

células coradas coletados com o classificador FACS em lâminas de vidro foram submetidas a coloração com o protocolo mQDL como relatado anteriormente [22]. Em resumo, as amostras foram primeiro tratados com um esgoto tampão para remover o mAb utilizado para o isolamento CTC, e, em seguida, submetido a coloração sucessiva com anticorpos que reagem a um grupo de biomarcadores relacionados-APC, incluindo RANKL, HIF-1α, NRP-1, VEGF , PC-MET, e p-p65, como descrito anteriormente [22], com o mesmo protocolo de coloração. Finalmente, as amostras foram contrastadas com DAPI antes de ser submetido a imagem espectral e quantificação de sinal em um sistema de imagem espectral Cri com o software Nuance (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

Análise Estatística

médias, desvios-padrão e medianas foram usadas para resumir as variáveis ​​contínuas. Frequências e percentuais foram calculados para variáveis ​​categóricas. correlações de Spearman foram calculados entre as variáveis ​​contínuas nos dados devido à distribuição heterogênea. Comparações de CTC ao vivo entre as categorias de interesse foram realizadas utilizando testes de Wilcoxon Rank Sum. Um modelo linear misto foi utilizado para avaliar a relação entre o número de células recuperadas e perfurantes, onde as medidas repetidas sobre os doadores foram modelados com uma estrutura heterogénea de covariância composto simétrico. Todas as análises foram feitas usando SAS versão 9.3

Resultados

Temos demonstrado anteriormente captação activa e retenção de corantes NIR por uma cultura humana CaP LNCaP, C4-2, PC-3, DU-145. , Arcap

e e Arcap

células M [19], [20]. Como poucos como dez células PC-3 cravado em 1 ml de sangue doador humano podem ser detectadas usando IR-783. PC-3 de células mortas incrementadas da mesma forma não exibiram qualquer absorção de IR-783. Uma vez que a absorção de IR-783 requer a utilização de um transportador que requer ATP anião orgânico, corante absorção em si é um ensaio funcional que aponta para a viabilidade das células de tumor. Para avaliar a aplicabilidade desta abordagem para a detecção de CTCs ao vivo em amostras de sangue de pacientes, nós incorporamos NIR corante coloração para análise FACS. A EpCAM amplamente utilizado

+ CD45

-profile [9], [12] foi adoptada para consolidar a natureza CTC da NIR detectado

+ células.

1. Identificação e isolamento de Vivo (NIR

+) As células a partir de sangue humano

amostras de sangue de doentes foram sujeitos a centrifugação em gradiente de coloração sequencial seguida: em primeiro lugar com NIR corante para corar CTC vivo, em seguida, com anticorpos marcados com fluorescência para EpCAM e CD45 para confirmação. Finalmente, a amostra foi corada com DAPI para visualização de núcleos celulares.

Como um controlo para calibrar o desempenho do sistema de detecção, que testou o primeiro protocolo de coloração com sangue de dadores saudáveis ​​cravado com PC-3 em células números variados. Na análise FACS, as amostras coradas foram classificadas para isolar o EpCAM

+ CD45

– população. Estas células foram então recorreu para determinar o número de NIR

+ DAPI

+ células (Figura 1A). As células PC-3 foram identificadas como células nucleadas (DAPI

+) expressar EpCAM mas não CD45 (Figura S1). Em testes repetidos quando a final EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ contagens foram modelados como uma função do número de células espetado, uma tendência crescente significativa foi observada com um coeficiente de correlação de 0,997 ( A Figura 1B e Tabela S1). A correlação linear altamente sugerido que este protocolo de FACS foi utilizável para a detecção CTC com um número insignificante de contagens não específicas. Nós ainda determinado que as células recuperadas PC-3 em lâminas de microscópio poderia ser facilmente visto através de microscopia de fluorescência (Figura 1C). Usando o mesmo protocolo, foram detectados 2,8 ± 1,7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ eventos em uma série de estudos com amostras de sangue coletadas de 34 indivíduos doadores saudáveis ​​(Figura 1B). Esta detecção estava bem de acordo com outros estudos sobre EpCAM

