Sumário

A capacidade migratória das células cancerosas é uma das características mais importantes que refletem potencial metastático. A ouabaína, um glicósido cardíaco endógena produzida pela glândula supra-renal, tem sido previamente reportado que possuem actividades anti-tumorais; no entanto, o seu papel na regulação da migração de células de câncer permanece desconhecida. O presente estudo revelou que o tratamento com ouabaína em concentrações fisiológicas é capaz de inibir as actividades migratórias de células H292 do cancro do pulmão humano. foram encontrados os efeitos negativos da ouabaína ser mediada através da supressão de proteínas reguladoras de migração, tais como quinase de adesão focal (FAK), tirosina quinase dependente de ATP (Akt) e divisão celular ciclo de 42 (Cdc42). Descobrimos que as ações observadas de ouabaína foram mediadas através de um mecanismo dependente de espécies reactivas de oxigénio (ROS) porque a adição de catadores de ERO (N-acetilcisteína e glutationa) poderia reverter o efeito da ouabaína sobre a migração celular. Além disso, foi mostrado ouabaína para inibir o crescimento do tumor esferoidal e diminuir a adesão de células de cancro de células endoteliais. No entanto, o composto não teve nenhum efeito significativo sobre as células de anoikis. Juntas, essas descobertas lançam uma luz sobre a compreensão da biologia da célula cancerosa, explorando a nova função dessa substância endógena humana

Citation:. Pongrakhananon V, Chunhacha P, Chanvorachote P (2013) ouabaína Suprime o comportamento migratório de Pulmão Células cancerosas. PLoS ONE 8 (7): e68623. doi: 10.1371 /journal.pone.0068623

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de fevereiro de 2013; Aceito: 30 de maio de 2013; Publicação: 10 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Pongrakhananon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Fundo de Investigação Tailândia e Fundo de Doações Ratchadaphiseksomphot. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a compreensão da base molecular das células cancerosas em resposta a substâncias biologicamente derivados é considerado uma ajuda essencial para a descoberta de novos alvos moleculares para drogas terapêuticas. A evidência substancial tem indicado que a ouabaína, um inibidor da bomba de sódio /potássio, está presente em plasma humano e de tecidos na gama de 0,002-0,77 nM de [1] – [3]. Além disso, a ouabaína verificou-se ser regulada para cima em diversas patologias, incluindo insuficiência cardíaca [1], [4], insuficiência renal [5] e hipertensão [3], [6]. Recentemente, nós fornecemos evidências indicando que a ouabaína sensibiliza fator de necrose tumoral relacionada com a indução de apoptose ligante (TRAIL) mediada por apoptose das células do cancro do pulmão, e esta constatação sugere que a ouabaína pode afetar a biologia da célula cancerosa [7].

no cancro do pulmão, metástases tornou-se mais interessante a área de pesquisa, porque a elevada taxa de mortalidade desta doença está associada com [8] metástase do cancro. Durante o espalhamento das células, as células cancerosas devem ter a capacidade de migrar dos seus locais originais no sistema circulatório nas proximidades. O aumento da atividade da quinase de quinase de adesão focal (FAK), a motilidade celular chave via de sinalização de controle, potencializa tumorigênese e metástase [9]. Tais alterações também foram encontrados durante o processo de aquisição de células cancerosas metastáticas [10], [11]. FAK controla a transdução de sinal a partir de locais de adesão focal enriquecido-integrina da interacção célula-matriz extracelular [12]. Em relação à regulação da migração de células cancerosas, a fosforilação de FAK em Tyr-397 e o recrutamento de cinases da família Src são processos importantes que iniciam a migração [12] – [13]. Além disso, o estado activado de vários reguladores migratórios, tais como tirosina-quinase dependente de ATP (Akt) e ciclo de divisão celular 42 (Cdc42) [14], [15] são essenciais para o processo de movimentação das células. Vários estudos indicaram que a activação de Akt melhora a capacidade das células cancerosas para migrar e invadem [15], [16]. Akt que está localizada na extremidade de células que se deslocam interage com as proteínas de ligação à actina e induz a remodelação da actina e a formação de saliências da membrana, o que facilita a mobilidade celular [15]. Este conceito foi confirmada por um estudo mostrando que a regulação da Akt usando uma técnica antisense provoca uma inibição dramática da invasão da célula cancerosa

