Sumário

MUC17 é uma glicoproteína ligada à membrana do tipo 1, que é expresso principalmente no tracto digestivo. Estudos recentes demonstraram que a sobre-expressão aberrante de MUC17 está correlacionada com o potencial maligno de adenocarcinomas do ducto pancreático (PDACs); No entanto, o mecanismo de regulação exacta da expressão MUC17 ainda tem de ser identificada. Aqui, nós fornecemos o primeiro relatório do mecanismo de regulação MUC17 sob hipóxia, uma característica essencial do microambiente do tumor e uma força motriz da progressão do câncer. Nossos dados revelaram que MUC17 foi significativamente induzida pela estimulação hipóxica através de um fator 1α hipoxia-inducible (HIF1α) via dependente em algumas células de câncer de pâncreas (por exemplo, AsPC1), enquanto que outras células do cancro do pâncreas (por exemplo, BxPC3) apresentaram pouca resposta à hipoxia . Interessantemente, estas células de baixa-responsivo tem motivos CpG metilados altamente dentro do elemento de resposta a hipoxia (HRE, 5′-RCGTG-3 ‘), um sítio de ligação para HIF1α. Assim, investigamos os efeitos desmetilação de CpG na HRE na indução hipóxica de MUC17. O tratamento de células de baixa-responsivo com 5-aza-2’-desoxicitidina, seguido por incubação hipóxica adicional resultou no restabelecimento da indução hipóxica MUC17. Além disso, a metilação do DNA de HRE em tecidos pancreáticos a partir de pacientes com PDACs apresentaram maior estado hipometilação, em comparação com aqueles a partir de tecidos não-cancerosas, e a hipometilação foi também correlacionada com a expressão de ARNm MUC17. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a via de sinalização hipóxica HIF1α mediada contribui para MUC17 expressão, e metilação do DNA do HRE poderia ser um determinante da capacidade de indução de hipóxia de MUC17 em células de câncer de pâncreas

Citation:. Kitamoto S, Yokoyama S, Higashi H, Yamada N, Matsubara S, S Takao, et ai. (2012) Expressão de MUC17 é regulada por Respostas hipóxicos HIF1α mediada e requer um elemento responsável metilação-Free hipóxia no cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (9): e44108. doi: 10.1371 /journal.pone.0044108

editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de fevereiro de 2012; Aceito: 30 de julho de 2012; Publicação: 10 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Kitamoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por Princes Cancer Research Fund Takamatsu para S. Yonezawa; Grants-in-Aid para a Investigação Científica da Pesquisa Científica (B) 23.390.085 de S. Yonezawa; Investigação Científica (C) 21590399 para M. Higashi; Jovens Cientistas (B) 24701008 para S. Yokoyama; Investigação Científica em Áreas Prioritárias 239349 para S. Kitamoto (JSPS Fellowship) do Ministério da Educação, Ciência, Desporto, Cultura e Tecnologia, Japão; a Fundação de Pesquisa de Pâncreas do Japão para S. Yokoyama; eo Memorial Foundation Kodama, no Japão para M. Higashi. S. Batra é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de bolsas de Saúde (CA78590, CA163120, CA133944 e CA111294). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma das formas mais agressivas de câncer. Devido às suas propriedades de crescimento e metastáticos agressivos, a taxa de sobrevida global de pacientes com câncer de pâncreas é de 3-5% [1]. morfologia avascular é uma das principais características do câncer de pâncreas, resultando em pobre de sangue eo suprimento de oxigênio. Consequentemente, o câncer de pâncreas contém células tumorais que estão em baixas tensões de oxigênio, uma condição chamada hipóxia. O acúmulo de evidências indica que o microambiente do tumor hipóxico está intimamente correlacionado com características de tumores sólidos, incluindo invasão, metástase e má resposta à anticancerígenos terapias [2], [3]. A este respeito, a hipoxia-inducible factor 1α (HIF1α) tem sido identificada como um regulador chave da resposta hipóxica, activar vários genes relacionados com o cancro, tais como VEGF, CAIX e GLUT1.

