Abstract

O complexo de partículas proteína tráfico 4 (TRAPPC4) está implicado no transporte mediado por vesícula, mas a sua associação com a doença tem sido raramente relatada. Nós exploramos a sua interacção potencial com ERK2, parte da ERK1 /2 complexo na proteína extracelular sinal-regulada Quinase /Mitogen-activated Quinase (ERK-MAPK), por uma levedura rastreio de dois híbridos e confirmada por co-imunoprecipitação (Co -IP) e glutationa S-transferase (GST) suspenso. Outras investigações verificaram que quando TRAPPC4 foi empobrecido, ERK1 activado /2 diminuiu especificamente no núcleo, que foi acompanhada com a supressão do crescimento celular e a apoptose em células de cancro colo-rectal (CRC). A sobre-expressão de TRAPPC4 promovido a viabilidade celular e causou activada de ERK1 /2 para aumentar em geral, mas especialmente no núcleo. TRAPPC4 foi expressa mais altamente no núcleo de células de CRC que no epitélio do cólon normal ou adenoma que correspondeu com coloração nuclear de pErk1 /2. Nós demonstramos aqui que TRAPPC4 podem regular a proliferação celular e a apoptose em CRC por interacção com ERK2 e, subsequentemente, a fosforilação de ERK1 /2, bem como modulando a localização subcelular de pErk1 /2 para activar a via de sinalização relevante

citação:. Zhao SL, Hong J, Xie ZQ, Tang JT, Su WY, Du W, et al. (2011) Interação TRAPPC4-ERK2 Ativa ERK1 /2, modela-localização nuclear e regula a proliferação e apoptose das células de cancro colorrectal. PLoS ONE 6 (8): e23262. doi: 10.1371 /journal.pone.0023262

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de maio de 2011; Aceite: 10 de julho de 2011; Publicação: 03 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural do Programa de Key (No. 30.830.055) para J-YF (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm) e pelas doações da Ciência Natural Nacional Fundação do Programa Juventude para S-LZ (No. 31.000.634) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Comissão de Xangai para Ciência e Tecnologia para S-LZ (No. 10ZR1419000) (http : //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm), Shanghai Serviços de Saúde para os jovens S-LZ (No. 2.009.032) (https://wsj.sh.gov.cn/website/), Xangai Escola de Jiao-Tong University of Medicine Foundation para a Ciência e Tecnologia para S-LZ (09XJ21065) (https://www.shsmu.edu.cn/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

TRAPPC4, o ortólogo humano de Trs23p levedura, também conhecido como synbindin, é geralmente conhecido como uma proteína citoplasmática neuronal originalmente identificada pela levedura rastreio de dois híbridos utilizando o sindecano-2 (que pertence a uma família de superfície celular proteoglicanos de sulfato de heparano que regula o comportamento de células através de vias de transdução de sinal [1], [2], [3]) domínio citoplasmático como isca [4]. É considerado um ligando fisiológico de sindecam-2 em espinhas dendríticas que está envolvido na 2 sindecam-formação da coluna induzida pelo recrutamento de vesículas intracelulares para locais pós-sinápticos em neurónios do hipocampo de ratos. TRAPPC4 tem sido detectada em células estaminais /progenitoras hematopoéticas CD34 + (hspCs) e, portanto, é também conhecido como HSPC172.

TRAPPC4 como um membro da partícula proteína tráfico (TRAPP) da família de proteínas está implicado no transporte mediado por vesícula , um processo levado a cabo por praticamente todas as células e é necessário para a orientação correcta e a secreção de proteínas. Actualmente, existem 10 subunidades TRAPP levedura conhecidos (Bet5p, 3p, Trs20p, 23p, 31p, 33p, 65p, 85p, 120p, 130º-P) e eucariontes superiores têm orthologs para oito deles (TRAPPC1~5,6a, 6b, 8,9) [5]. Juntos, eles formam dois tipos de complexos mutisubunit: TRAPP I e II TRAPP. Nas leveduras, estes complexos de função num certo número de processos, incluindo o transporte retículo endoplasmático-a-Golgi (TRAPP I) e um passo mal definida na rede trans-Golgi (TRAPP II) [6], [7], [8] . Os estudos em células normais de rim de rato (NRK) e as células HeLa mostraram também que o complexo TRAPP desempenha um papel durante o transporte RE-Golgi [9], [10]. O domínio PDZL em TRAPPC4 é uma das características mais únicas do complexo vertebrado, quando comparado com levedura TRAPP I. A disfunção de subunidades TRAPP têm sido implicados em doenças humanas. Mutações em TRAPPC1 (MUM-2) foram relatados para resultar na expressão de péptidos antigénicos em melanoma [11], e as mutações em TRAPPC2 (sedlin) têm sido associados a Spondyloepiphyseal tarda displasia (SEDT) [12]. No entanto, o papel de TRAPPC4 na doença tem sido pouco estudada.

