Sumário

agentes que inibem STAT-3, um factor de transcrição citosólica envolvida na activação de vários genes implicados na progressão do tumor constitui uma estratégia promissora para a quimioprevenção do cancro de identificação. No presente estudo, nós investigamos o efeito de astaxantina na dieta sobre o JAK-2 /STAT-3 de sinalização no 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA) induzida bolsa de hamster bucal (HBP) modelo de carcinogênese através da análise do mRNA e a expressão da proteína de JAK /STAT-3 e dos seus genes-alvo. RT-PCR quantitativa, imunotransferência e análises de imuno-histoquímica revelaram que a suplementação de astaxantina inibe acontecimentos chave na sinalização de JAK /STAT STAT-3, especialmente de fosforilação e subsequente translocação nuclear de STAT-3. Além disso, a astaxantina regulada negativamente a expressão de genes alvo de STAT-3 envolvidos na proliferação celular, invasão e angiogénese, e reduzida densidade microvascular, evitando assim a progressão do tumor. análise de ancoragem molecular confirmaram os efeitos inibidores de astaxantina na sinalização STAT e angiogénese. experiências de cultura celular com a linha de células endoteliais ECV304 fundamentada o papel de astaxantina na supressão da angiogénese. Tomados em conjunto, os nossos dados fornecem evidência substancial de que a astaxantina da dieta impede o desenvolvimento e progressão de carcinomas HBP através da inibição de JAK-2 /STAT-3 e dos seus eventos de sinalização a jusante. Assim, a astaxantina, que funciona como um potente inibidor do desenvolvimento e progressão do tumor por segmentação de sinalização de JAK /STAT podem ser um candidato ideal para a quimioprevenção do cancro

citação:. Kowshik J, Baba AB, Giri H, Deepak Reddy L, Dixit M, Nagini S (2014) astaxantina Inibe JAK /STAT-3 Sinalização de revogar proliferação celular, invasão e angiogênese em um modelo animal de câncer oral. PLoS ONE 9 (10): e109114. doi: 10.1371 /journal.pone.0109114

editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de junho de 2014; Aceito: 08 de setembro de 2014; Publicação: 08 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kowshik et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Departamento de Biotecnologia, Nova Deli, Índia no âmbito do 7.º PQ do Projeto Conjunto Collaborative Indo-UE sobre ‘FUNCFOOD’. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

transdutor de sinal e activador da transcrição de proteína 3 (STAT3) é um factor de transcrição citoplásmica latente que transmite sinais da superfície celular para o núcleo quando activados por citocinas e factores de crescimento [1]. Em particular, a interleucina-6 (IL-6) ou o factor de crescimento epidérmico (EGF) estimula a fosforilação da proteína STAT3 por Janus quinase e STAT3 activado forma um homodímero que transloca-se para o núcleo onde regula a expressão de genes críticos para os processos celulares normais tais como o desenvolvimento das células, a diferenciação, a proliferação, a sobrevivência, a angiogénese, e a função imunitária [2] -. [6]

activação aberrante de sinalização de JAK /STAT3 foi documentada em uma ampla variedade de tumores humanos, incluindo hematopoiética neoplasias e tumores sólidos, como cabeça e pescoço, mama e câncer de próstata [7], [8]. a activação constitutiva de STAT3 contribui para a proliferação e oncogénese por modulação da expressão de uma variedade de genes necessários para a sobrevivência das células do tumor, proliferação e a angiogénese, bem como a invasão e metástase e sugere geralmente mau prognóstico [9] – [11]. Assim, a sinalização de JAK /STAT3 desempenha um papel central na tumorigénese e é considerada como um importante alvo terapêutico para o desenvolvimento de drogas novas.

identificação de agentes que têm como alvo a STAT3 molécula é susceptível de ser de importância na quimioprevenção do cancro. Vários antioxidantes dietéticos são reconhecidos para bloquear o desenvolvimento do tumor por segmentação da rede de sinalização STAT3 [12] – [15]. A astaxantina, um não-provitamina A carotenóides encontrados predominantemente em microalgas, fungos, plantas, frutos do mar e algumas aves como flamingos e codornizes é um potente antioxidante [16]. A astaxantina foi encontrado para expor a maior actividade antioxidante entre os carotenóides e é amplamente utilizado na prevenção e tratamento de várias doenças [17]. AXT também tem sido demonstrado que exibem propriedades anti-inflamatórias e anti-cancerígenos [18], [19].