in vitro

[17] e

in vivo

[18] . Além disso, tem sido mostrado a interacção da FAK e ERK1 /2 para controlar a motilidade celular [19] – [20]. Recentemente, a família Rho de pequenas trifosfatases guanosina (GTPases), especialmente Cdc42, tem sido demonstrado que desempenham um papel essencial na reorganização de actina e formação de filopodia. O nível de expressão Cdc42 verificou-se ser regulada para cima em muitos cancros, incluindo cancro do pulmão [21] – [22], e a indução Cdc42 foi mostrada para aumentar a migração do cancro [23]

Até agora, o papel. dos níveis endógenos de ouabaína na regulação da motilidade das células de cancro tem sido amplamente desconhecida, e tal compreensão poderia conduzir a terapias anti-cancro novos. Portanto, nosso objetivo foi investigar o possível impacto desta substância biológica sobre a migração de células cancerosas e invasão em células de câncer de pulmão de células não-pequenas. Pela primeira vez, que mostram que os níveis endógenos de ouabaína suprimir a motilidade das células de tumor e estão associados com a diminuição da activação da FAK e Akt e expressão de Cdc42. Nosso estudo sugere a hipótese de romance que esta substância fisiológica tem um papel regulador negativo no processo de metástase de células cancerígenas.

Materiais e Métodos

Células e Reagentes

O não- linhas celulares de cancro do pulmão de células pequenas (NSCLC) H292 e H460 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina e 100 unidades /mL de penicilina /estreptomicina. As células foram incubadas em 5% de CO

2 ambiente a 37 ° C. A ouabaína, diacetato de diclorofluoresceína (DCFH

2-DA), poli 2-hidroxietilo (HEMA poli-), 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) e faloidina isotiocianato de tetrametilrodamina B foram obtidos a partir de Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO). O iodeto de propídio (PI) e Hoechst 33342 foram obtidas a partir de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Anticorpos para pan-Akt, Akt-P473, FAK, P397-FAK, Cdc42, caveolin-1 e β-actina, assim como anticorpos secundários conjugados com peroxidase foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA).

viabilidade celular e apoptose Ensaios

a viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio MTT. Após os tratamentos indicados, as células foram incubadas com 500 ug /ml de MTT a 37 ° C durante 4 h. Uma leitura da intensidade do produto MTT foi medida a 550 nm utilizando um leitor de microplacas, e a percentagem de células viáveis ​​foi calculada em relação às células de controlo. A apoptose foi determinada pela Hoechst 33342 /coloração PI e análise de conteúdo de DNA. As células foram lavadas e incubadas com 10 ug /ml de Hoechst 33342 e 5 ug /ml de PI durante 30 min. Núcleos de condensação e fragmentação do DNA de células apoptóticas e células necróticas PI-positivos foram visualizados e marcado por microscopia de fluorescência (Olympus IX51 com DP70). Para a análise do conteúdo de ADN sub G0, após o tratamento indicado, as células foram tripsinizadas, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixadas em etanol a 70% a 37 ° C durante 3 h. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato, as células foram incubadas numa solução contendo 0,1% de PI Triton-X, 1 ug /ml de RNase e 1 mg /ml de iodeto de propídio à temperatura ambiente durante 30 min. O teor de ADN foi analisada através de citometria de fluxo (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ).

ROS Detecção

os níveis intracelulares de ROS foi determinada por citometria de fluxo utilizando DCFH-DA, como uma sonda fluorescente. Resumidamente, as células foram incubadas com 10 uM DCFH

2-DA, durante 30 min a 37 ° C, após o que foram lavadas, tratadas com tripsina, ressuspendidas em solução salina tamponada com fosfato, e imediatamente analisados ​​para a intensidade de fluorescência por um leitor de microplacas.