O câncer colorretal (CRC) é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo [13]. carcinogénese colorectal é um processo complexo de múltiplos passos que envolve a ruptura progressiva dos mecanismos de proliferação de células intestinais epiteliais, apoptose, diferenciação e sobrevivência [14]. A proteína Cinase /Mitogen-activated Sinal Extracelular regulada Quinase (ERK-MAPK) é um dos mais importantes vias de transdução de sinal para a fisiologia celular, e vários factores de crescimento essenciais e proto-oncogenes promover o crescimento e a diferenciação através desta cascata [15] . Após a activação, o complexo de ERK1 /2 migra para o núcleo onde se fosforila vários factores de transcrição que regulam genes para aumentar a proliferação celular e modulam a apoptose das células [16]. No entanto, os mecanismos detalhados de ativação e translocação nuclear de ERK1 /2 não foram totalmente esclarecidas.

No estudo atual, uma tela de levedura de dois híbridos foi realizada para identificar ERK1 e ERK2 proteínas de ligação. TRAPPC4 foi encontrado para se ligar com ERK2. Foi confirmada a interação e investigado o papel da interação TRAPPC4-ERK2 no CRC.

Resultados

TRAPPC4 foi identificado como um fator-interagindo ERK2 pelo sistema de duplo híbrido

a fosforilação e a entrada nuclear de ERK1 /2 é crítico para a activação da via de ERK-MAPK. Para identificar os factores relacionados com o processo, uma tela de levedura de dois híbridos foi realizada com a ERK1 e ERK2 como iscas (comprimento total), em conjunto com uma biblioteca de cDNA de HeLa MATCHMAKER humano. Das colónias que crescem em Leu-Trp-Seus pratos que foram selecionados, 57/61 foram positivos para ERK2 e 12/32 para ERK1 em um ensaio de ß-galactosidase. Os plasmídeos a partir destas colónias positivas foram extraídos, amplificados em bactérias e co-transformado novamente em levedura, juntamente com os plasmídeos de isco para mais ensaios por ensaio de beta-galactosidase. Onze clones foram confirmados para ter uma interacção positiva com ERK2 e doze com ERK1. Entre estes plasmídeos que foram hits positivos para ERK2 e ERK1, TRAPPC4 foi identificado em cinco e seis das sequências, respectivamente, após o seqüenciamento. Esta foi a primeira vez que TRAPPC4 foi identificado como um potencial proteína interagindo de ERK2.

Validação da interação TRAPPC4-ERK2

Para confirmar ainda mais a interação entre TRAPPC4 e ERK2, co-imunoprecipitação e foram realizados experimentos de GST pull-down. Para a co-imunoprecipitação, ADNc TRAPPC4 de comprimento completo foi obtido e clonado em pCDEF-Myc, enquanto que a sequência de ERK2 foi clonado pCDEF-Flag. Os vectores pCDEF-Myc-TRAPPC4 e pCDEF-Flag-ERK2 resultantes foram validados por sequenciação e co-transfectado para a linha celular 293T. A análise de transferência de Western (Fig. 1A) mostrou que os plasmídeos poderia expressaram níveis significativos de proteínas. Depois, utilizando um anticorpo anti-myc para o co-imunoprecipitação, tanto a banda e ERK2-bandeira banda TRAPPC4-myc foram detectadas a partir das células co-transfectadas pCDEF-Myc-TRAPPC4 e pCDEF-Flag-ERK2, indicando que há uma interacção entre TRAPPC4 e ERK2. Na amostra de controlo positivo com o co-transfectadas pCDEF-Myc-p16 e vectores pCDEF-Flag-TSSK1, tanto a banda banda p16-Myc e TSSK-bandeira foram detectados, o que indica que as proteínas podem ser co-imunoprecipitada pelo nosso protocolo baseado a interação conhecida entre p16 e TSSK1. Apenas a banda TRAPPC4-myc foi detectado quando pCDEF-Myc-TRAPPC4 foi co-transfectada com um vector de bandeira vazia, enquanto nenhuma banda foi detectada quando pCDEF-Flag-ERK2 foi co-transfectado com o vector vazio de Myc, o que sugere que as interacções observadas supra são específicas e não mediada pelas tags de proteína