As mucinas são fortemente

ó proteínas

-glycosylated encontrados na camada de muco, e que são diferencialmente expressos na superfície celular de muitas epitélios. Eles são responsáveis ​​pelas propriedades físicas dos géis de muco e está envolvido na protecção de células epiteliais e de manutenção do microambiente local, molecular [4], [5], [6], [7]. Por outro lado, há também uma evidência crescente de que as mucinas são expressas de forma aberrante em vários cancros, e que têm sido implicadas na transformação maligna, bem como a proliferação de células de tumor, a sobrevivência, invasão e metástase [8], [9], [10]. Neste contexto, os estudos recentes revelaram que certos mucinas ligadas à membrana são suficientes para induzir a transição epitelial-mesenquimal-a e, assim, representam alvos atraentes para o tratamento anti-cancro [11], [12].

A glicoproteína foi MUC17 caracterizado como uma mucina ligada à membrana [13]. análise de RNA blot indicou que

MUC17

é expresso principalmente no tracto digestivo, incluindo o duodeno, íleo, cólon transversal e [13], [14]. Sob condições fisiológicas, tem-se sugerido que MUC17 endógena desempenha um papel importante nos processos de restituição de células e contribui para a protecção da mucosa do cólon-[15], [16]. Moniaux et ai. relataram que MUC17 foram expressas de forma aberrante em adenocarcinomas do ducto pancreático (PDACs) em comparação com a ausência de expressão no pâncreas normal ou pancreatite [17]. Além disso, Hirono et ai. também informou que MUC17 é um fator prognóstico independente associado com linfonodo metástases em PDACs [18]. Estes achados sugerem que MUC17 pode ter um papel importante na progressão do cancro pancreático. Quanto ao mecanismo de regulação da MUC17, o nosso estudo anterior sugeriu que as mudanças epigenéticas, incluindo modificações de metilação e histonas CpG-DNA no H3-K9 no promotor proximal MUC17 são os principais determinantes da expressão MUC17 [19]. No entanto, ainda não está claro que tipo de fatores de transcrição são recrutados para o promotor MUC17 e envolvidos na regulação da expressão MUC17.

No presente estudo, nós fornecemos a primeira evidência que descreve o mecanismo de regulação de MUC17 na microambiente do tumor hipóxico. Nossos resultados mostram que MUC17 é induzida por HIF1α mediação resposta hipóxica, ea metilação do DNA específico determina a capacidade de indução de hipóxia de MUC17 em células de câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

declaração Ética

tecidos de tumor pancreático humano foram obtidos a partir de Hospital da Universidade Kagoshima, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Kagoshima.

linhas celulares de cancro do pâncreas e amostras de tecidos humanos

As linhas de células de carcinoma pancreático humano AsPC1, BxPC3, HPAFII e PANC1 foram adquiridos de a American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). células BxPC3 AsPC1 e foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO, EUA.). HPAFII células foram cultivadas em meio essencial mínimo de Eagle (Sigma). células PANC1 foram cultivadas em meio D-MEM (Sigma). Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen) e 100 U /mL de penicilina /100 g /ml de estreptomicina (Sigma). condições de cultura hipóxicas foram conseguidos com uma incubadora multi-gás contendo uma mistura de gás composta de 94% de N

2, 5% de CO

2, e 1% de O

2 (ASTEC, Japão). Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes, a menos que indicado de outra maneira.

extracção de ARN e RT-PCR

O ARN total foi extraído utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e quantificou utilizando um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, dE, EUA). Para RT-PCR, o ARNm foi obtido transcritos de modo inverso em ADNc com a alta capacidade de ARN-ADNc para-Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores para a PCR subsequente são mostrados na Tabela S1. A PCR foi realizada com os AmpliTaq Gold Master Mix rápida de PCR (Applied Biosystems) seguindo o protocolo do fabricante.