Migration Assay

A migração foi determinada por ensaios de cura e transpo� feridas. Para o ensaio de cicatrização da ferida, uma monocamada de células foi cultivada numa placa de 24 poços, e um espaço da ferida foi feito com uma ponta de 1 mm de largura. Após lavagem com PBS, as monocamadas de células foram incubadas com os tratamentos indicados e deixadas migrar durante 24 h. Micrografias foram tiradas sob um microscópio de contraste de fase (Olympus DP70, Melville, NY), e os espaços feridas foram medidos a partir de 10 campos aleatórios de vista usando o software controlador Olympus DP. A análise quantitativa da migração das células foi realizada utilizando um espaço de ferida média desses campos aleatórios de vista, e a percentagem de alteração no espaço da ferida foi calculada utilizando a seguinte fórmula:% de variação = (espaço médio no tempo 0 h) – (espaço médio no momento 24 h) /(espaço médio no tempo 0 h) × 100. migração celular relativa foi calculada dividindo a mudança percentual no espaço da ferida de células tratadas por esse das células de controlo em cada experiência. Para o ensaio Transwell, as células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

4 células /poço para a câmara superior de um Transwell (8 tamanho de poro) de uma placa de 24 poços em meio isento de soro e incubadas com várias concentrações da ouabaína. meio RPMI contendo FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior. Após a incubação, as células que não migraram na câmara superior foram removidas por raspagem algodão-zaragatoa, e as células que migraram para o lado inferior da membrana foram coradas com 10 ug /ml de Hoechst 33342 durante 10 min e visualizados e teve sob microscópio de fluorescência (Olympus IX51 com DP70).

Invasion ensaio

um ensaio de invasão foi realizada usando um de 24 poços transpoço unidade com policarbonato (PVDF) filtros (8 tamanho de poro). A membrana foi revestida com 0,5% de matrigel sobre a superfície superior da câmara durante a noite a 37 ° C numa incubadora humidif içada. As células foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10

4 culas por po para a câmara superior da unidade de Transwell em meio isento de soro. Meio contendo FBS a 10% foi adicionado para a câmara inferior do aparelho. Após incubação com os agentes de teste específicos durante 24 h a 37 ° C, o meio na câmara superior foram aspirados e as células no lado superior da membrana foram removidos com um cotonete. As células que invadiram a parte inferior da membrana foram coradas com 10 ug /ml de Hoechst 33342 durante 10 min, e teve visualizados sob um microscópio de fluorescência.

Morfologia celular e filopodia Caracterização

morfologia celular foi investigada por um ensaio de faloidina-rodamina B e coloração com sulforodamina. As células foram semeadas a uma densidade de 10

4 células /poço numa placa de 96 poços durante a noite. As células foram tratadas com várias concentrações de ouabaína durante 24 h. As células foram então lavadas com PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min a 37

° C

, permeabilizadas com 0,1% de Triton-X100 em PBS durante 4 minutos, e bloqueadas com BSA a 0,2% durante 30 min. Em seguida, as células foram incubadas com 1:100 faloidina com rodamina em PBS ou 0,4% de sulforrodamina B em ácido acético a 1% durante 15 min, lavadas 3 vezes com PBS e montadas com glicerol a 50%. A morfologia celular foi então avaliada por imagiologia fluorescente (Olympus IX51 com DP70). protrusão filopódios foi representado como o número médio de filopódios /célula em relação a células não tratadas em cada campo.