a:. Co-imunoprecipitação de TRAPPC4 e ERK2. As células 293T foram transfectadas com o vector pcDNA vazio ou vector pcDNA para expressar Bandeira com etiquetas ERK2 (42 kD), ou com etiquetas TRAPPC4 Myc (26 kD). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunoprecipitação com anticorpos anti-Flag-HRP ou anticorpo anti-myc-HRP. A presença de ERK2-Flag e TRAPPC4-Myc em extractos celulares antes da imunoprecipitação foi controlada utilizando anticorpos anti-Myc anti-Flag e (Entrada). Co-transfecção de vectores de expressão de p16-Myc e TSSK1-FLAG foi utilizado para o controlo positivo (Pista 1). B: Os resultados representativos das experiências de validação pulldown de GST. (A) Análise de imunotransferência da GST, e proteínas GST-ERK2 utilizados como controlo negativo (pista 2) e isca (lane3) para o ensaio suspenso. As proteínas foram detectadas utilizando anti-6 × SUA anticorpo seguinte SDS-PAGE e transferência de membrana. A pista 1 mostrou o controlo em branco sem GST ou GST-ERK2. (B) ERK2 expressa como uma proteína de fusão GST a partir de bactérias foi ligada a esferas e incubadas com TRAPPC4 expressa como 6 × proteína de fusão His-TRAPPC4 para um experimento suspenso. proteína GST-ERK2 (lane1), proteína GST (lane2) e proteína TRAPPC4 (Lane4) foram detectadas por coloração com Coomassie. Lane3 mostrou o marcador.

Como é possível que a interacção TRAPPC4 e ERK2 pode ser indirecta, porque outros factores proteicos em todo o extracto celular podem estar envolvidos na mediação da interacção, e.g. actuando como factores «ponte», o próximo analisou uma possível interação direta entre as duas proteínas utilizando GST ensaios suspensos. TRAPPC4 foi puxada para baixo com as proteínas de fusão GST-ERK2 (Fig. 1B, pista c), mas não com a GST isolada (Fig. 1B, pista b), indicando que TRAPPC4 e ERK2 especificamente e directamente interagiram

In vitro

.

TRAPPC4 regula ERK1 2 fosforilação /na linha celular SW1116

a fosforilação de ERK1 /2 é um passo crítico na via de sinalização ERK. Agora que tinham mostrado que TRAPPC4 interagiu com ERK2, nós próxima analisou a contribuição relativa da TRAPPC4 em ERK1 /2 fosforilação. Depois de reduzir o nível de TRAPPC4 expressão em células SW1116 por RNAi ou sobre-expressando-o por transfecção de um plasmídeo que codifica o gene de comprimento completo, determinou-se a alteração nos níveis de pERK por Western blotting. Detecção de GAPDH foi usada como um controlo de carga. Embora não houvesse diferenças observadas nos níveis de proteína total de de ERK1 /2 em todos os grupos (Fig. 2), o nível de fosforilação de ERK1 /2 foi regulada para baixo depois de siRNA mediada por depleção de TRAPPC4 (Fig. 2A) e para cima -regulated após a sua sobre-expressão (Fig. 2B). Além disso, foram tratados dois grupos de células com o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), um dos activadores da via de ERK-MAPK, e descobriram que o nível de ERK1 /2 fosforilação após o tratamento não foi significativamente diferente entre os grupos, apesar das suas diferenças em níveis TRAPPC4 (Fig. 2).

as células foram lisadas, e quantidades iguais de proteína foram analisadas por análise de mancha de Western utilizando anticorpos contra fosfo-ERK1 /2 (pErk1 /2), ou ERK1 /2, ou TRAPPC4. A densidade das bandas de Western blot foram normalizados para a quantidade de proteína de GAPDH. Os dados apresentados são representativos de três experiências em replicado. *,

p Art 0,05. A. As células foram transfectadas com ARNsi TRAPPC4 (siTRAPPC4) para knockdown expressão TRAPPC4 ou com ARNsi de controlo negtive (siControl) como controlo; Também as células foram tratadas com PDGF para activar ERK-MAPK via, ou com o seu solvente (PBS + BSA a 0,1) como controlo. B. As células foram transfectadas com o vector pCDEF-myc-TRAPPC4 para sobre-expressar a proteína ou com o vector TRAPPC4 pCDEF-myc como controlo; Também as células foram tratadas com PDGF para activar ERK-MAPK via, ou com o seu solvente (PBS + BSA a 0,1) como controlo.