Recentemente, demonstrou-se que a suplementação dietética de AXT induz a apoptose através da inibição intrínseca PI3 /Akt, MAPK, NF-kB e Wnt /β-catenina circuitos de sinalização no 7,12-dimetilbenz [a] antraceno modelo carcinogénese (DMBA) hamster induzida por cavidade bucal (HBP) [20]. Estes resultados nos tentados a hipótese de que AXT que induz a apoptose pode bloquear o processo oposto da proliferação celular impedindo assim a acumulação de mutações sequenciais que eventualmente levam à invasão tumoral e angiogénese. inativação Além disso, induzida AXT de fatores de transcrição NF-kB e β-catenina, cubos centrais na sinalização oncogénica também pode afetar a via /STAT3 JAK. No presente estudo, nós demonstramos que dietético AXT inibe a progressão do tumor com base na revogação da via JAK /STAT3 e os seus alvos a jusante D1 ciclina, MMP-2, -9, e VEGF no modelo de carcinogénese HBP. Além disso AXT diminuição da densidade microvascular, que desempenha um papel essencial no desenvolvimento e progressão do tumor. experimentos de cultura celular com a linha de células endoteliais ECV304 também foram realizados para comprovar o papel de astaxantina na supressão da angiogênese induzida por hipóxia.

Materiais e Métodos

Chemicals

A acrilamida, bovina albumina de soro (BSA), azul de bromofenol, 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA), hidroxiureia, 2-mercaptoetanol, sulfato de dodecil de sódio (SDS) a N, N, N ‘, N’ – tetrametilenodiamina (TEMED) e Trizol foram adquiridos a partir de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA. A astaxantina foi obtido a partir de Bio-Real, Suécia. meio DMEM-F12, solução de antibiótico que consiste em penicilina e estreptomicina e azul Alamar eram de himedia Labs, Mumbai, Índia. soro fetal de bovino de origem sul-americana era de GIBCO, Invitrogen, Nova Iorque, EUA. Poder SYBR Green PCR Master Mix foi obtida a partir da Applied Biosystems, Califórnia, EUA. Os anticorpos para a IL-6, GAPDH, ciclina D1, PCNA, p21, MMP-2, MMP-9, TIMP-2, RECK, VEGF, VEGFR2, HIF1α, foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, EUA. PJAK-2

tyr1007 /1008, JAK-2, pstat-3

tyr705,-3 STAT e histonas (H2B) anticorpos e BrdU, STAT-3

tyr705, ciclina total de D1 e pVEGFR2

kits tyr1175 ELISA eram de Cell Signaling Technology, EUA. anticorpo CD-34 foi adquirido a Novocastra, Alemanha. Matrigel foi da BD Biosciences, EUA. Todos os outros reagentes utilizados foram de grau analítico.

Animais e ética declaração

Oito a dez semanas de idade hamsters sírios machos, pesando entre 100-110 g foram utilizados neste estudo. Os animais foram obtidos a partir de Central Animal House, Universidade Annamalai, Índia. Os animais foram alojados quatro por gaiola e fornecida com uma dieta padrão de sedimento e água ad libitum. A saúde dos animais foi monitorada diariamente durante o estudo. Os protocolos para os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional Animal, Universidade Annamalai e conduzidas de acordo com as orientações estabelecidas pela Comissão para Fins de Controle e Fiscalização de Experimentos com Animais (CPCSEA).