In vitro 3D Tumorigênese Ensaio

In vitro tumorigênese 3D foi realizada em um revestido com matrigel 96- bem placa. A placa foi revestido com 0,5% de matrigel e partiu para a solidificação durante a noite a 37

°

C. As células foram suspensas em meio de cultura contendo 4% de Matrigel e ouabaína (0-30 pM), e colocadas em placas a uma densidade de 10

3 células /cavidade em uma placa revestida com Matrigel. Meio contendo ouabaína (0-30 pM) foi substituído a cada 3 dias. Após 10 dias, as células foram visualizadas e marcado por analisador de imagem ao microscópio.

anoikis Ensaio

Para avaliação anoikis, cultura de tecidos placas de seis poços foram revestidas com 6 mg /ml de poli (2 placas -hidroxietil-metacrilato (poli-HEMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em etanol a 95% e incubou-se a 37 ° C durante a secagem. H292 células foram plaqueadas em poli-HEMA-revestidas em meio RPMI contendo tratamentos indicados para 0-24 h. Após a incubação com 10 ug /ml de Hoechst 33342 durante 30 min, a condensação núcleos e fragmentação de ADN de células anoikis foram visualizados e marcado por microscopia de fluorescência (Olympus IX51 com DP70).

Anchorage-independente ensaio de crescimento

crescimento

Anchorage-independente foi determinada pelo ensaio de formação de colónia em agar mole. Resumidamente, as células de 6 poços culturas em monocamada placa foram preparadas para uma suspensão de uma única célula. As células foram suspensas em meio RPMI contendo 10% de FBS e 0,33% de agarose de baixa temperatura de fusão, e 2 × 10

4 células foram plaqueadas numa placa de 35 mm por cima uma camada de solidificou RPMI /FBS a 10% /0,6% de agarose. As células foram alimentadas de três em três dias por adição de 200 ul de RPMI /FBS a 10%. As colónias foram coradas utilizando 10 ug /ml Hoechst 33342 durante 30 min, visualizados e marcado por analisador de imagem sob o microscópio fluorescente (Olympus IX51 com DP70).

monocamada de células Ensaio de aderência de

HUV-CE- C foram estimuladas com 10 ng /ml de IL-1β por 0-4 h. Após tratamento indicado, H292 células (2,5 x 10

4 células /ml) foram adicionados para uma cultura em monocamada semi- confluente de HUV-EC-C, incubadas durante 20 min a 37 ° C com rotação a 120 rpm, e lavada extensivamente para excluir a ligação de células não específicas. O número de células ligadas foi contada directamente sob um microscópio de fluorescência.

Western Blotting

Depois de tratamentos específicos, as células foram incubadas em tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), 1 % de Triton X-100, cloreto de sódio 150 mM, 10% de glicerol, 1 mM de ortovanadato de sódio, fluoreto de sódio 50 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 100 mM e um cocktail de inibidor de protease comercial (Roche Molecular Biochemicals) durante 30 min em gelo. Os lisados ​​de células foram recolhidas, e o teor de proteína foi determinada utilizando o método Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Quantidades iguais de proteína de cada amostra (60 ug) foram desnaturadas por aquecimento a 95 ° C durante 5 min com tampão de carga Laemmli e, subsequentemente, carregou-se um gel de SDS-poliacrilamida a 10%. Após separação, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose de 0,45 ^ m (Bio-Rad). As membranas transferidas foram bloqueadas durante 1 h em leite seco magro a 5% em TBST (Tris-HCl 25 (pH 7,5), NaCl 125 mM, 0,05% de Tween 20) e incubadas com os anticorpos primários apropriados a 4 ° C durante a noite. As membranas foram lavadas duas vezes com TBST, durante 10 min e incubaram-se com anticorpos secundários específicos do isotipo acoplado peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. Os complexos imunitários foram detectados mediante o reforço com um substrato de quimioluminescência. (Supersignal West Pico; Pierce) e quantificada utilizando software Analyst /PC densitometria (Bio-Rad)

Análise estatística

Os dados médios de independente experimentos foram normalizados com os resultados a partir de células no grupo de controlo. Todas as experiências foram repetidas, pelo menos, quatro vezes. A análise estatística entre os dois grupos foi verificada pelo teste t de Student, e comparar a vários grupos, foi realizada uma análise de variância (ANOVA) com um teste de post-hoc. A P-valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Característica migratório de não-pequenas células do cancro do pulmão H292 células

Para testar o efeito da ouabaína em migração de células do cancro do pulmão, nós caracterizado pela primeira vez o perfil de migração de células H292 usando a migração ferida e transpo� ensaios. As Figs. 1A e B mostram que as células H292 migraram através do espaço da ferida de um modo dependente do tempo, e os resultados foram consistentes com os obtidos a partir do ensaio de migração Transwell

A:. Monocamadas confluentes de células H292 foram feridos usando um -1-mm de largura ponta e deixadas migrar durante 0-24 h. O espaço da ferida foi visualizado sob um microscópio, e os níveis relativos de migração em comparação com o ponto de tempo 0 h foram calculados. Os dados representam as médias ± DP (n = 4). *

P Art 0,05 vs. valor no ponto de tempo 0 h. B: a migração celular H292 foi examinada através de um ensaio Transwell de 0-24 h. células migratórias no lado basolateral da membrana foram coradas com Hoechst 33342 durante 30 min e visualizados sob um microscópio de fluorescência. Os dados foram representados como uma média do número de células em cada campo e representam as médias ± DP (n = 4). *

P Art 0,05 vs. valor a 0 h ponto de tempo. C: As células H292 foram tratados com várias concentrações de ouabaína (0-5,000 pM) durante 24 h. A sobrevivência celular foi determinada por um grupo 3- (4,5-dimethly-tiazol-2-il) brometo de tetrazólio de ensaio (MTT) -2,5-difenil. A viabilidade de células não tratadas foi representado como 100%. Os dados representam as médias ± DP (n = 4). *

P

0,05 vs. células de controlo não tratados. D: A morte celular apoptótica foi avaliada usando Hoechst 33342 coloração. Os dados representam as médias ± DP (n = 4). *

P

0,05 vs. células de controlo não tratados. E:. Apoptose celular foi determinada por análise de conteúdo de ADN por citometria de fluxo

Em seguida, uma experiência de citotoxicidade foi realizado para testar se as concentrações biológicas da ouabaína afectar a viabilidade celular H292. As células foram cultivadas na ausência ou na presença de ouabaina (10-5000 pM), e a viabilidade das células foi determinada utilizando um ensaio de MTT às 24 h. Os resultados indicam que as concentrações de ouabaína em níveis endógenos (2-770 pM) causou efeitos tóxicos nem proliferativas nestas células de cancro do pulmão (Fig. 1C). Enquanto as concentrações desta substância até 1000 nM não induziu apoptose, 5000 nM ouabaína reduziu significativamente a viabilidade celular (Fig. 1 C) e a morte celular mediada detectada por um ensaio de coloração Hoechst 33342 nuclear (Fig. 1D). Além disso, as células foram tratadas com 0-500 pM ouabaína durante 24 h, e as células foram sujeitas a citometria de fluxo para a sub L

0 determinação fracção. FIG. 1E mostra que o tratamento das células com 10-500 pM ouabaína não causou qualquer alteração significativa da sub L

0 fracção em comparação com a das células de controlo não tratadas. Estes resultados sugerem que as concentrações da ouabaína encontrados no plasma humano e os tecidos não afetam a viabilidade das células H292.

ouabaína Inibe Lung Cancer migração e invasão celular

concentrações endógenas de ouabaína foram ainda testados para seu possível efeito sobre a migração de células cancerosas. As células foram tratadas com ouabaína 0-30 pM e utilizados em ensaios de migração durante 24 h. Um ensaio de migração ferida mostraram que a ouabaína suprimida a migração de células H292 de uma forma dependente da dose em comparação com as células de controlo não tratadas (Fig. 2a). Na concentração de 20 pM, ouabaína causou uma redução aproximada de 50% na actividade migratória das células. Além disso, o ensaio de migração Transwell fornecida apoio dados indicando que a ouabaína significativamente inibiu a migração de células (Fig. 2B). Embora os mecanismos e regulação da migração de células de cancro e invasão não são completamente conhecidos definidos, estudos sugeriram que existem vias de sinalização associada [24]. O efeito de ouabaína sobre o potencial invasivo das células cancerosas foi ainda testado usando um ensaio Transwell revestidas com matriz extracelular. As células foram adicionadas ao Transwell e tratou-se com as concentrações indicadas de ouabaína durante 24 h. FIG. 2C mostra que o tratamento ouabaína reduziu substancialmente o número de células H292 invadidos em comparação com células de controlo não tratadas com uma redução aproximada de 50% encontrada em resposta à ouabaina 20 pM