TRAPPC4 regula a distribuição espacial da fosforilada ERK1 /2

Desde que tinha mostrado que TRAPPC4 poderia influenciar o estado de activação de ERK1 /2, queríamos para determinar seu efeito sobre a localização subcelular de pErk1 /2. Em seguida, comparou-se pErk1 /2 e ERK1 /2 na expressão citoplasmática separadas e fracções nucleares quando TRAPPC4 foi empobrecido ou sobre-expressos, como descrito acima. Mais uma vez, GAPDH foi usada como um controlo de carga de entrada para a proteína citoplasmática, e TBP foi utilizado como um controlo para a entrada de proteína nuclear.

por transferência de Western, verificou-se que após o tratamento TRAPPC4 siRNA, o nível de pErk1 /2 diminuiu significativamente no núcleo (Fig. 3A). Enquanto isso, não houve diferença significativa em pErk1 /2 foi encontrado no citoplasma quando quantificados, mesmo que um ligeiro aumento foi sugerido visualmente (Fig. 3B). Por outro lado, quando TRAPPC4 foi sobre-expresso, pErk1 /2 foi regulada positivamente de forma significativa no núcleo (Fig. 4A). Enquanto no citoplasma, nossos resultados mostraram um ligeiro aumento visuais, sem diferenças significativas quando quantificados (Fig. 4B).

células SW1116 foram transfectadas com TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) para knockdown expressão TRAPPC4 ou com negtive Controle siRNA (siControl ) como controlo; Também as células foram tratadas com PDGF para activar ERK-MAPK via, ou com o seu solvente (PBS + BSA a 0,1%) como controlo. Citoplasma e nucleares extractos foram preparados como descrito nos procedimentos experimentais, e quantidades iguais de proteína foram analisadas por análise de Western blot utilizando anticorpos contra fosfo-ERK1 /2 (pErk1 /2), ou de ERK1 /2, ou TRAPPC4. A densidade das bandas de Western blot foram normalizados para a quantidade de proteína para proteína GAPDH citoplasma ou TBP para a proteína nuclear. Os dados apresentados são representativos de três experiências em replicado. *,

p

. 0,05

células SW1116 foram transfectadas com vector pCDEF-myc-TRAPPC4 para superexpressão da proteína TRAPPC4 ou com pCDEF-myc vector como controle; Também as células foram tratadas com PDGF para activar ERK-MAPK via, ou com o seu solvente (PBS + BSA a 0,1%) como controlo. Nuclear (A) e no citoplasma extractos (B) foram preparados como descrito nos procedimentos experimentais, e quantidades iguais de proteína foram analisadas por análise de mancha de Western utilizando anticorpos contra fosfo-ERK1 /2 (pErk1 /2), ou de ERK1 /2, ou TRAPPC4 . A densidade das bandas de Western blot foram normalizados para a quantidade de TBP para a proteína nuclear ou GAPDH proteína para proteína citoplasma. Os dados apresentados são representativos de três experiências em replicado. *,

p

. 0,05

PDGF pode activar a via ERK-MAPK através de receptores tirosina-quinase [17]. Quando a linha celular SW1116 foi estimulado com PDGF, uma ligeira diminuição de pErk1 /2 foi visualmente observada na fracção nuclear depois TRAPPC4 knock-down, mas não foi significativo sobre quantificação. Entretanto, nenhuma alteração significativa em pErk1 /2 foi quantificada na fracção citoplasmática, embora um ligeiro aumento foi sugerido visualmente (Fig. 3). No entanto, a estimulação de células que sobre-expressam PDGF TRAPPC4 resultou em significativa pErk1 /2 regulação positiva no núcleo, mas não no citoplasma (Fig. 4).