+ células em amostras de sangue de doadores saudáveis ​​analisados ​​utilizando plataformas CTC próxima geração [23], e provavelmente reflete o nível de células epiteliais circulantes fundo. É importante ressaltar que em estudos paralelos em que PC-3 células mortas foram utilizados em spiking, o EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ contagens foram mantidos no nível de fundo, sugerindo que o cravado mortos as células PC-3 não pegar o corante (dados não mostrados). Estes estudos de controle coletivamente demonstrar a adequabilidade das NIR corante para tingir e detectar CTCs ao vivo.

CaP humano PC-3 células foram utilizadas como células de controlo positivo. Um, sequencialmente células PC-3 corada com todos os quatro agentes de detecção foram submetidas a análise por FACS. Painel superior: a amostra foi detectada pela primeira vez para EpCAM positiva (FITC), mas CD45 negativo (PE) mancha (fração fechado). painel inferior: a fração fechado foi consultado para IR-783 (NIR) e nuclear mancha (DAPI). NIR

+ EpCAM

+ DAPI

+ CD45

– contagens foram consideradas como as células cancerosas vivas. detecção de PC-3 foi utilizado em paralelo na análise de cada amostra clínica de orientação na configuração de porta. B, eficiência da estratégia de detecção foi avaliada por comparação do número de cravada e detectadas células PC-3 por análise de FACS. Cada ponto de dados foi a média das células PC-3 detectados subiu para 6 amostras de doadores saudáveis. C, A microscopia de fluorescência foi utilizada para visualizar as células PC-3 recuperados numa lâmina de vidro. linha superior mostra as imagens de um campo representativo em baixa ampliação (40 ×; bar = 250 um), com duas células (marcadas com 1 e 2) apresentados em grandes ampliações nas duas linhas inferiores (400 ×; bar = 25 mm) .

2. Detecção de CTCs vivas em doentes com localizada CaP Submetidos a prostatectomia radical

Usando o ensaio FACS funcional após coloração NIR, testamos a detecção de EpCAM

+ CD45

-DAPI

+ células, daí em diante referido como

total de CTCs, em pacientes CaP clínicos com ênfase na EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ eventos (doravante referida como

vivo

ou

NIR

+

CTCs). PBMC foram isolados a partir de amostras de sangue pré-operatório de 40 pacientes com diagnóstico de doenças localizadas. características detalhadas destas pacientes estão resumidas na Tabela 1.

Esta série de análises revelaram que ao vivo CTC contagens que variaram consideravelmente entre os pacientes. EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ contagens variaram de 0 a 439 células /ml (média de 25 células /ml; 10 células medianos /ml) para este grupo de pacientes perioperatórios (Tabela 1). Neste estudo, uma contagem inferior a 5 foi considerado normal, como o nosso pool de doadores saudáveis ​​teve 2,8 ± 1,7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ contagens (Figura 1B). O método de coloração reproducibly detectado mais de 5 vivos CTCs /ml em 30 dos 40 pacientes. Resultados representativos da detecção de citometria de fluxo estão apresentados na Figura 2A. Demonstramos ainda que os CTC pode ser isolado directamente em lâminas de microscópio, e podem ser visualizados por microscopia de fluorescência (Figura 2B). Nestas análises, CTCs vivos foram distinguidos de células mortas com base na absorção de NIR corante (Figura 2B).

resultados de detecção representativos são mostrados. A, linha superior mostra a detecção de CTC de paciente 6, onde 10 CTCs vivos foram encontrados. Lower linha mostra a detecção de 148 CTCs ao vivo de paciente 14. Para cada amostra, definindo o portão foi dirigido por coloração paralelo de células PC-3. B, CTCs detectados a partir de paciente de 14 foram isolados em uma lâmina de microscópio e visualizada imediatamente pelo imagens de fluorescência. imagens de baixa ampliação de um campo representativo (40 ×; bar = 250 mm) são mostrados na linha superior. Abaixo, imagens de alta ampliação de 2 CTCs vivos (NIR

+) a partir do mesmo campo são mostrados nas próximas duas linhas, em comparação com 2 CTCs mortos (NIR

-) nas duas últimas linhas (400 ×; bar = 25 mm).