Extracção de proteínas e Western blotting

As células foram cultivadas em placas de 6 cm sob condições hipóxicas para a sua vezes designados. Os lisados ​​celulares totais foram preparados usando tampão RIPA contendo mistura de inibidores de protease (Nacalai Tesque, Japão). Após quantificação por ensaio BCA (Thermo Scientific), quantidades iguais, foi resolvido por 3-8% de SDS-PAGE e electrotransferidas para membranas de PVDF. Para análise de expressão MUC17, os lisados ​​de proteína foram resolvidos em geles de agarose a 2% contendo SDS e passivamente transferidos para membranas de PVDF e incubadas durante a noite a temperatura ambiente. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 1% /PBST durante 2 h e submeteu-se o procedimento padrão de imunodetecção utilizando os anticorpos primários específicos. Os anticorpos primários foram como se segue: MUC17 anti-humano (pAb de coelho, 1:1000, gerado por um dos autores, o Dr. K. Surinder Batra, Universidade do Nebraska Medical Center, Omaha, NE, EUA); HIF1α anti-humana (mAb rato, 1:1000, H1alpha67, Novus Biologicals), e anti-humana α-tubulina (mAb rato, DM1A, Sigma).

RNA de interferência

Para RNA de interferência (RNAi) experiências,

HIF1A

expressão foi silenciado usando On-Target Plus siRNA (Dharmacon) de acordo com as instruções do fabricante. On-alvo mais siControl não segmentação siARN foi utilizada como um controlo. AsPC1 células foram semeadas em placas de 6 cm, e a 50-60% de confluência, elas foram transfectadas com 13,6 nmol /L siRNA utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen).

Dual-Luciferase Reporter Assay

a sequência de flancos 5 ‘(-687 a +53) de MUC17 humana foi amplificado utilizando ADN genómico isolado a partir de células AsPC1. O fragmento de PCR foi digerido com NheI e XhoI e clonado no vector pGL4.17 (Promega). Para gerar mutantes de HRE a MUC17 promotor humano, um Kit de Mutagénese relâmpago QuikChange Site-Directed foi utilizado (Stratagene). Os conjuntos de iniciadores são mostrados na Tabela S1. Para o ensaio de duplo repórter de luciferase, as células AsPC1 foram semeadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 1 x 10

5 células /poço e transfectadas transientemente com 75 ng do plasmídeo repórter luciferase utilizando JetPEI (Polyplus Transfecção) de acordo com a o protocolo do fabricante. Em seguida, a actividade de luciferase nos lisados ​​celulares totais foram ensaiadas depois de 24 h, usando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega) num leitor de microplacas Tristar multimodo LB 941 (Berthold Technologies). O gene repórter luciferase Renilla expressa num vector pGL4.74 foi simultaneamente transfectadas como controlo interno.

Cromatina imunoprecipitação

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio foi realizado utilizando um kit Shearing-chip e um kit OneDay chip (Diagenode, Filadélfia, PA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, os complexos nucleoproteicos foram sonicadas para reduzir os tamanhos de fragmentos de ADN de 300-500 pb usando um Bioruptor (Cosmo Bio). Um micrograma de IgG normal de rato foi usado como controlo negativo, e foi utilizado anticorpo de ratinho anti-humano HIF1α para cada imunoprecipitação. ADN imunoprecipitados foi amplificado por PCR como descrito anteriormente. Os iniciadores de fichas era projetado para atacar o site HRE do promotor MUC17. Os iniciadores para a PCR subsequente são mostrados na Tabela S1. As condições de PCR foram 95 ° C durante 5 min, 34 ciclos a 96 ° C durante 5 segundos, 59 ° C durante 5 s, e 68 ° C durante 7 s, e uma reacção de extensão final a 72 ° C durante 1 min. Os produtos amplificados foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 1,0%.