Tratamento calendário

Os animais foram divididos aleatoriamente em grupos experimentais e de controlo e divididos em 4 grupos de 5 animais cada. No grupo 1, as bolsas bucais direito de hamsters foram pintados com DMBA 0,5% em parafina líquida, três vezes por semana durante 14 semanas [21]. Grupo 2 animais receberam, para além de DMBA, uma dieta de base contendo 15 mg /kg de peso corporal de astaxantina [20], [22]. Grupo 3 os animais receberam astaxantina (15 mg /kg de peso corporal) por si só durante 14 semanas. Grupo 4 os animais receberam dieta basal sozinha e serviu como um controlo não tratado. A experiência foi terminada em 14 semanas, e todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical depois de um jejum de um dia para o outro. Os tecidos bolsa bucais foram imediatamente subdividido e processadas para distribuição para cada experimento.

cultura celular

linha de células ECV 304 foi usado e cultivadas em DMEM meio basal com 10% de soro fetal bovino com antibióticos. ECV304 é uma linha de células endoteliais derivado a partir de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) através de transformação espontânea [23]. Em comparação com culturas HUVEC primárias, a utilização de células ECV304 tem uma vantagem prática uma vez que estas células apresentam uma melhor capacidade e reprodutível para a angiogénese in vitro são portanto uma escolha ideal para ensaios de angiogénese base de cultura de células [24]. As culturas confluentes de células ECV304 foram subcultivadas e mantidas em CO

2 incubadora a 37 ° C. Para o ensaio em matrigel, as células foram mantidas em DMEM meio basal com o soro bovino fetal 4%. Para condição hipóxica, as células foram incubadas em câmara de hipoxia com 1% de O

2.

extracção de ARN e quantitativo em tempo real de RT-PCR

O ARN total a partir dos tecidos cavidade bucal foi extraída usando o reagente Trizol, tal como descrito anteriormente [25]. A concentração de RNA foi determinada a partir da densidade óptica a um comprimento de onda de 260 nm (OD260 utilizando uma unidade equivalente a 40 ug /ml de RNA). 5 ug de RNA total isolado foi transcritos de modo inverso em ADNc numa mistura reaccional contendo 4 mL de 5 × tampão de reacção, 2 ul de mistura de dNTP (10 mM), 20 unidades de inibidor de RNase, 200 unidades de vírus aviário-mieloblastose (AMV ) transcriptase reversa e 0,5 ug de oligo (dT) (Promega, WI, EUA) num volume total de 20 ul. A mistura de reacção foi incubada a 42 ° C durante 60 min e a reacção foi terminada por aquecimento a 70 ° C durante 10 min. O ADNc foi armazenado a -80 ° C até à sua utilização.

quantitativa de RT-PCR foi realizada utilizando a energia SYBR Green mistura principal de acordo com as instruções do fabricante, usando um termociclador StepOne Plus (Applied Biosystems). Para a 1 × PCR Master Mix, 2,5 ul de cada ADNc foi adicionada num volume final de 20 ul. As condições de PCR foram como se segue: 95 ° C durante 5 min, 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 52 a 60 ° C (com base no alvo), e 60 s a 72 ° C. mudança dobra quantitativa relativa em comparação com o controlo foi calculada usando o método comparativo Ct, onde TC é o número do ciclo em que a fluorescência primeira excede o limiar. Os valores do Ct de cada amostra foram obtidas subtraindo os valores de Ct para GAPDH a partir do valor Ct do gene alvo. A especificidade dos produtos de PCR resultantes foi confirmada por curvas de fusão.

Western blotting

As proteínas foram extraídas da amostra de tecido usando o tampão de lise contendo Tris 62,5 mM (pH 6,8), SDS a 10%, 5% 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol e azul de bromofenol. fracções nuclear e citoplasmáticos foram separados como descrito por Legrand-Poels et ai. [26]. Uma quantidade igual de extractos de proteína foram carregadas em SDS-PAGE e as proteínas resolvidas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno. As manchas foram então incubadas durante 2 h em 1X PBS contendo 5% leite seco não gordo. As membranas foram então sondadas com anticorpos primários e secundários, conforme as instruções do fabricante. As proteínas foram visualizadas usando reagentes de detecção de quimioluminescência aumentada (Sigma). Densitometria foi realizada em IISP scanner de mesa e quantificados com a Total Lab 1,11 software.