O CTC ao vivo conta detectado a partir desta coorte não se correlacionou significativamente com o nível sérico de PSA pré-operatório (r = 0,12,

p

= 0,47, Figura S2), patológica N-estágio (determinado paciente apenas 1 nó positivo), pontuação de Gleason, ou status da margem (Figura S3). Comparando CTC conta com o monograma preditivo Stephenson, não houve relação estatisticamente significativa entre a contagem CTC ao vivo e o monograma preditivo Stephenson.

Havia 10 pacientes com 5 ou menos CTCs vivo /ml (Tabela 1), e todos tinham doença T2 com margens cirúrgicas negativas. Apenas uma destas doentes (doente 26) tinha uma concentração de PSA no soro detectáveis ​​2 semanas após a prostatectomia radical. Sua PSA no soro tornou-se indetectável em 6 semanas após a operação. O paciente, desde então, permaneceu livre de recidiva. Houve 3 pacientes com margens cirúrgicas positivas (pacientes 2, 13 e 25, Tabela 1). Esses pacientes também permaneceram por mais de dois anos até agora sem terapias adicionais anti-câncer livre de recidiva.

Houve 3 pacientes tinham concentrações de PSA no soro detectáveis ​​dentro de 3 meses após a prostatectomia radical (Tabela 1). Paciente 26 teve um pT2cN0 Gleason cancro de 3 + 3 com margens negativas. Curiosamente, ele tinha apenas 3 ao vivo CTCs /ml de sangue. PSA de soro neste paciente tornou-se indetectável depois, sem intervenção adicional. Paciente 29 teve um pT3aN0 Gleason 4 + 5 do cancro com margens positivas, e foi detectado com 46 ao vivo CTCs /ml. Seu nível de PSA no soro tornou-se indetectável após 6 meses de terapia de privação de andrógeno que continua até este momento. Paciente 39 tinham metástases linfonodais no momento da cirurgia e foi encontrado para ter altos pré-operatórios contagem CTC (439 /ml). casos adicionais de recorrência têm de ser examinados a fim de determinar se pré-operação CTC contagem poderia ser usado como um parâmetro para a previsão de recidiva da doença.

Também comparamos CTC ao vivo conta com o estado das margens cirúrgicas. Os 25 pacientes com margens negativas teve uma média de 25 ao vivo CTCs /ml (intervalo de 0-148), em comparação com os 15 pacientes com margens positivas que tiveram uma média de 54 CTCs vivo /ml (intervalo de 2-439). A diferença não foi estatisticamente significativa, provavelmente devido à variação acentuada entre os indivíduos e o tamanho da amostra limitada.

Enquanto a maioria dos pacientes de nossa coorte tinha Gleason de 6 ou 7 patologias, nenhuma correlação foi encontrada entre o escore de Gleason e viver números de CTC. Por outro lado, pacientes com contagem CTC vivos mais elevados tenderam para ter a doença mais avançada por estadiamento do tumor. Houve uma associação significativa entre a contagem CTC ao vivo e estágio T, com os pacientes pt3 ter contagens mais elevadas do que os casos Pt2 (mediana 8 vs. 19,

p

= 0,02). Notavelmente, o único paciente com doença pN1 nódulo positivo teve a maior contagem ao vivo CTC (439 CTCs /ml, o paciente 39, Tabela 1). contagens ao vivo de alta CTC, portanto, parecia correlacionados aos estágios tumorais avançados.