TRAPPC4 modula a proliferação e a depleção de TRAPPC4 induz apoptose na linha celular SW1116

a activação de quinases ERK-MAP tem sido associada à proliferação de células [16]. Para estudar ainda mais a função de TRAPPC4 em células CRC, comparamos a proliferação celular de células SW1116 quando a expressão TRAPPC4 foi diminuída em siRNA ou sobre-expresso com full-length transfecção gene TRAPPC4 com o de controle simulada. Os resultados da contagem celular Kit (CCK) -8 ensaio revelou uma inibição significativa do crescimento após a depleção TRAPPC4 e um aumento da viabilidade celular quando TRAPPC4 foi sobre-expresso tanto a partir de 24 horas após a transfecção (fig. 5A).

A: CCK-8 de ensaio. células SW1116 foram semeadas numa placa de 96 poços até subconfluentes. As células viáveis ​​foram determinadas pelo ensaio de CCK-8. Três tempo independentes foram realizados em triplicado. As células foram tratadas com siRNA para TRAPPC4 knockdown expressão TRAPPC4 ou com ARNsi de controlo negtive utilizado como controlo (A), bem como com o vetor tranfered pCDEF-myc-TRAPPC4 para sobre-expressar a proteína ou com o vector TRAPPC4 pCDEF-myc como controlo (b). *,

p Art 0,05. B: Análise de Apoptose. Depois de células SW1116 foram tratadas com siRNA TRAPPC4 negtive ou ARNsi de controlo usado como controlo, durante 48 h. A apoptose foi realizada utilizando o ensaio Anexina V com iodeto de propídio contracoloração permitindo a quantificação por citometria de fluxo. Três tempo independentes foram realizados em triplicado. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (SD). Houve diferença significativa entre os dois grupos (

p Art 0,01)

acumulação TRAPPC4 no núcleo está associada com pErk1 /2 coloração em cancros colo-rectais humanos

como pouco se sabe sobre a expressão e localização de TRAPPC4 no cancro colorectal

in vivo

, nós, então, comparada a sua expressão no epitélio do cólon, adenoma e adenocarcinoma de tecidos normais por imuno-histoquímica, como descrito em Materiais e métodos. No epitélio de cólon normal, a coloração TRAPPC4 foi restringido para o citoplasma (Fig. 6A). 4,55% das células nas amostras de adenoma mostraram uma coloração nuclear, enquanto que era 55,89% nas amostras adencarcinoma (

P

0,01). Nenhuma diferença significativa foi mostrado na expressão total de TRAPPC4 entre os três grupos (grupo epitélio do cólon normal = 85,7%; grupo adenoma = 72,7%; grupo adenocarcinoma = 79,4%;

p Art 0,05).. (Tab 1 )

(a), pErk1 /2 (b) e ERK1 /2 (C) no epitélio do cólon normal (a), adenoma (b), e adenocarcinoma (C). Polygrams (d) mostram a expressão das proteínas no citoplasma (rosa), núcleo (amarelo) e total (azul). A: Expressão de TRAPPC4 tem nenhuma diferença significativa entre os três grupos totalmente, mas aumenta no núcleo de A para C. B: pErk1 /2 localizada principalmente no núcleo, e seu nível aumenta significativamente de A para C. C: Expressão de ERK1 /2 não tem uma diferença significativa entre os três grupos totalmente, mas aumenta em núcleo de A para C. ampliação original × 200.

Além disso, foi analisada a associação entre TRAPPC4 e pErk1 /2 ou ERK1 2 coloração /em condições normais do cólon epitélio, adenoma e adenocarcinoma. Enquanto ERK1 /2 foi detectada coloração tanto no citoplasma e no núcleo (Fig. 6C), a sua coloração no núcleo aumentou significativamente no grupo de adenocarcinoma em comparação com os outros dois grupos. Além disso, as proteínas activadas pErk1 /2 foram todas localizadas no núcleo, e não houve diferenças significativas entre os três grupos (Fig. 6B). Assim, nossos resultados demonstram uma correlação significativa entre a expressão TRAPPC4 nuclear e pErk1 2 níveis /(

r

= 0,996), e também entre a expressão TRAPPC4 nuclear e ERK1 2 níveis /(

r

= 0,994 ).