metilação do DNA análise

Para a análise CpG desmetilação, células AsPC1 foram incubadas com 1? M de 5-azadC (Sigma) durante 7 dias. No final do tratamento, o ADN e proteínas foram extraídas por PCR específicos de metilação (MSP) e Western blotting. extracção de ADN e de MSP foi realizada de acordo com métodos padrão. Em resumo, o ADN total a partir de linhas de células e tecidos foram extraídos usando um Sistema de tecido DNeasy (Qiagen). bissulfito modificação do ADN genómico (2 ug) foi realizada utilizando um Kit de bissulfito Epitect (Qiagen), e quantidades iguais de ADN modificado foram amplificados por PCR usando o AmpliTaq Gold Master Mix rápida de PCR (Applied Biosystems). A especificidade dos iniciadores de MSP é grandemente influenciada pelas características termodinâmicas da extremidade 3 ‘do iniciador proposto. Assim, definimos o resíduo de citidina de CpG dentro de HRE como a extremidade 3 ‘do iniciador de MSP. O iniciador L é concebido para a amplificação de ADN de bissulfito de sódio convertido num estado não metilado, enquanto o iniciador M é específico para o bissulfito de sódio convertido ADN metilado. Os pares de iniciadores HRE-alvo são apresentados na Tabela S1. As condições de PCR foram 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos a 96 ° C durante 5 segundos, 59 ° C durante 5 s, e 68 ° C durante 5 s, e uma reacção de extensão final a 72 ° C durante 1 min. Os produtos amplificados foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 1,0%.

Para investigar ainda mais a correlação da expressão MUC17 com o estado de metilação em amostras biológicas, os tecidos tumorais de pâncreas foram obtidos a partir das amostras pancreáticas cirurgicamente ressecado de 10 pacientes com PDAC . tecidos normais do pâncreas foram obtidos a partir dos mesmos pacientes de áreas distantes do tumor. Todas as amostras de tecido foram armazenados a -80 ° C até à sua utilização. Para realizar MSP e RT-PCR, o ADN total e ARN foram isolados a partir dos tecidos e analisados ​​como descrito anteriormente. As bandas obtidas a partir de MSP e RT-PCR foram quantificados por Image J soft ware, e o nível relativo de unmethylation em cada amostra foi calculada como um índice do estado unmethylation usando a equação (%) = L /(L + M). A correlação da expressão de mRNA MUC17 com o estado de metilação do HRE foi analisada pelo teste de Spearman.

Análise Estatística

Nos ensaios de repórter de luciferase e chip, as diferenças estatísticas foram determinadas usando um two-sided estudante de

t

-teste. Para investigar a correlação entre o estado de metilação HRE e expressão MUC17 em amostras de tecido, teste de Spearman foi realizada utilizando o software estatístico R versão 2.12.2. P 0,05 foi considerado significativo

Resultados

A expressão de MUC17 é aumentada em condições de hipoxia em células de câncer de pâncreas

Para examinar o efeito da exposição hipóxica na expressão MUC17, nós cultivadas. células humanas do cancro do pâncreas AsPC1 sob condições de cultura de hipoxia (1% O

2) para 2 dias. Na análise de RT-PCR, a expressão de MUC17 e CAIX, um marcador hipóxico, foi significativamente aumentado, ao passo que os níveis de mRNA HIF1α eram estáveis ​​sob condições de hipoxia, o que confirma a regulação pós-transcricional anteriormente relatado de HIF1α [20]. Western blotting também foi empregado para examinar o nível de proteína MUC17, e revelaram uma indução de expressão proeminente MUC17 e HIF1α de uma forma dependente do tempo (Figura 1A e 1B). Até à data, HIF1α é conhecido como um regulador chave da resposta hipóxica em muitos cancros. HIF1α liga-se ao elemento de resposta a hipoxia (HRE, 5′-RCGTG-3 ‘), um sítio de ligação para HIF1α, e transactiva muitos genes hipoxia adequada, incluindo VEGF, GLUT1 e CAIX. Realizamos a análise da sequência do promotor MUC17 aproximadamente 3,0 kb com software MatInspector (Genomatix) e encontrou um HRE putativa (+ 37 /+ 41) na região promotora proximal do MUC17. Assim, a hipótese de que MUC17 superexpressão em condições de hipóxia é mediada por HIF1α. Para examinar o efeito de hipoxia na actividade transcricional do promotor MUC17, construímos um vector repórter MUC17 promotor-luciferase contendo o local de HRE. Sob condições de hipoxia, as células transfectadas com AsPC1 esta construção exibiu actividade significativamente aumentada repórter (Figura 1C), o que sugere que o aumento da expressão de MUC17 sob condições hipóxicas é devido a um aumento da actividade transcricional.