3. As avaliações das CTCs ao vivo em pacientes com doenças metastáticas

amostras de sangue consecutivos foram obtidos a partir de 5 pacientes CaP cuja doença tiveram uma recaída e metástase após a terapia inicial. Estes pacientes foram submetidos a vários tipos de tratamento sistêmico. Em contraste com o CTC vivo e contagem total em pacientes com doença localizada, maior disparidade entre o total de contagens e vivem CTC foi observada (Tabela 2), enquanto do outro lado conta CTC casos mostrou pouca correlação com a concentração sérica do PSA (Figura 3). No entanto, quando analisada ao longo do tempo para os pacientes individuais, foram identificados tendências interessantes em que vivem contagens CTC parecia correlacionar-se inversamente com o benefício clínico observado em resposta às terapias.

CTC contagens detectadas a partir de pacientes mCRPC foram analisadas, juntamente com a o progresso da intervenção terapêutica. Dois resultados representativos são mostrados. A, o incremento progressivo da CTC conta no paciente 41 correlacionada com a progressão metastática clínica. B, a persistente baixa CTC conta no paciente 42 correlacionada com terapias anticâncer benéficos.

Paciente 41 começou o tratamento bicalutamida no início da coleta de amostras para metastático CaP resistente à castração (mCRPC). Ele experimentou (

i., Soro PSA

) progressão assintomática bioquímica durante dois meses, durante o qual vivem CTC contagens inicialmente diminuiu, mas se recuperou rapidamente. O tratamento foi mudado para acetato de abiraterona, que falharam em produzir uma resposta bioquímica. O paciente desenvolveu a doença metastática óssea sintomático e terapia de radiação necessária. Durante a progressão da doença, o total de contagens CTC foram sustentada, mas a proporção vivo CTC aumentou juntamente com o nível de PSA no soro (Tabela 2 e Figura 3A).

Paciente 42 foi sujeito a detecção CTC antes do primeiro ciclo de tratamento com docetaxel, o que resultou em uma excelente resposta julgado pela queda contínua de nível de PSA no soro, mesmo após o tratamento foi terminado. O paciente permaneceu assintomático por mais 4 meses antes de ter que realizar mais 8 ciclos de docetaxel para a progressão sintomático. Durante o tratamento, as contagens CTC do paciente diminuíram acentuadamente, a partir de 82 até 6, e CTC vivos diminuiu em conformidade, 37-0%. Este paciente apresentou uma recuperação nos CTCs totais e ao vivo durante o curso do tratamento com docetaxel a partir do dia 20 ao dia-139. Para o fim do tratamento com docetaxel (do dia-a-dia 102-139), observamos CTCs vivo recuperando de 14 para 94% (Tabela 2 e Figura 3B).

Paciente 43 receberam inicialmente o tratamento com docetaxel em que ele respostas bioquímicas e clínicas iniciais apresentados. O segundo ciclo de tratamento com docetaxel, no entanto, foi seguido por rápida progressão da doença com deterioração progressiva clínico (

i.

, Piora a dor e perda de peso) e um aumento do PSA no soro. Notamos uma elevação dramática no percentual de CTCs ao vivo (de 2% até 97%), sem alterações substanciais de CTCs totais (variou de 36 a 44). O paciente expirou durante os próximos 2 meses com rápida deterioração clínica. A contagem CTC vivo aumentou acentuadamente, juntamente com a deterioração (Tabela 2).

Paciente 44 foi tratado com bicalutamida para mCRPC. O tratamento não resultar em benefício bioquímico mas uma queda precipitada na CTC conta 1052-54 foi observado. Apesar desta redução dramática no total CTC, no entanto, a percentagem de CTC vivos não se alterou substancialmente restante no intervalo de 63 a 88%. As contagens CTC aumentou 54-196 entre os dias 25 a-dia-73 no momento em que o tratamento foi terminado bicalutamida. Este paciente necessitou de radiação paliativos e uma manobra hormonal quaternário (Tabela 2).