ELISA

Os níveis de pstat

tyr705, ciclina D1 total e pVEGFR2

tyr1175 foram determinadas usando ELISA sanduíche kit (Cell Signaling Technology, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

a imuno-histoquímica

secções de tecido embebidas em parafina foram deparaffinised, re-hidratados e submetida a recuperação de antigénios e o bloqueio da peroxidase endógena. Em seguida, as secções foram incubadas com PSTAT-3 de coelho monoclonal, PCNA, MMP-2 e de coelho de VEGF anticorpos policlonais à temperatura ambiente durante 3 h. As lâminas foram lavadas com TBS e, em seguida, incubadas com o anticorpo secundário marcado com biotina seguido de estreptavidina-biotina-peroxidase (Dako, Carprinteria, CA, EUA) durante 30 minutos cada à temperatura ambiente. O imunoprecipitado foi visualizado por tratamento com 3,3′-diaminobenzidina e contracoloração com hematoxilina. Os tecidos foram então fotografadas usando um invertido fluorescente microscópio (Leica Microsystem Vertrieb GmbH, Wetzler, Alemanha) ligado com a câmara digital DFC295.

A densidade microvascular (MVD)

A densidade microvascular foi avaliada por coloração imuno-histoquímica com anticorpo anti-CD34. As áreas de maior neovascularização foram localizados e as imagens capturadas em um mínimo de cinco campos diferentes. Microvasos foram contados por dois investigadores independentes e os dados representado como número de vasos /campo de visão.

Molecular encaixe

encaixe Molecular foi feito usando Schrodinger suíte 2013. A astaxantina foi recuperado do PubChem (www .ncbi.nlm.nih.gov /pccompound) e proteínas STAT-3 e VEGF foi recuperado do banco de dados de proteína com PDB ID: 3CWG e 3V2A respectivamente. Receptor geração de grade e encaixe ligando foram realizados empregando o algoritmo de encaixe Glide Xp.

Alamar azul ensaio

A viabilidade celular foi medida por ensaio Alamar Blue [27]. Resumidamente, Alamar Blue (sal de sódio de Resazurina Himedia) foi dissolvido em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 para fazer um stock de 5 mg /mL e uma concentração final de trabalho de 0,1 mg /mL em meio de cultura celular. Resazurina é um indicador redox, que mede o ambiente redutor das células, reduzindo a um resorufina altamente fluorescente. A astaxantina em diferentes concentrações (5, 10, 20, 50, 100, 200 e 400 uM) foi adicionado às células e, após 24 h, foi adicionado Alamar Blue corante e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 4 h. A alteração de cor foi monitorizada colorimetricamente a 595 nm e 570 nm, a ser avaliada em relação oxidado formas reduzidas, respectivamente, do reagente usando leitor de placa de multi-modo.

ensaio BrdU

A proliferação celular foi analisada medindo a síntese de ADN com bromodesoxiuridina (BrdU) ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA) kit (Cell Signaling Technology, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 1 x 10

4 células foram semeadas em microplacas de 96 poços e cultivadas com ou sem astaxantina (50 uM) durante 24 h. As células foram então marcadas com BrdU durante 6 h. Após a fixação, as células foram incubadas com 100 ul de anticorpo anti-BrdU para 60 min. Após a lavagem, foram adicionados 100 uL de anticorpo secundário e incubaram-se durante 30 min, em seguida 100 ul de substrato (tetrametilbenzidina) foi adicionado a cada poço, e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 min. A absorvância a 450 nm foi medida com um leitor de ELISA.

Migração ensaio

monocamadas confluentes de células ECV 304 em placas de 24 poços foram riscados com uma ponta de pipeta de 200 uL e incubados em normóxia e hipóxia condição com e sem 50 mM astaxantina. hidroxiureia 5 mM também foi adicionado para inibir a proliferação celular. As células foram fotografadas sob um microscópio com uma ampliação de 4x a 0 e 24 horas [28].