a:. Monocamadas confluentes de células H292 foram feridos utilizando uma mistura 1 -mm ponta de largura e incubadas com ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. O espaço da ferida foi analisado e representado como o grau de migração em relação à mudança das células não tratadas. B: células migratórias foram corados com Hoechst 33342 durante 30 min, visualizados sob um microscópio de fluorescência e representado como um número médio de células em cada campo. C: invasão celular foi avaliada utilizando um Transwell revestido com matrigel, como descrito em

Materiais e Métodos

. Após 24 h, as células que invadiram através da membrana foram visualizados sob um microscópio de fluorescência e representado como um número médio de células em cada campo. Os dados representam as médias ± DP (n = 4). *

P

. 0,05 vs. células de controlo não tratados

A ouabaína reduz a formação de filopódios em células H292

Plasma saliências membrana chamada aumento filopódios durante o movimento celular e a formação de filopodia está envolvido na migração de células de cancro e metástase [25]. Tendo mostrado que a ouabaína inibiu a migração e a invasão das células, investigou ainda mais o efeito desta substância sobre a presença de filopios em células H292. As células foram cultivadas na presença ou ausência de ouabaína (30 pM), durante 24 h, e a saliência foi capturado sob filopios de fluorescência e de contraste de fase modos de microscópio utilizando ensaios faloidina e sulforodamina B, respectivamente. FIG. 3A mostra que as células H292 do estado de movimento exibiram um número substancial de filopios saliências que foi dramaticamente reduzido em resposta aos tratamentos ouabaína. Estes resultados sugerem que a redução de filopios em que as células podem, pelo menos em parte, desempenham um papel no papel regulador negativo da ouabaína. evidência suficiente indicou que a formação de filopios em células de cancro envolve a proteína Cdc42 [26] – [28]. Uma vez que o nível de expressão foi mostrada Cdc42 para ser estreitamente associada com a formação de filopodia, investigou ainda mais o mecanismo de ouabaína na regulação de filopios nestas células através da determinação da expressão celular de Cdc42. Os resultados indicam que o nível de expressão Cdc42 diminuiu acentuadamente em resposta a tratamentos de ouabaína (Fig. 3B). Embora um nível adequado desta proteína foi detectada em células não tratadas, 30 pM de ouabaína quase aboliu a expressão Cdc42. Esta informação sugere que a ouabaína pode reduzir a actividade de migração destas células através de Cdc42 atenuação

A:. As células H292 foram tratados com 30 pM de ouabaína (OB) ou deixada sem tratamento como controlo células durante 24 h. As células foram coradas com sulforodamina B ou faloidina e visualizados sob um microscópio de fluorescência a 40 ×. filopodia saliências estão indicados por setas e são representadas como o número médio de filopios por célula em cada campo em relação às células não tratadas. Os dados representam as médias ± DP (n = 4). *

P

0,05 vs. células de controlo não tratados. B: Após o tratamento indicado, as células foram recolhidas e analisadas para o ciclo de divisão celular de 42 expressão (Cdc42) por transferência de Western. As manchas foram sondado com β-actina para confirmar o carregamento igual. Os sinais de imunotransferência foram quantificadas por densitometria e as médias dos dados obtidos em experiências independentes foram normalizados com os resultados. As barras são as médias ± DP (n = 4). *

P

. 0,05 vs. células de controlo não tratados

A ouabaína reduz a ativação da FAK, Akt e ERK através de um mecanismo ROS-dependente

Para elucidar os mecanismos de inibição da motilidade de células de cancro por ouabaína, o presente estudo determinou-se a expressão e os níveis activados de proteínas envolvidos na migração de células. As células foram tratadas com concentrações não tóxicas de ouabaína ou deixado sem tratamento, e Akt, Akt activada (fosforilada Akt em Ser473) [29], FAK, activado FAK (FAK fosforilada no Tyr-397) [24] e os níveis de Cav-1 foram determinados por análise de western blot. FIG. 4 mostra que o tratamento das células com ouabaína (0-30 pM) substancialmente regulada negativamente a expressão de Akt activado e activado FAK preservando ao mesmo tempo os seus homólogos não-activadas. Estes resultados sugerem que a ouabaína interferiu com o nível activado das proteínas e, possivelmente, a migração celular e invasão regulado através da inibição da Akt e FAK vias a jusante. Recentemente, nós e outros têm indicado o papel considerável de Cav-1 no cancro do pulmão invasivo e atividades migratórias. Nós ainda testado se ouabaína atenua motilidade celular através de níveis diminuídos Cav-1. Inesperadamente, o nível de Cav-1 em resposta ao tratamento ouabaína não foi alterada (Fig. 4)

A:. As células H292 foram tratados com ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. As células foram recolhidas e analisadas quanto a quinase de adesão focal (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr397), tirosina-cinase dependente de ATP (Akt), fosfo-Akt (p-AKT, Ser473), e caveolin-1 ( CAV-1) a expressão através de Western blotting. As manchas foram sondado com β-actina para confirmar o carregamento igual. B: Os sinais de imunotransferência foram quantificadas por densitometria e as médias dos dados obtidos em experiências independentes foram normalizados com os resultados. As barras são as médias ± DP (n = 4). *

P

. 0,05 vs. células de controlo não tratados

Nós mostramos que a migração de células cancerosas é fortemente associado com o estado oxidativo das células. Os dados anteriores indicaram que a actividade migratória das células cancerosas foi significativamente atenuada em resposta aos tratamentos antioxidantes [30]. Para esclarecer o efeito de regulação possível da ouabaína, neste contexto, as células foram tratadas com anti-oxidantes, na presença ou ausência de ouabaína e o seu comportamento migratório e os níveis de ROS celulares foram avaliadas. As Figs. 5A e 5B mostram que o tratamento com os antioxidantes conhecidos glutationa (GSH) e N-acetilcisteína (NAC) de células-permeável aumentou significativamente a migração das células tratadas com ouabaína, confirmando o papel de ROS na actividade migratória das células que é suprimida pela ouabaína . Além disso, os níveis de ROS intracelulares foram determinados nas células incubadas com ouabaina, a GSH, e NAC. ROS detectada por uma sonda específica oxidativo celular mostrou que as ROS aumentada em resposta a tratamentos de ouabaína (10-30 pM), em comparação com o controlo não tratado, enquanto que nem NAC nem GSH sozinho tinha um efeito sobre a motilidade celular, quer os níveis de ROS ou endógenos. Importante, a adição de NAC e de GSH nas células tratadas com ouabaína suprimiu significativamente a produção de ROS desencadeada por ouabaína (Fig. 1C). Além disso, nós fornecemos uma ligação entre ROS celular e o estado de activação da Akt e FAK. As células foram pré-tratados com GSH ou NAC na presença ou ausência de ouabaína e os níveis de Akt, Akt activado, FAK e FAK activada foram determinados como descrito acima. Os resultados indicam que a administração dos antioxidantes reverteu o efeito de regulação para baixo de ouabaína em Akt e activado activado FAK, enquanto que as formas não fosforiladas de ambas as proteínas não foi afectada (Fig. 6). Estes achados não só fornecem evidência de um efeito pró-oxidante da ouabaína, mas eles também indicam a possível mecanismo de ouabaína para inibir a migração celular através de um mecanismo ROS-dependente

A:. Monocamadas confluentes de células H292 foram feridos usando uma ponta de 1 mm de largura e incubadas com anti-oxidantes, glutationa 1 mM de células-permeável (GSH) ou 5 mM de N-acetilcisteína (NAC), na presença ou ausência de ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. O espaço da ferida foi analisado e representado como o grau de migração em relação à mudança das células não tratadas. B: A migração celular foi capturada usando um microscópio. C: As células foram pré-tratados com GSH 1 mM ou 5 mM de NAC durante 30 min na presença ou ausência de ouabaína 30 pM ou ouabaína (0-30 pM) sozinho por 0-3 h. As células foram então incubadas com diclorofluoresceína diacetato (DCFH

2-DA), durante 30 min, e a intensidade da fluorescência foi analisada por um leitor de microplacas. A intensidade média foi normalizado para células de controlo não tratados e representada como os níveis relativos de ROS. Os pontos de dados são médias ± DP (n = 4). *

P

0,05 vs. células de controlo não tratados.

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P Art 0,05 vs. células tratadas com ouabaína 30h

A: células H292 foram pré-tratados com GSH mM 1 ou NAC 5 mM durante 30 minutos. na presença ou ausência de ouabaína (30 pM), durante 24 h. As células foram recolhidas e analisadas para a quinase de adesão focal (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), tirosina-cinase dependente de ATP (Akt) e expressão de fosfo-Akt (p-AKT, Ser-473) western blotting. As manchas foram sondado com β-actina para confirmar o carregamento igual. B: Os sinais de imunotransferência foram quantificadas por densitometria e as médias dos dados obtidos em experiências independentes foram normalizados com os resultados. As barras são as médias ± DP (n = 4). *

P

. 0,05 vs. células de controlo não tratados

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P

. 0,05 vs. 30 Pm células tratadas com ouabaína

A ouabaína reduz migração e invasão de NSCLC células H460

para testar se ouabaína foi capaz de inibir a migração em outras células do cancro do pulmão, nós tratamos a linhagem humana de não-pequenas células do pulmão de células de câncer H460 com ouabaína (0-30 pM) e as células submetidas a um ensaio de migração. Notavelmente, os resultados do MTT, utilizando as células H460 indicaram que o tratamento com ouabaína em 0-30 pM causou qualquer efeito significativo sobre a viabilidade das células (dados não apresentados). Consistente com os resultados obtidos a partir das células H292, o tratamento das células com H460 ouabaina às concentrações indicadas de migração celular significativamente atenuada de uma maneira dependente da dose (Fig. 7A). Além disso, determinou-se a expressão de proteínas e suas contrapartes activadas. resultados de transferência Western indicaram que o tratamento com ouabaína semelhante alterado activado Akt, ativado FAK, e ativado ERK, enquanto as proteínas não-activado e Cav-1 níveis não foram afetados pelo tratamento (Fig. 7B).

A : monocamadas confluentes de células H460 foram feridos usando uma ponta de 1 mm de largura e incubadas com ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. O espaço da ferida foi analisado e representado como o grau de migração em relação à mudança das células não tratadas. Os dados são as médias ± DP (n = 4). *

P

0,05 vs. células de controlo não tratados. B. Sob as mesmas condições de tratamento, as células foram recolhidas e analisadas quanto a quinase de adesão focal (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), tirosina-cinase dependente de ATP (Akt), fosfo-Akt (P- AKT, Ser-473) e a expressão por Western blotting caveolin-1 (CAV-1). As manchas foram sondado com β-actina para confirmar o carregamento igual. Os sinais de imunotransferência foram quantificadas por densitometria e as médias dos dados obtidos em experiências independentes foram normalizados com os resultados. As barras são as médias ± DP (n = 4). *

P

. 0,05 vs. células de controlo não tratados

A ouabaína Suprime Tumor Crescimento em Tumor 3D Spheroid Estado e inibe descolamento celular

Tendo mostrado o papel de ouabaína na migração de células cancerosas, o próximo investigou a regulação potencial de metástase do câncer por ouabaína.