Discussão

os dois componentes do complexo ERK1 /2 são encontrados sempre para ser co-localizada no carcinoma colorretal [17], [18], [19], [20] ea ERK1 e ERK2 MAPKs têm atraído interesse de pesquisa intensa por causa de seu envolvimento crítico na regulação da proliferação celular e surviva [17]. ERK activadas fosforilam e regular as atividades de uma lista cada vez maior de substratos que se estima que compreendem mais de 160 proteínas [21]. Portanto, ERK1 e ERK2 foram usadas como isco para o rastreio de dois híbridos de levedura de uma biblioteca de cDNA de HeLa humanas no primeiro passo do presente estudo. Como resultado, entre as 23 proteínas de ligação (11 e 12 com ERK2 com ERK1), a possível interacção da TRAPPC4 e ERK2, mas não com a ERK1 foi revelado pela primeira vez. Nosso co-imunoprecipitação e experiências GST-suspensos confirmou ainda TRAPPC4 como um parceiro de interacção ERK2.

Uma vez que foi relatada pouca evidência de proteínas TRAPP em CRC, bem como o papel da interação TRAPPC4-ERK2 ainda é desconhecido, nós primeiro analisado o efeito da TRAPPC4 em ERK1 /2, a forma activada de ERK1 /2. Descobrimos que, como um todo, a sobre-expressão de TRAPPC4 activada de ERK1 /2, enquanto que o seu esgotamento diminuiu /2 níveis pErk1 na linha de células do cancro do cólon derivado SW1116. Assim, TRAPPC4 actua como um regulador positivo para pErk1 /2.

Embora alguns são encontrados no citoplasma, a maioria dos substratos ERK são proteínas nucleares [22]. ERK activados pode translocar para o núcleo, onde elas fosforilam e regular vários factores de transcrição, tais como factores de transcrição da família Ets, levando a alterações na expressão de genes [23]. A avaliação posterior de fracções citoplasmática e nuclear mostrou que o local de pErk1 /2 também alterada juntamente com os níveis de expressão TRAPPC4. Quando TRAPPC4 foi derrubado, o nuclear nível pErk1 /2 foi notavelmente regulada para baixo, mas não houve diferença significativa foi mostrado no citoplasma. Quando sobre-expresso, pErk1 /2 expressão aumentada tanto no núcleo e no citoplasma, mas mais notavelmente no núcleo. Assim, TRAPPC4 está envolvido não só a fosforilação de ERK1 /2, mas também a sua distribuição espacial nas células epiteliais colo-rectais. TRAPP proteínas são conhecidas por serem parte de um complexo multi-proteína envolvidas em grande ER-a-Golgi e o tráfico intra-Golgi [5], [7], [8]. Apresentam-se como várias isoformas que diferem em subunidades, função e localização. Por exemplo, TRAPPCI está envolvido no recrutamento de vesículas derivado do RE para o [8] cis-Golgi, e TRAPPCII [7] é necessária para o transporte retrógrado a partir dos endossomas. Eva Loh

et ai. Revelaram que

BEt3, o componente mais conservada do complexo Trapp, é expressa em oito diferentes tecidos de ratinho, existe em dois conjuntos distintos no citosol e funções durante o transporte RE-Golgi [10] . Portanto, TRAPPC4 pode desempenhar um papel no transporte nucleocitoplasmático no cancro colorectal, mas este mecanismo irá requerer um estudo adicional.

PDGF pode sinalizar através da via de ERK-MAPK e activar a cascata da ERK através de tirosina-quinases receptoras. Verificou-se que após o tratamento com o PDGF, o efeito de TRAPPC4 em pErk1 /2 foi completamente ou parcialmente obscurecido. Os resultados deram uma indicação de que TRAPPC4 podem estar envolvidos em certos passos de activação PDFG-mediada da ERK1 2 cascata /. Como para ERK1 fosforilação 2 /, o efeito de TRAPPC4 pode não ser tão potente como a do FCDP. No entanto, o mecanismo detalhado continua a ser cuidadosamente investigado.

Além disso, descobrimos que TRAPPC4 afetados proliferação celular, bem como a morte celular. Depleção de TRAPPC4 inibiu o crescimento celular e a apoptose induzida, enquanto que a sua sobre-expressão contribui para o crescimento celular. Foi relatado que activado ERK1 /2 interage com alguns substratos, tais como Fosfoproteína enriquecidas em astrócitos 15 (PEA-15), e morte associada proteína quinase (DAPK), e é sequestrado no citoplasma [24]. Supressão de PEA-15 estimula a proliferação marcadamente dependente da ERK e a transcrição de genes; enquanto PEA-15 blocos superexpressão a proliferação através da sua capacidade para se ligar e sequestrar ERK1 /2 no citoplasma [25]. DAPK sequestra ERK1 /2 no citoplasma através da interacção com ERK através de um D-domínio dentro do seu domínio de morte. e a interacção promove a função pró-apoptótica de DAPK [26]. Portanto, a inibição de ERK1 localização nuclear /2 prejudica sinais de sobrevivência ERK1 /2-mediada e, além disso aumenta os sinais pró-apoptóticos. No nosso estudo, após o knockdown de TRAPPC4, a diminuição na activação de ERK1 /2 correspondeu com menos de localização nuclear, que podem em última análise, levar a surpression crescimento e apoptose. Considerando, mais de localização nuclear quando TRAPPC4 sobre-expresso pode promover o crescimento celular.