células AsPC1 (A) foram cultivadas sob condições hipóxicas (1% o

2) para os tempos indicados. a expressão de ARNm MUC17 foi examinado por RT-PCR a cada ponto de tempo. (B) As células foram cultivadas sob AsPC1 normóxica ou condições hipóxicas durante os tempos indicados. Os lisados ​​celulares foram sondadas com anti-MUC17, HIF1α, e anticorpos alfa-tubulina por análise de Western blot. As intensidades das bandas foram quantificados por varrimento densitométrico, e o rácio de MUC17 para ácido a-tubulina expressão é mostrada em cada banda como a intensidade relativa em comparação com a obtida em células normóxicas AsPC1. (C) MUC17 actividade do promotor foi medida por um Dual-Luciferase Reporter Assay. Após a transfecção do plasmídeo repórter MUC17, células AsPC1 foram incubadas sob condições de normóxia ou hipóxicas durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram ensaiadas utilizando um kit de ensaio de luciferase em um Tristar multimodo leitor de microplacas LB941 (Berthold Technologies). a eficiência de transformação foi normalizada com base na actividade da luciferase de Renilla. A atividade do promotor em condições de normóxia foi dado um valor de 1. Os valores de P foram determinados através de Student

t

-teste. * P . 0,05

indução hipóxica de MUC17 é regulada pelo HIF1α-dependente via de sinal

A fim de investigar se HIF1α está realmente envolvido na indução hipóxica de MUC17, nós examinaram o efeito de silenciamento HIF1α sobre a indução hipóxica MUC17 em células AsPC1 utilizando ARNsi. Sob hipoxia, ARNsi de controlo não teve qualquer efeito na transcrição de MUC17, HIF1α, CAIX, e ß-actina. Pelo contrário, o tratamento com ARNsi de segmentação HIF1α levou a uma diminuição importante da indução hipóxica MUC17, bem como CAIX (Figura 2B). O mesmo resultado foi observado no nível de proteína (Figura 2B), indicando o envolvimento de HIF1α em hipóxica MUC17 indução.

(A) Após a transfecção de HIF1A siRNAs, as células AsPC1 foram cultivadas sob normoxia (N) ou hipóxia (H), durante 24 h. O nível de ARNm foi medido por RT-PCR. Os lisados ​​(B) a partir das células tratadas com ARNsi AsPC1 HIF1a foram coradas imunologicamente com os anticorpos indicados. α-tubulina serviu como um controlo de carregamento. (C) As densidades das bandas adquiridos a partir de análise de transferência de Western foram quantificados e expressos como aumentos vezes em relação em comparação com a obtida a partir de células sob condições de cultura simulados hipóxicas. ns, não significativo. * P 0,05, ** P . 0.005

A hipoxia aumenta o recrutamento de HIF1α para HRE e ativa a transcrição MUC17

Para avaliar o envolvimento de HIF1α em MUC17 regulação da transcrição, nós ChIP ensaios realizados. O resultado revelou que o anticorpo anti-HIF1α enriquecido significativamente os fragmentos de promotor MUC17 albergando HRE sob condições hipóxicas, mas não em condições de normóxia (Figura 3A e 3B). Além disso, nós testamos se HRE era realmente essencial para a indução de hipóxia MUC17 transativação. vectores repórter com mutações no local de HRE foram construídos e transfectado para células AsPC1 sob condições hipóxicas. Como mostrado na Figura 3C, as células transfectadas com vectores mutantes exibiram significativamente reduzida em comparação com a transactivação que as células transfectadas de-construção do promotor de tipo selvagem, indicando que o papel essencial do sítio HRE na indução hipóxica MUC17

.

(a) ligação de HIF1α a cromatina foi confirmada por um ensaio de chip. AsPC1 células foram cultivadas sob normoxia ou hipoxia durante 24 h. A PCR foi realizada com os iniciadores específicos cobrindo HRE. (B) As densidades das bandas adquiridos no painel (A) foram quantificados usando o Image J (NIH) e normalizado para entrada incluídos em cada experiência. (C) Para avaliar a atividade de transativação de HIF1α através HRE, foi realizado um ensaio de luciferase duplo. AsPC1 células foram transfectadas com o tipo selvagem ou mutantes HRE construções promotoras MUC17 sob condições hipóxicas durante 24 h. Os valores de P foram determinados utilizando Estudante de

t

-teste. ns, não significativo. * P 0,01, ** P . 0.001

padrão de expressão diferencial de MUC17 induzido por hipoxia em várias linhas celulares de cancro pancreático

Além disso, avaliou-se a indução hipóxica de MUC17 é um evento universal em células de cancro pancreático. linhas de células adicionais (BxPC3, HPAFII, e PANC1) foram cultivadas sob condições hipóxicas durante 2 dias, e os níveis de expressão de mRNA foram monitorizados. Os resultados revelaram que os níveis de expressão em AsPC1 MUC17 e células HPAFII foram significativamente aumentada sob condições hipóxicas. Em contraste, apenas um fraco aumento foi observado em células PANC1 e BxPC3 (Figura 4A). Neste contexto, informou recentemente que hipometilação do DNA é um factor chave para a expressão MUC17 no câncer de pâncreas (Figura 4B). Curiosamente, as células AsPC1 e HPAFII, que exibiram MUC17 indução proeminente sob hipóxia, exibiu uma HRE quase completamente não metilado (No. 13) dentro do promotor MUC17, enquanto BxPC3 e células PANC1 tinha ERC [19] altamente metilado. Assim, a hipótese de que o estado de metilação do DNA de HRE determina indução MUC17 em resposta à hipóxia.

(A) Diferencial de padrão de expressão de MUC17 induzida pela exposição hipóxica em linhas celulares de cancro do pâncreas. Cada linha de células pancreáticas foi cultivada sob condições (N) ou hipóxico (H) normóxicas. Nível de ARNm foi determinada por RT-PCR a cada ponto de tempo. (B) A sequência do promotor do gene MUC17 humano, que abrange as posições -687 a 302 no que diz respeito ao sítio do início da transcrição. Os números dos locais de CpG estão sublinhados. O site HRE contém o local de CpG (No. 13).

estatuto de metilação do DNA de HRE determinou a capacidade de indução de hipóxia de expressão MUC17

Para investigar o envolvimento de metilação do DNA de HRE em MUC17 expressão sob condições hipóxicas, que trataram células PANC1 e BxPC3 com 5 AzadC (um agente de desmetilação de ADN), durante 7 dias, e as células foram incubadas durante mais 24 h sob normoxia ou hipoxia. Em primeiro lugar, confirmou-se a desmetilação de efeito de tratamento de 5 AzadC em HRE por REM (figura 5A). Em seguida, examinámos a expressão MUC17 em células tratadas com 5-AzadC sob condições de hipoxia, o que resulta no restabelecimento da expressão MUC17 apenas em células tratadas com 5 AzadC-tratamento em condições de hipoxia (Figura 5B).

(A) A desmetilação de locais CpG no promotor MUC17 em células BxPC3 e PANC1 após um tratamento? M de 5-azadC. MUC17-negativas linhas celulares de /baixos foram tratados com ou sem 5-azadC durante 7 dias. O estado de metilação do promotor MUC17 abrigar HRE foi examinado por MSP. Os produtos de PCR marcados com H (metilado) foram amplificados por iniciadores específicos de metilação, e aqueles L marcado (não metilado) foram amplificados por iniciadores específicos para o ADN não metilado. (B) Restauração de expressão MUC17 em linhas celulares de cancro do pâncreas por tratamento de 5 azadC. As células foram tratadas com ou sem 5-azadC durante 7 dias. Durante as últimas 24 horas, cada grupo foi cultivada sob condições (N) ou hipóxico (H) normóxicas. MUC17 expressão foi analisada por Western blotting.

MUC17 expressão correlaciona-se com a hipometilação HRE dentro da região do promotor

Além disso, para avaliar o significado biológico da HRE metilação na expressão MUC17, examinámos expressão MUC17 e estado de metilação em tecidos normais e tumorais pancreáticas de pacientes com PDACs por RT-PCR e MSP, respectivamente. Consistente com os relatórios anteriores [17], [18], mRNA e proteína MUC17 são sobre-expressos em PDAC (Figura 6A e B). Na análise de MSP usando 10 amostras emparelhadas PDAC (tecidos não-cancerosas, n = 10, tecidos cancerosos, n = 10), os sinais não metilados foram significativamente observada em tecidos com PDAC em comparação com aqueles a partir de tecidos não cancerosos (bicaudal Student

t

-teste, P = 0,007). Também foi investigada a correlação entre a expressão do mRNA MUC17 eo estado de metilação do HRE. O nível de mRNA MUC17 foi fortemente correlacionada com o estado hipometilação do HRE dentro do promotor MUC17 no câncer de pâncreas (Figura 6C).

(A) a expressão do mRNA MUC17 eo estado de metilação HRE no pâncreas normal (N) e tecidos tumorais pancreáticas (T) foi examinado por RT-PCR e MSP, respectivamente. (B) representativos de dados coloração imuno-histoquímica para MUC17 em um paciente com PDAC. barra de escala, 100 mm. (C) Correlação da expressão de mRNA MUC17 eo estado de metilação HRE foi analisada pelo teste de Spearman. As densidades das bandas obtidas foram quantificadas usando o Image J, e a quantidade relativa de unmethylation em cada amostra foi calculada como um índice do estado unmethylation aberrante utilizando a equação (%) = L /(L + M).

Discussão

estudos recentes identificaram, que é sobre-expresso em PDACs, como um fator prognóstico independente de metástase ganglionar [17], [18]. Embora pouco se sabe sobre o papel funcional da MUC17 em câncer, a compreensão do mecanismo de regulação da MUC17 pode ser um passo fundamental no desenvolvimento de novas estratégias para o diagnóstico e tratamento do câncer.

No presente estudo, foi investigada a regulação hipóxica de MUC17 em células de câncer de pâncreas. Os nossos resultados demonstraram que MUC17 é significativamente induzida por hipoxia de uma maneira dependente do tempo, e esta regulação positiva é directamente mediada por HIF1α. Além disso, o uso de quatro linhas de células com diferentes MUC17 inducibilities hipóxicos nos permitiu propor um modelo para a regulação epigenética da MUC17 em câncer pancreático. Propomos que a metilação do DNA do HRE inibe HIF1α mediada transativação MUC17 em células com baixa MUC17 hipóxico indutibilidade, enquanto hipometilação progressiva do HRE permite um aumento importante na expressão MUC17 em condições de hipóxia em células com alta capacidade de indução de hipóxia. Existem evidências crescentes de que a metilação dos locais de CpG nas regiões de promotor afecta a indução da expressão do gene por HIF1α, presumivelmente, limitando o acesso de factores de transcrição para

cis

elementos actuando [21], [22]. Como mostrado na Figura 6, a hipometilação de HRE dentro do promotor MUC17 é um evento frequente nos tecidos pancreáticos de pacientes com PDAC. Embora mais estudos são necessários para elucidar os outros fatores envolvidos na expressão MUC17, isso poderia explicar por que MUC17 é overexpressed em câncer pancreático. No que diz respeito à falta de indução CAIX em células PANC1, tem sido demonstrado que a expressão CAIX é, pelo menos em parte, regulada pelo local específico de CpG hipometilação a -74 pb no promotor em carcinoma de células renais e outros tipos de células de cancro [23] [24], [25]. Portanto, esta resposta também pode ser afectada pelo estado de metilação do DNA de HRE dentro do promotor CAIX.