O paciente 45 teve castração sensível CaP e foi submetido a terapia de supressão de androgénio intermitente que tinha sido iniciada 4 meses antes da primeira detecção do CTC. O contador de CTC é inferior ao limiar de detecção, em boa concordância com a concentração de PSA no soro bem suprimida (Tabela 2). Neste caso, o aumento subsequente da contagem CTC ao vivo foi de 4 meses mais cedo do que o rebote PSA, que mais tarde foi suprimida com a terapia de privação de andrógeno. É interessante notar, no entanto, que este paciente tinha uma elevada percentagem de CTCs vivos (83-84%), apesar de terapia de supressão hormonal.

4. Isolamento de CTCs vivos para subsequente Caracterização Molecular

NIR coloração facilitou a identificação e isolamento de CTCs ao vivo a partir de amostras de sangue clínicos (Figura 2). Testamos as CTCs isolados para investigar as alterações moleculares relacionadas-PCA. Em uma tal investigação, CTCs em pacientes CaP foram isoladas com base em EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ coloração. A expressão da proteína nas CTC foi detectada por mQDL e foi realizada para verificar a expressão de um painel de biomarcadores proteína associada com a progressão da APC e metástases que o nosso grupo está a estudar activamente [22]. Estes ensaios demonstraram que a expressão anormal de RANKL, HIF-1α, NRP-1 e proteínas VEGF visto em amostras clínicas tumorais CaP [22] pode ser facilmente detectado nas CTC isolado (Figura 4A). Da mesma forma para os tumores clínicos, fosforilação aumentada de c-Met, bem como a subunidade p65 de NFkB o, foi detectada na mesma população CTC. Curiosamente, o sinal de quantificação dos CTC coradas revelou heterogeneidade notável intercelular, como proteínas individuais foram detectados com níveis variados entre CTC (Figura 4B). Outras investigações, no entanto, é necessário para avaliar a extensão do CTC heterogeneidade ao nível da expressão do gene.

CTCs ao vivo da primeira amostra de paciente 44 (Tabela 2) foram isolados em uma lâmina de microscópio e submetido a coloração mQDL para o estado de um painel de proteínas documentados para se relacionar com CaP progressão. A, imagens espectrais de dois CTCs representativos são mostrados no topo de dois painéis (8 imagens cada, que representam o nível de RANKL, pc-Met, HIF-1α, pp65, NRP-1 e VEGF expressão; 400 ×; bar = 50 mm ). B, A quantificação de intensidades de imagem espectrais das seis proteínas indicadas no painel A a partir de cinco células coradas a partir do mesmo paciente. O nível relativo da expressão do gene foi calculada com base na expressão de HIF-1α, que foi designado como 1.0.

Discussão

Foi desenvolvido um protocolo para avaliação da presença de CTCs vivos, com base sobre a absorção activa de protótipo IR-783 heptamethine carbocianina tingir [19], [20]. Em combinação com os anticorpos para a coloração de EpCAM, IR-783 células PC-3 humanas identificadas vivo cravado em sangue de dadores saudáveis, com elevada reprodutibilidade e coeficiente de correlação (Figura 1). Nós determinamos que o transporte activo de IR-783 em células tumorais pode ser utilizado como um ensaio funcional para demonstrar a viabilidade das células de tumor (Figura 2B). Esta descoberta é ainda mais realçado pela falta de IR-783 a absorção do corante em células tumorais mortas (congelamento-descongelamento e /ou etanol fixo) cravado em sangue de dadores saudáveis ​​(dados não apresentados). Nós detectada com sucesso e isolado CTC vivo a partir de amostras clínicas de CaP principal (Figura 2 e Tabela 1) e pacientes mCRPC (Figuras 3 e Tabela 2). Num estudo de prova de conceito, os CTC vivas isoladas eram favoráveis ​​para multiplexar a detecção de níveis de proteína ao nível da célula única em CTC isoladas de fresco utilizando um método mQDL (Figura 4). Os resultados sugerem que colectivamente: 1) IR-783 coloração pode diferenciar CTC vivo a partir de uma população CTC enumerado total num dado paciente em tempo real; pode ser estabelecido 2) A correlação entre a percentagem de CTC vivas e o desenvolvimento de doença progressiva e resistente a terapêutica;