A maioria da investigação anterior sobre a família TRAPP foi focada em levedura e células normais ou tecidos de mamíferos [4], [5], [8] , [10]. Para o nosso conhecimento, apenas a expressão de TRAPPC2 foi investigado na doença de SEDL [27]. Até à data, o local de subunidades TRAPP principalmente foi reportado no citoplasma das células de mamífero [9], [10]. TRAPPC4 teria sido localizado em espinhos de neurônios cultivados do hipocampo [4], mas pouca informação sobre seu papel na doença tenha sido obtida. Aqui, analisamos a expressão TRAPPC4 no epitélio humano normal do cólon, adenoma, e os tecidos de adenocarcinoma por imuno-histoquímica. Os resultados revelaram que TRAPPC4 nuclear aparece depois de tecido epitélio normal evolui para adenoma e adenocarcinoma. Assim, a alteração na localização de TRAPPC4 pode estar relacionada com a carcinogénese colorectal. Resta saber se isso pode resultar de quaisquer mutações no gene ou modificações estruturais decorrentes TRAPPC4 durante a carcinogênese colorretal. Enquanto isso, pErk1 /2, que estava localizada no núcleo no nosso estudo, o aumento no adenocarcinoma em comparação com os tecidos de adenoma e tecidos epiteliais normais. Como mencionado acima, a principal função da família TRAPP está na regulação do transporte vesicular, e TRAPPC4 está envolvido no tráfico de membrana em locais pós-sinápticos em neurónios. Pode-se perguntar se o mecanismo de localização nuclear de TRAPPC4 em CRC é relevante para o transporte de pErk1 /2 a partir do citoplasma para o núcleo. Na verdade, o complexo TRAPP foi mostrado para agir como o fator de troca de nucleótido guanina (GEF) para YPT1 e Ypt31 /32 GTPases tanto

in vitro

in vivo

[28], [29 Comprar e ]. Enquanto YPT1 GTPase é exigida no cis-Golgi para o direccionamento e fusão de vesículas derivado de er [30], [31], as funções dos Ypt31 /32 GTPases também são essenciais para a formação de vesículas de trans-Golgi [32] . Ele continua a ser visto se existe um mecanismo molecular semelhante para TRAPPC4 no CRC ainda em estudos posteriores.

Em conclusão, nosso estudo demonstrou a interação de TRAPPC4 com ERK2. No cancro colorectal, não só regula a activação de ERK1 /2, mas também afecta a distribuição de ERK1 activado /2. Ele modula a proliferação celular e a apoptose em células de CRC. Em consideração com estudos anteriores, especula-se que, em CRC, TRAPPC4 se liga e activa a ERK1 /2, bem como participa no transporte nuclear de pErk1 /2. Quando TRAPPC4 está esgotada, menos de ERK1 /2 é fosforilada, e relativamente mais pErk1 /2 mantém-se no citoplasma, o que leva à supressão da proliferação celular e da apoptose. Quando TRAPPC4 é sobre-expressa, mais ERK1 /2 é activado, e ainda mais é transportado para o núcleo, conduzindo finalmente a um crescimento celular aumentado (Fig. 7). serão necessários futuros estudos para esclarecer este mecanismo molecular proposto.

sinais extracelulares, tais como PDGF, ativar cascatas ERK (//MER /ERK RAF RAS) através de receptores tirosina-quinase (RTK) e utimately regular a proliferação celular e apoptose. TRAPPC4 se liga e activa a ERK1 /2, bem como participa no transporte nuclear de pErk1 /2. Quando TRAPPC4 está esgotada, menos de ERK1 /2 é fosforilada, e relativamente mais pErk1 /2 mantém-se no citoplasma, o que leva à supressão da proliferação celular e da apoptose. Quando TRAPPC4 é abundante, mais ERK1 /2 é ativada, e ainda mais é transportado para o núcleo, finalmente, levando a um crescimento celular aumentado.