Existem algumas implicações para considerando o papel funcional de MUC17 no desenvolvimento do cancro. Em tumores sólidos, por causa da proliferação ilimitada de células cancerosas e vascularização inadequada, falta de oxigênio (hipóxia) e privação de nutrientes são reconhecidos como características essenciais do microambiente do tumor e uma força motriz da progressão do câncer. Recentemente, foi relatado que a MUC1, que também é identificada como uma mucina hypoxia-inducible, poderia promover autofagia, proporcionando uma vantagem de sobrevivência no baixo microambiente salientou-glicose através da supressão de aumentos induzidos por privação de glucose de níveis de ROS em cancro do cólon [26]. Além disso, também tem sido relatado que a transfecção estável de pequeno ARN em gancho de segmentação MUC17 endógeno em células de cancro do cólon LS174T resultou em agregação celular reduzida, reduzida adesão célula-célula e migração, e aumento da susceptibilidade a apoptose [15]. Estes resultados indicam que MUC17 pode ter algumas funções, incluindo a migração celular, invasão, resistência à apoptose e adaptação às microambientes sublinhado na progressão do cancro pancreático.

Alterações de metilação do DNA são uma das mais notáveis ​​mudanças epigenéticas em câncer humano . A evidência acumulada sugere que a metilação do DNA aberrante é frequentemente observada mesmo nos estágios iniciais e pré-cancerosas da carcinogênese humana e pode ser um indicador de risco carcinogênese, um marcador de diagnóstico precoce do câncer, e um indicador biológico de doenças malignas do câncer [27], [ ,,,0],28]. Tem sido relatado que modificações epigenética incluindo a metilação do DNA contribuem em grande parte para a expressão de genes da família de mucina humanos no cancro [19], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Zhu et al. relataram um aumento aberrante, tanto na expressão e hipometilação do MUC4 durante a progressão PanIN-PDAC [35]. Além disso, foi desenvolvido um novo método para detecção de padrões de metilação do DNA chamados MSE, o que permitiu a detecção de metilação alterado no suco pancreático e revelou os significativamente diferentes padrões de metilação no promotor MUC1 entre neoplasia mucinoso papilar intraductal e PDAC, indicando a sua utilização em diagnóstico potencial [36]. Embora mais estudos são necessários para esclarecer a importância clínico-patológico e mecanismos precisos de expressão MUC17, estas descobertas levantam a possibilidade de que o estado de metilação do promotor MUC17 é um marcador epigenético para o diagnóstico de risco carcinogénico ea previsão de resultados de pacientes com PDAC. Tomados em conjunto, nosso estudo demonstra pela primeira vez que a expressão MUC17 é reforçada pela resposta hipóxica HIF1α mediada e que a metilação do DNA do HRE é um factor determinante da capacidade de indução de hipóxia de MUC17 em câncer pancreático. No futuro, a importância destes achados em patogénese do cancro do pâncreas serão exploradas.

Informações de Apoio

Tabela S1.

oligonucleótidos sintéticos utilizados neste estudo. Os oligonucleótidos sintéticos enumerados com o número de posição no que diz respeito ao sítio do início da transcrição. Na análise de MSP, * indica o iniciador de U para alelos não metilados. ** Indica o primer M para alelos metilados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0044108.s001

(DOC)

Agradecimentos

Os autores agradecem a Sra Izumi Houjou e Yukari Nishimura pela sua excelente assistência técnica.