Matrigel formação do tubo de ensaio

pré-arrefecida placas de 96 poços foram revestidas com 80 ul de Matrigel ( BD) e incubou-se a 37 ° C durante meia hora. O mesmo número de células (20.000 /po) foram adicionados em cada poço com e sem condição hipóxica e na presença e ausência de astaxantina (50? M) e incubou-se em CO

2 incubadora a 37 ° C durante 14 horas. As imagens foram capturadas no mínimo cinco campos diferentes e os dados representados, finalmente, como número de tubos /campo de visão [29].

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando um teste de Mann-Whitney não paramétrico (Stats direta, Reino Unido) para

in vivo

e teste de Tukey post hoc para

in vitro

experimentos. Um valor de probabilidade inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

incidência de tumores

A incidência do tumor tem sido relatada em um estudo anterior [20]. No final do período experimental, a incidência do tumor foi de 100% com uma carga de tumor média de 82.25 mm

3 em hamsters pintadas com DMBA (grupo 1). A suplementação da dieta de astaxantina (15 mg /kg de peso corporal) para hamsters DMBA pintadas não induziu quaisquer tumores bruta na bolsa bucal e exame histológico revelou apenas hiperplasia leve. Em hamsters alimentados astaxantina sozinho e em grupos de controle, o epitélio era normal, intacta e contínua.

A astaxantina inibe a sinalização JAK /STAT, restringindo a fosforilação de STAT-3

Como STAT 3 é constitutivamente activado em uma ampla gama de doenças malignas, foram analisados ​​em primeiro lugar a expressão de ARNm de JAK-2 e STAT-3 por análise de RT-PCR quantitativo. Os nossos resultados mostraram que a suplementação da dieta da astaxantina reduziu significativamente a expressão de ARNm de moléculas-chave envolvidas na sinalização de JAK /STAT em comparação com animais pintados com DMBA (Figura 1A). Nenhuma diferença significativa foi observada nos animais tratados com astaxantina sozinho comparado ao controle. Além disso para explorar o mecanismo pelo qual a astaxantina regula a sinalização de JAK /STAT, nós próxima determinada a expressão da proteína de IL-6, JAK-2, 2-PJAK, STAT-3 e PSTAT-3 por Western blotting. Descobrimos que a aplicação tópica de DMBA aumentou significativamente as expressões desses genes em relação ao controle. administração dietética simultânea de astaxantina inibida JAK de sinalização /STAT, diminuindo os níveis de IL-6, JAK /STAT formas fosforilada e subsequente translocação para o núcleo (Figura 1B 1C). Isto foi ainda confirmado pela diminuição do nível de PSTAT

tyr705 (ELISA) no grupo tratado AXT (Figura 1D). coloração imuno-histoquímica confirmou também que a suplementação de astaxantina, resultou numa diminuição significativa na expressão de PSTAT-3 em comparação com animais pintados com DMBA (Figura 1E)

(média ± SD; n = 3).. nível de expressão de A. Transcrição de JAK-2 e STAT-3 em diferentes grupos experimentais, tal como determinado por PCR cinética. Os dados são a média ± DP de três experiências independentes

♣ p. 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. B. análise immunoblot Representante. As amostras de proteína (100 ug /pista) resolvidos em SDS-PAGE foram sondados com anticorpos correspondentes. GAPDH foi usada como controlo de carga para o citosol e de tecidos homogeneizados de todo. A histona H2B foi utilizado como controlo de carga para as proteínas nucleares. As proteínas fosforiladas são normalizados pela sua forma não fosforilada. análise C. densitométrica. A expressão de proteínas a partir de lisados ​​de controlo para três determinações foi designado como 100% no gráfico. Cada barra representa a expressão da proteína de três determinações

♣ p . 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. D. Níveis de pstat

tyr705 (ELISA). microfotografias E. representativos de coloração imuno-histoquímica de pstat-3 no controle e experimentais animais (20X).

A astaxantina impede a proliferação celular, invasão e angiogênese via inibição da via JAK /STAT

Como activação de STAT-3 regula a transcrição de genes envolvidos na proliferação celular, invasão, angiogénese e, o próximo investigaram o efeito da astaxantina na marcadores de proliferação celular. A suplementação da dieta da astaxantina reduziu significativamente a expressão de ARNm e proteína de ciclina D1 e PCNA. Além disso, o aumento AXT nuclear p21 expressão relativa à fracção citosólica. Além disso, a suplementação AXT diminuição do nível total de ciclina D1 (ELISA) em relação ao grupo de DMBA (Figura 2). No entanto, há diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre hamsters astaxantina sozinho e o grupo de controlo alimentados

(média ± SD; n = 3).. nível de expressão A. Transcrição de p21, ciclina D1 e PCNA em vários grupos experimentais, conforme determinado pela PCR cinética. Os dados são a média ± DP de três experiências independentes

♣ p. 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. B. análise immunoblot Representante. As amostras de proteína (100 ug /pista) resolvidos em SDS-PAGE foram sondados com anticorpos correspondentes. GAPDH foi usada como controlo de carga para o citosol e de tecidos homogeneizados de todo. A histona H2B foi utilizado como controlo de carga para as proteínas nucleares. análise C. densitométrica. A expressão de proteínas a partir de lisados ​​de controlo para três determinações foi designado como 100% no gráfico. Cada barra representa a expressão da proteína de três determinações

♣ p . 0,05 versus controlo. p 0,05 contra DMBA. D. Os níveis de ciclina D1 total (ELISA). microfotografias E. representativos de coloração imuno-histoquímica de PCNA no controle e experimentais animais (20X).

Para determinar se a inibição da JAK via /STAT por astaxantina impede invasão, nós próxima analisou a expressão de MMP-2 , MMP-9 e seus inibidores. administração dietética de astaxantina modulada significativamente a expressão de ARNm e proteína destas moléculas em comparação com os animais do grupo 1. Para validar ainda mais que a astaxantina regula metaloproteinases de matriz, que também examinado a expressão da proteína de MMP-2 por análise de imuno-histoquímica. Os nossos resultados mostraram que a administração de astaxantina diminuiu marcadamente a expressão de MMP-2 em comparação com os animais do grupo 1. . Por outro lado, não foram observadas diferenças significativas nos animais alimentados astaxantina isoladamente, em comparação com o controlo (figura 3)

(média ± SD; n = 3). nível de expressão de A. Transcrição de MMP-2, MMP-9, e o TIMP-2 em diferentes grupos experimentais, tal como determinado por PCR cinética. Os dados são a média ± DP de três experiências independentes

♣ p. 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. B C. representativas gráfico de barras representando imunoblots e a expressão da proteína de MMP-2, MMP-9, TIMP-2 e para RECK mínimo de três experiências independentes

♣ p. 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. D. fotomicrografias representativas de coloração imuno-histoquímica de a MMP-2 em animais de controlo e experimentais (20X).

Como a neovascularização desempenha um papel importante no crescimento do tumor e é um dos principais eventos a jusante desencadeadas pela JAK /STAT, investigámos o efeito da astaxantina na angiogénese. Como mostrado na Figura 4, a suplementação da dieta da astaxantina modulada significativamente a expressão do VEGF, VEGFR2 e diminuição da translocação nuclear de HIF-1α em comparação com animais pintados por DMBA. Por outro lado, a suplementação AXT diminuiu o nível de pVEGFR2 (ELISA). coloração imuno-histoquímica confirmou também a diminuição da expressão de VEGF em hamsters astaxantina alimentados comparação com os animais pintados por DMBA. Não foram observadas diferenças significativas nos animais tratados com astaxantina isoladamente em comparação com o controle

(média ± SD; n = 3).. nível de expressão de A. Transcrição de HIF-1α, VEGF e VEGFR2 em diferentes grupos experimentais, tal como determinado por PCR cinética. Os dados são a média ± DP de três experiências independentes

♣ p. 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. B. análise immunoblot Representante. As amostras de proteína (100 ug /pista) resolvidos em SDS-PAGE foram sondados com anticorpos correspondentes. GAPDH foi usada como controlo de carga para o citosol e de tecidos homogeneizados de todo. A histona H2B foi utilizado como controlo de carga para as proteínas nucleares. análise C. densitométrica. A expressão de proteínas a partir de lisados ​​de controlo para três determinações foi designado como 100% no gráfico. Cada barra representa a expressão da proteína de três determinações

♣ p . 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. D. Níveis de pVEGFR2

tyr1175 (ELISA). microfotografias E. representativos de coloração imuno-histoquímica de VEGF no controle e animais experimentais (20X).

Como AXT diminuiu HIF-1α e VEGF expressão, os principais agentes envolvidos na neovascularização, o próximo procuraram determinar se a inibição destas moléculas por AXT tem qualquer efeito sobre a vasculatura, medindo a densidade microvascular. DMBA pintado animais mostraram alta vascularização com um MVD médio de 185 em comparação com animais de controlo. A suplementação dietética de AXT reduziu significativamente o número de navios em comparação com animais pintados por DMBA, indicando o potencial antiangiogênico da astaxantina (figura 5).

A. fotomicrografias representativas da densidade microvascular em animais de controlo e experimentais (40x). gráfico B. Bar representando número de navios para mínimo de três experimentos independentes

♣ p . 0,05 versus controlo. * P 0,05 contra DMBA. gráfico C. Bar representando comprimento da embarcação para mínimo de três experimentos independentes

♣ p . 0,05 versus controlo. p . 0,05 contra DMBA

Para confirmar ainda mais a inibição da STAT-3 de sinalização e angiogénese por astaxantina, foi realizado estudo de encaixe molecular para a astaxantina com STAT-3 e VEGF. AXT foi encontrado para se ligar com STAT-3 e VEGF com uma pontuação de ancoragem de -5,081 e -2,94, respectivamente. AXT interage com o local de dimerização de STAT-3 para formar ligações de hidrogénio com Met 1482, Glu 1523, 1593 e Arg Asn 539 e interage com o VEGF, através de ligações de hidrogénio com 41 Asp resíduo (Figura 6).

. Representa ligação de hidrogênio forma AXT com Met 1428, Glu 1523, Arg 1593 e Asn 538 de STAT-3. B. Representa ligação de hidrogênio forma AXT com ASP 41 de VEGF.

Para testar o potencial antiangiogênico da astaxantina

in vitro

usamos ECV 304 células. A angiogénese é um processo complexo que envolve a proliferação de células, migração, e a formação do tubo. Em primeiro lugar, determinou-se a concentração de astaxantina na qual ela inibe a viabilidade das células ECV em 50% (IC

50). Nós utilizou várias concentrações de astaxantina a partir de 5 a 400 uM. Descobrimos que a astaxantina não reduz a viabilidade das células ECV 304 e 50% com as concentrações testadas. A viabilidade das células foi de 100% até 50 uM de astaxantina, como mostrado na figura 7; Por conseguinte, a astaxantina na concentração de 50 uM foi usado para outras experiências. Para testar se a astaxantina inibe a proliferação de células endoteliais, foi realizado ensaio Alamar azul e ensaio BrdU. a proliferação celular induzida por hipoxia não foi afectada pela astaxantina como confirmado por ensaio BrdU bem como ensaio Alamar azul (figura 7).

. IC

50 valor para astaxantina em ECV304 células (ensaio Azul Alamar). B. Efeito da astaxantina (50 uM) na proliferação de células induzida por hipoxia (ensaio de azul de Alamar). * P 0,05 em relação à normoxia. C. Efeito da astaxantina (50 uM) na proliferação de células induzida por hipoxia (ensaio BrdU). * P . 0,05 em relação à normoxia

A migração de células endoteliais é um dos passos fundamentais na angiogênese e metástase; portanto, nós próxima determinado o efeito de astaxantina sobre a migração. Os nossos resultados mostraram que 50 uM astaxantina inibiu significativamente a migração de células endoteliais. Como mostrado na Figura 8, células ECV hipóxicas migrado cerca de 437 uM, após 24 h; Considerando AXT trataram células de hipóxia migraram apenas cerca de 192 mm, indicando o potencial anti-migração de astaxantina

A B. fotomicrografias representativas de ensaio de migração em células de controlo e ECV hipóxica a 0 h e 24 h (4x). C. Bar gráfico que representa a distância migraram para mínimo de três experimentos independentes

♣ p . 0,05 em relação à normoxia. p . 0,05 contra hipóxia

O passo capital durante a angiogénese é a formação e fusão de tubos produzidos pelas células endoteliais que formam uma complexa rede de vasos, portanto, nós próxima determinado o efeito da AXT na formação do tubo por realizando a formação do tubo de ensaio em matrigel. Sob condição de hipóxia, houve aumento significativo no número de tubos formados, bem como o comprimento do tubo em relação à condição normóxica. tratamento astaxantina reduziu significativamente o número de tubos e comprimento do tubo sob condição hipóxica. Não foram observadas diferenças significativas nas células tratadas com astaxantina sob condição normóxica (figura 9).

A. fotomicrografias representativas de ensaio de formação de tubo de matrigel em células controle e hipóxico ECV (4x). B. Bar gráfico que representa não. de tubos para mínimo de três experimentos independentes

♣ p . 0,05 em relação à normoxia. * P 0,05 contra hipóxia. gráfico C. Bar representando o comprimento do tubo para mínimo de três experimentos independentes

♣ p . 0,05 em relação à normoxia. * P . 0,05 contra hipóxia

Para conhecer o mecanismo pelo qual AXT inibe a migração e tubo de formação de células endoteliais, analisamos a expressão de moléculas pró-angiogénicos em normóxica e 4 h, 8 h, e 16 h células hipóxica ECV. A análise de imunotransferência revelou um aumento na expressão de HIF1α 4 h que foi mantida até 8 h hipóxia. VEGF e expressão de MMP-2 aumentou de 8 h em diante e persistiu até 16 horas. O tratamento com o aumento induzido por hipoxia AXT reduzida na expressão dessas moléculas (Figura 10)

A Imunotransferência de B. representativos e gráfico de barras que representa a expressão de proteínas de HIF-1α, VEGF e MMP-2 durante pelo menos três experiências independentes. * P . 0,05 contra hipóxia

Discussão

Vários estudos têm documentado que a activação aberrante da via de sinalização STAT-3 contribui para a transformação neoplásica em várias malignidades, e validaram STAT- 3 como um alvo promissor para a terapia do cancro [11], [30], [31]. O desenvolvimento de agentes que têm como alvo STAT-3 com adequada potência e selectividade para o tumor tem provado ser uma tarefa difícil. Estudos realizados por outros e nos indicaram que os fitoquímicos estão envolvidos na quimioprevenção do câncer, modulando os circuitos de sinalização aberrante em câncer [32] – [35]. No presente estudo, foi demonstrado que inibe a astaxantina /STAT-3 via de sinalização de JAK, bem como os seus genes alvo no modelo de carcinoma da HBP.

As funções de proteína STAT-3 dependem principalmente da sua fosforilação e subcelular localização. Em células não estimuladas, as proteínas STAT-3 estão presentes sob a forma inactiva no citoplasma. A activação de STAT-3 ocorre por meio de fosforilação do seu resíduo de tirosina por sinalização do receptor de citocina ou factor de crescimento. STAT-3 fosforilado dimeriza e, em seguida, transloca-se para o núcleo onde se liga a IFN-gamma-activated local (gás) em DNA e activa a transcrição de genes alvo [12]. STAT-3 é encontrado para ser constitutivamente activa em diferentes carcinomas e inibição da ativação de STAT-3 correlaciona-se com a supressão de células malignas, tanto

in vitro

e

in vivo

[36], [37] . Os resultados do presente estudo fornecem evidências de que a suplementação de astaxantina ab-roga a activação constitutiva de STAT-3, impedindo a sua fosforilação e subsequente translocação nuclear. Além disso, a interacção de AXT com o local de dimerização de STAT-3 por estudos moleculares de ancoragem também valida a inibição de STAT-3 por AXT. A astaxantina foi demonstrado inibir rato células de carcinoma hepatocelular CBRH-7919 através da modulação da sinalização de JAK /STAT-3 [38].