Materiais e Métodos

Plasmídeos e transfecções

A de comprimento completo ERK1, ERK2, e ADNc TRAPPC4 foram obtidos por PCR a partir de uma biblioteca de ADNc humano. Para levedura ensaios de dois híbridos, fragmentos de comprimento total de ERK1 e ERK2 cDNAs foram clonados tanto no quadro com o

Sfi local

I no plasmídeo pGB. Para ensaios de ligação, o cDNA TRAPPC4 de comprimento completo foi clonado em pCDEF-Myc, e ERK2 ADNc de comprimento completo foi clonado em pCDEF-Flag. ERK2 foi subclonado em pGEX-5x para produzir glutationa

S

-transferase proteínas de fusão (GST) e TRAPPC4 foi subclonado em pET-28a para produzir suas proteínas de fusão.

Para o co-imunoprecipitação experiências abaixo, 1,6 × 10

6 células /poço de placas de 6 cm foram co-transfectadas com vectores de pCDEF-Myc-TRAPPC4 e pCDEF-Flag-ERK2 expressando TRAPPC e ERK2, respectivamente, usando um plasmídeo: proporção de reagente de transfecção de 1:4 (4 ug cada de plasmídeo). controle de vetores vazios foram pCDEF-Myc ou pCDEF-Flag (ambos de Shanghai Genomics).

levedura ensaios de dois híbridos

A levedura sistema de duplo híbrido foi realizada para identificar proteínas ERK1 e ERK2 interagindo por utilizando o Sistema de Clontech Matchmaker Two-Hybrid (Cat. # K1612-1) de acordo com as instruções do fabricante. plasmídeos isca PGB-ERK1-G e PGB-ERK2-G foram transformados na estirpe de levedura Y190. efeitos de toxicidade e testes de auto-activação foram realizados utilizando um ensaio de β-galactosidase. Levedura transformada com os plasmídeos de isco foram cultivados e pesquisados ​​com o HeLa humano Matchmaker biblioteca de cDNA (Clontech, Cat # HL4048AH) e, em seguida, cultivadas em Leu-Trp-His placas para selecção e validação utilizando o ensaio de beta-galactosidase. Os plasmídeos a partir de colónias positivas foram extraídos, amplificados em bactérias e co-transformado novamente em levedura, juntamente com os plasmídeos de isco para mais testes em ensaios de beta-galactosidase. Os plasmídeos de resultados positivos foram sequenciados e analisados.

Co-imunoprecipitação (co-IP) e análise de GST-suspenso

Co-imunoprecipitação foi realizada como descrito anteriormente [33]. Tanto a amostras IP de entrada e foram analisadas por Western blot utilizando vários anticorpos nas seguintes diluições: Bandeira de Anticorpo (1:1000), Myc Anticorpo (1:1000) Bandeira HRP-anticorpo (1:4000), Myc-HRP de anticorpo (1 :2000) (todos da Shanghai Genomics, Xangai, China), e de cabra anti-IgG de ratinho-HRP de anticorpos (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA). Co-transfecção de vectores de expressão de p16 e TSSK1 (Xangai Genomics, Xangai, China) foi utilizado para a co-imunoprecipitação de controlo positivo.

proteína GST e proteínas de fusão GST-ERK2 foram expressas e purificadas de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, London, UK). Para o ensaio de pull-down, 1-5 mg de proteínas GST ou de fusão GST foram misturados com 40 ml de uma suspensão a 50% de esférulas de glutationa-Sepharose 4B durante 2 h em tampão de ligação [HEPES-NaOH a 25 (pH 7,5) , MgCl 12,5 mM de

2 10% de glicerol, DTT 5 mM, 0,1% de NP-40, 150 mM de KCl e 20 mM de ZnCl2]. Em seguida, 1-5 mg de 6 × proteínas de fusão His-TRAPPC4 foi adicionado, seguido por incubação durante mais 2 h. Os sedimentos foram lavados extensivamente, e foram identificados por transferência de western com 6 × Sua Antibody (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK).

cultura celular

A de células derivadas de cancro do cólon SW1116 linha (adquirido a partir da Cell Bank of Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências, Shanghai Institute of Cell Biology, Academia chinesa de Ciências) foi mantida através de passagens em série em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS), 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina.