Abstract

O irinotecano, um análogo da camptotecina, é frequentemente utilizado como um agente único ou em combinação com outros fármacos anti-cancerígenos para o tratamento do cancro colo-rectal. No entanto, a resistência aos medicamentos de tumores é um grande obstáculo para o tratamento do câncer de sucesso. Neste estudo, nós estabelecemos que as células adquirem resistência crônica ao irinotecano. Nós perfilado sua expressão diferencial de genes utilizando microarrays. Depois de ontologia gênica (GO) e análise de caminho KEGG dos dados de microarrays, que especificamente investigado se Sestrin3 poderia diminuir a resistência irinotecan. Nossos resultados revelaram que Sestrin3 aumentou o efeito anticancerígeno de irinotecano

in vitro

em células LoVo que tinham adquirido resistência a irinotecan. células LoVo irinotecano resistente apresentou espécies reativas de oxigênio menor produção (ROS) do que suas células parentais irinotecan-sensíveis. produção de ROS foi aumentado em Sestrin3 knockdown em células LoVo irinotecano-resistente. Nossos resultados indicam que Sestrin3 pode ser um bom alvo para desenvolver terapias que podem ajudar a superar a resistência à irinotecan

Citation:. Choi SH, Hong Hong Kong, Cho YB, Lee WY, Yoo HY (2015) Identificação de Sestrin3 envolvidos na

In vitro

resistência de células de câncer colorretal para irinotecano. PLoS ONE 10 (5): e0126830. doi: 10.1371 /journal.pone.0126830

Editor do Academic: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 04 de novembro de 2014; Aceito: 08 de abril de 2015; Publicado: 14 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Choi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Todos os dados microarray arquivos estão disponíveis no banco de dados GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) através do número de acesso GSE59501

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da tecnologia Korea Saúde R D Projeto através da indústria da saúde Instituto de Desenvolvimento da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde Bem-estar, República da Coreia (HI14C3418), a Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2013R1A1A2060410) e Grant Samsung Medical Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a incidência de câncer colorretal é mais de um milhão por ano em todo o mundo, com uma taxa de mortalidade de até 33% nos países desenvolvidos [1]. O câncer colorretal é o quinto câncer mais comum. A quimioterapia tem sido reconhecido como sendo eficaz no tratamento do cancro colorrectal metastizado. Tipicamente, fluorouracilo (5-FU) tem sido usada como uma terapia única. No entanto, nas últimas duas décadas, a prática clínica tem sido o uso de drogas citotóxicas tais como fluoropirimidina, irinotecano, e oxaliplatina. regimes de quimioterapia de combinação padrão são FOLFIRI (ácido folínico, fluorouracil, e irinotecano), CapIri (capecitabina e irinotecano), FOLFOX (ácido folínico, fluorouracil e oxaliplatina), ou CAPOX (capecitabina e oxaliplatina). Substituindo irinotecano com oxaliplatina tem contribuído para a taxa de sobrevivência melhorada [2, 3]. O irinotecano (CPT-11), um derivado de camptotecina natural, é um importante fármaco terapêutico para pacientes com cancro colo-rectal metastático (CRC) [4]. O irinotecano é quimicamente convertido na sua forma activa, 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38), que inibe a topoisomerase I de ADN. O adiamento da topoisomerase na bifurcação de replicação por SN-38 induz uma quebra de cadeia dupla de ADN permanente, o que produz uma resposta danos no DNA (DDR). dano do ADN é detectada principalmente pelas cinases ATR e ATM, o aumento da actividade das quais leva à activação de cinases Chk1 do checkpoint /Chk2 e a subsequente fosforilação de p53. p53 fosforilada é mais estável, o qual pode activar a apoptose ou paragem do ciclo celular regular. p53 também desempenha um papel na resposta antioxidante, que foi descoberto através da identificação de um romance Sestrin (

SESN

) família de genes, que está envolvido em espécies reactivas de oxigénio (ROS) regulação [5]. Com base na análise da estrutura primária e secundária utilizando a programas 3DPSSM PSI-BLAST e, a

SESN

família é relatada para codificar proteínas antioxidantes [6, 7]. Sestrin proteínas têm um elevado grau de homologia com o

Mycobacterium tuberculosis

proteína AhpD, partilha semelhanças nos seus domínios do terminal N [5]. Eles são responsáveis ​​pela catálise da redução de peroxirredoxinas (Prdx) que metabolizam peróxidos [8]. A proteína AhpD, um componente de alquil-redutase hidroperóxido de participar na defesa contra ROS, é responsável para a regeneração de AhpC, um membro de uma família conservada de peroxidases específicos do tiol (Prxs) [9]. O

Sestrin1

e

Sestrin2

genes são transcricionalmente regulados sob o controle de p53, enquanto que

Sestrin3

é regulada pelo eixo AKT /FOXO, através FOXO1 gene /mediada por FOXO3a expressão [5, 10].

Sestrin3

também está envolvido na desintoxicação de ROS, bem como no atraso da senescência celular através FOXO [11]. Dos três membros da família Sestrin, o terceiro membro,

Sestrin3

, tem sido relatado na literatura para um menor grau do que os outros dois.

Embora irinotecano exibe uma potente actividade contra uma ampla gama de tumores, incluindo tumores colorretais, a resistência aos medicamentos continua a ser um grande obstáculo à quimioterapia eficaz. Portanto, são necessários novos alvos para superar a resistência aos medicamentos para o tratamento do câncer de sucesso. Várias hipóteses têm sido propostas sobre os mecanismos envolvidos na resistência a CPT, incluindo a redução do acúmulo celular de CPT devido ao efluxo activo por cassete de ligação de ATP (ABC) transportadores, sistemas enzimáticos relevantes para conversão metabólica, alteração na estrutura ou localização da topoisomerase I e alterações na resposta celular a-TOPI-DNA CPT formação do complexo ternário [7]. Apesar de várias abordagens experimentais foram tentadas clinicamente para superar os mecanismos individuais de resistência [7], notável sucesso ainda não foi alcançado.

Neste estudo, nós estabelecemos uma linha de células que a resistência adquirida crônica ao irinotecano. O nosso objectivo foi o de comparar o perfil de transcrição na linha celular de cancro colorectal irinotecano-resistente a que nas células parentais irinotecano-sensíveis, para procurar novos marcadores para aumentar a sensibilidade ao irinotecano. Nós também investigou se Sestrin3 poderia aumentar o efeito anticancerígeno do irinotecano

in vitro

, na linha celular de cancro colorectal irinotecan-resistente.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura condições

o colo-rectal HCT116 linhas celulares de cancro humano, HCT15, HCT29, KM12SM, SW620, DLD1, Colo205, e LoVo foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). As linhas celulares foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM, e 2,05 mM de L-glutamina, a 37 ° C. As linhas celulares foram periodicamente testadas quanto à identidade e a infecção por micoplasma, usando o kit de detecção de micoplasma MycoAlert (Lonza).

análise Western blot

As células foram lisadas em tampão RIPA (50 mM de Tris, 150 mM de NaCl , 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, e 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio) suplementado com inibidores de protease e inibidores de fosfatase. Os anticorpos utilizados para immunoblotting foram monoclonal de coelho anti-ATM (D2E2, a sinalização celular), policlonal de coelho anti-fosfo-Chk1 (Ser317, a sinalização celular), policlonal de coelho anti-ATR, TopBP1, CTIP (laboratórios Bethyl), e do rato monoclonal anti NBS1 (1D7, Novus Biologicals). Os anticorpos policlonais contra Sestrin3 foram adquiridos a Abcam. Monoclonal de rato anti-Chk1 (G-4) e anti α-tubulina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos contra AMPKα (23A3), fosfo-AMPKα (Thr72, 40H9), p70S6K e fósforo-p70S6K (Thr389, 108D2), mTOR (7C10) e fosfo-mTOR (Ser2448) foram adquiridos de sinalização celular.

o desenvolvimento da linha celular resistente ao irinotecano

para criar uma linha celular de cancro colorectal estável cronicamente resistentes a irinotecano, células LoVo foram expostas a irinotecano a uma concentração inicial de 0,1 mmol /l em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS. Quando as células em cultura atingiu uma confluência de 80%, 20% das células foram novamente plaqueadas para a próxima passagem. As células foram passadas 3 vezes com a mesma concentração de irinotecano para assegurar a sua adaptação e, em seguida, tratou-se com 2 vezes mais elevada concentração de irinotecano. A concentração de irinotecano foi aumentado sequencialmente até atingir uma concentração final de 8 umol /L. O irinotecan foi adquirido a Sigma-Aldrich.

A viabilidade celular e ensaios de citotoxicidade

linhas celulares de cancro colorrectal foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de células em meio RPMI 1640, suplementado com FBS a 10%. Após 24 h de incubação, o meio foi substituído com meio fresco contendo o irinotecano. Várias concentrações do irinotecano, foram utilizadas para tratar as células durante 72 h. A viabilidade celular ou citotoxicidade foi avaliada utilizando o ensaio de contagem celular Kit-8 (CCK-8), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 10 uL de CCK-8 solução foi adicionada a cada poço. As placas foram incubadas durante 2 h a 37 ° C. Os valores de absorvância foram medidas a 450 nm.

sobrevivência clonogénica ensaio

As células foram cultivadas num meio contendo irinotecano em concentrações de 0,05, 0,1, 0,4, 0,8, 1,5, e 3 uM, respectivamente . Após 24 h, as células foram destacadas e semeadas em placas de cultura de 60 mm. Após 14 dias, as colónias remanescentes foram lavados com PBS, coradas com violeta de cristal, e, em seguida, contados de acordo com tamanhos de colónias definidas. Todas as experiências foram repetidas vezes, independentemente, pelo menos, 3 vezes. A significância estatística da diferença no número de colónias foi determinado utilizando um teste t de Student bicaudal.

ciclo celular análise

Para a análise do ciclo celular, citometria de fluxo foi realizada utilizando células LoVo tratados com ou sem irinotecan. Resumidamente, as células foram descoladas com tripsina, lavadas com PBS e ressuspensas em 0,5 ml de PBS. Após fixação com 4,5 ml de etanol a 70%, as células foram incubadas em gelo durante 2 h. As células fixadas foram lavadas, ressuspensas em 1 ml de uma solução de iodeto de propídio coloração contendo 0,1% (v /v) de Triton X-100, 0,2 mg /ml de RNase A, e 20 ug /ml de PI, incubadas à temperatura ambiente durante 30 min, e depois mantidos em gelo até que a citometria de fluxo análise foi realizada.

a interferência RNA (RNAi)

Para silenciamento RNA transitória, as células foram transfectadas com Sestrin3 (siSESN3)-targeting siRNA ou com não-alvo siRNA (siControl), utilizando a lipofectamina RNAiMAX reagente de transfecção (Life Technologies).

Medição do celular ROS

a geração de ROS intracelular foi avaliada utilizando o reagente CellRox estresse oxidativo verde ( Invitrogen). Resumidamente, as células foram transfectadas com ARNsi durante 48 h e subsequentemente incubadas com 5 ^ M do reagente CellRox a 37 ° C durante 30 min. Depois de lavar duas vezes com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida usando microscopia de fluorescência.

Isolamento RNA e expressão gênica Profiling

No presente estudo, foi realizada a expressão gênica global análises usando Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST séries de oligonucleótidos utilizando células LoVo e LoVo células-R8 resistentes irinotecano cultivadas com ou sem irinotecano (8 uM). As amostras foram preparadas de acordo com as instruções e recomendações fornecidas pelo fabricante. O ARN total foi isolado utilizando colunas RNeasy Mini Kit (Qiagen). A qualidade RNA foi avaliada usando o Bioanalyzer Agilent 2100 com um RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies). A quantidade de ARN foi determinada utilizando o ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc.). As amostras de ARN (300 ng de cada) foram usados ​​como entrada para o processo de Affymetrix, tal como descrito no protocolo. Resumidamente, 300 ng de ARN total de cada amostra foi convertido em cDNA de cadeia dupla, utilizando um hexâmero aleatório incorporando um promotor de T7. ARN amplificado foi gerado a partir do modelo de cDNA de cadeia dupla, embora

In vitro

transcrição e purificou-se com o módulo de limpeza amostra Affymetrix. Os cDNAs foram regeneradas por transcrição inversa utilizando iniciadores aleatórios e uma mistura de dNTP contendo dUTP. cDNAs foram então fragmentado por UDG e APE 1 endonucleases de restrição e no final marcado por uma reacção de transferase terminal que incorporou um dideoxynucleotide biotinilado. ADNc fragmentados e marcados nas extremidades foram hibridadas utilizando o gene humano GeneChip 1.0 matrizes ST durante 16 horas a 45 ° C e 60 rpm, tal como descrito no gene chip inteiro Transcrição (WT) Sentido alvo Etiquetagem Ensaio Manual (Affymetrix). Após hibridação, os chips foram coradas e lavado no Fluidics Station Genechip 450 (Affymetrix), e digitalizados usando um scanner Genechip Matriz 3000 7G (Affymetrix). Para a análise estatística, uma chamada de detecção (Presente /Ausente) foi gerado pelo conjunto de microarray Affymetrix 5 (MAS5) algoritmo. Os arquivos raw digitalizados foram importados para o ambiente de programação estatística R (Version2.3), para posterior análise com as ferramentas disponíveis do Projeto Bioconductor. Expressão de dados foram normalizados e transformou-log2, usando o método robusto média de pastilhas múltiplas (RMA) implementado no pacote de RMA Bioconductor (M2, M3). Para reduzir o ruído na análise significado, sondar os conjuntos que não apresentem uma taxa de chamada detecção de, pelo menos, 50% das amostras foram filtradas para fora. genes altamente expressos que apresentam uma alteração de 2 vezes na expressão foram seleccionados. Os resultados foram classificados utilizando algoritmos de agrupamento hierárquico implementadas no software TMEV 4.0. dados de matriz foram depositados na Expression Omnibus Gene com o número de acesso GSE59501.

A análise estatística

In vitro

dados experimentais foram obtidos a partir de experimentos repetido três vezes em triplicado. Os valores médios foram calculados, e estava determinado significado, por meio do teste bicaudal de Student.

P

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Criação de linhas de células resistentes a irinotecan

Antes de gerar uma linha celular do cancro do cólon com resistência adquirida à irinotecan, testamos a citotoxicidade de irinotecano em várias linhas celulares de cancro colorrectal para identificar a mais sensível. De oito linhas de células, a linha celular LoVo foi o mais sensível ao irinotecano (Fig 1A). A citotoxicidade de irinotecano para células parentais resistentes e LoVo (LoVo-R) foi determinada utilizando o ensaio CCK-8. As células LoVo-R foram mais resistentes ao irinotecano do que as células LoVo parentais. O IC

50 valores de LoVo e LoVo-R parental eram 10 uM e 1,5 uM, respectivamente. Nós estabelecemos várias linhas de células resistentes utilizando diferentes concentrações finais de irinotecano. No entanto, níveis semelhantes de IC

50 foram encontrados entre as linhas de células resistentes, com diferentes concentrações finais de irinotecano (Fig 1B). A resistência da linha celular LoVo-R8 foi confirmada utilizando um ensaio clonogénico (Fig 1C). A linha celular LoVo-R8 adaptado para irinotecano a uma concentração final de 8 uM. É bem sabido que o irinotecan inibe especificamente a replicação do ADN por aprisionamento da topoisomerase I em cadeias de ADN, induzindo uma paragem do ciclo celular em G

2 fase. Para investigar o efeito de irinotecano na progressão do ciclo celular de células LoVo-R8, analisou-se ainda mais o ciclo celular desta linha celular (Figura 1D). As células parentais LoVo que foram tratadas com 5 uM de irinotecano demonstrou grave L

2 /H prisão. Após 24 h de tratamento irinotecan (5 M), a interrupção do ciclo celular no G

2 M-fase /foi observado apenas nas células LoVo dos pais, mas as células LoVo-8R tratados com ou sem irinotecan não mostrou diferença em a progressão do ciclo celular.

(a) a sensibilidade de oito linhas celulares de cancro do cólon para o irinotecano foi medida utilizando o ensaio CCK-8. Para o ensaio CCK-8, as células foram expostas a irinotecano em concentrações indicadas, durante 72 h antes da medição. A viabilidade celular foi apresentada como a percentagem em relação às células não tratadas. (B) A resistência das células LoVo estabelecidos para o irinotecano foi medida utilizando o ensaio CCK-8 e (C), o ensaio de sobrevivência clonogénica. As colónias que sobreviveram ao ensaio de sobrevivência clonogénica foi medida após uma incubação adicional durante mais 14 dias. (D) a progressão do ciclo celular de LoVo-R8. *

p

≤ 0,05.

Análise

Gene matriz expressão de células LoVo-R8 irinotecano resistente

Depois de estabelecer as linhas de células LoVo-8R irinotecano-resistente, investigamos os seus perfis de expressão de genes utilizando microarrays de ADN. Utilizando um critério de filtragem de pelo menos uma alteração de 2 vezes com

P

0,05, o número de genes com alterações na expressão em células LoVo-8R, em comparação com as suas células LoVo parentais, foi determinada. Um total de 599 e 566 genes foram supra-regulados e regulados negativamente, respectivamente, o que representa 3,5% do total de genes sondados (Fig 2A e 2B). A anotação funcional destes genes foi realizada, utilizando-se uma análise baseada em ontologia gene de propriedades biológicas. Os genes foram classificados em 15 grupos funcionais (Fig 2A e 2B). A maioria destes genes foram associados com a resposta inflamatória, a angiogénese, proliferação celular ou migração celular.

genes foram seleccionados utilizando um critério de filtragem de pelo menos uma alteração de 2 vezes em comparação com controlos com

p

0,05. Genes com expressão alterada na linha celular LoVo irinotecano-resistente, em comparação com a linha celular LoVo original, são classificados em 15 grupos funcionais com base nas ontologia gene. Os números de genes são apresentados em gráficos (A) e os números de genes sondadas nesta análise matriz e os valores percentuais de genes significativamente alterados são apresentadas num quadro (B). (C) análise de agrupamento hierárquico dos microarrays irinotecano resistente de expressão em células LoVo. Uma representação à base de aglomerado de genes alterados em células resistentes ao irinotecano com intensidade, normalizadas para a linha de células LoVo parental. Os genes que foram em relação a células LoVo parentais up-regulamentados são mostrados em vermelho, e aqueles que foram regulados negativamente são mostrados em verde. Os níveis de expressão destes genes foram alterados ≥1.5 vezes ou ≤0.6 vezes em linhas celulares resistentes LoVo-irinotecano, em comparação com a linha celular LoVo originais. símbolos de genes são mostrados na linha certa.

Um mapa de calor de agrupamento hierárquico (Fig 2C) mostra os padrões de mudança nos níveis de expressão de genes observadas nas células LoVo irinotecano-resistente. Um total de 24 genes foram mostrados para ser envolvida na via de irinotecan ou de ser genes relacionados paragem do ciclo celular, com base na análise das propriedades biológicas realizadas utilizando ontologia gene. Um total de 53 vias foram encontrados, com base na análise de caminho KEGG. O mapa de calor agrupamento inteiro é apresentado como dados complementares em S1 Fig. Foram também analisadas as funções dos genes conhecidos envolvidos na via de irinotecano de células de cancro colorrectal. CYP3A4 e CYP3A5 estão envolvidos na formação de carbonyloxycamptothecin, um metabolito inactivo do irinotecan. Os níveis de ARN de duas proteínas de ligação a ATP transmembranares cassete (ABC), ABCG2 (conhecida como proteína de resistência do cancro da mama) e ABCB1, foram dramaticamente sobre-regulada nas células irinotecano-resistente (fig 2C e S1 Tabela). Isto não é surpreendente, considerando o facto de que o efluxo de irinotecano em células tumorais é revelado como uma estratégia potencial para superar a resistência à droga.

A expressão de genes envolvidos na via de danos no DNA checkpoint

Para encontrar novos marcadores relacionados com a resistência irinotecano, foi investigada a expressão de vários genes envolvidos na sinalização de checkpoint de dano do DNA. As células LoVo sensível ao irinotecano demonstrou uma mesmos níveis em CTIP (proteína que interage CtBP) e TopBP1 (ligação de topoisomerase (ADN) II proteína 1) expressão, de uma forma dependente da dose. Em células LoVo irinotecano-resistentes, CTIP expressão foi mais ou menos aumento. No entanto, a expressão de TopBP1 não foi alterada. CHK1 (CHEK1, cinase de ponto de verificação 1) foi activada por 5 uM de irinotecano nas células LoVo parentais. No entanto, não foi de CHK1 activada nas células LoVo-8R tratados com a mesma concentração de irinotecano (Fig 3A). Por conseguinte, só CHK1 fosforilada mostrou um padrão de expressão diferencial em células irinotecan-sensíveis contra-resistentes (S2 FIG). A activação de CHK1 após a exposição à radiação (IR) ou radiação UV ionizante estava normal tanto em células sensíveis e irinotecano-resistente (Fig 3B). No entanto, o nível de fosforilação de CHK1 em resposta a IR e UV era mais elevada em células LoVo irinotecano-sensíveis. Estes resultados fizeram-nos investigar mais genes relacionados paragem do ciclo celular, para encontrar novos marcadores para resistência irinotecano.

(A) Expressão de vários genes envolvidos na resposta a danos no ADN em células resistentes irinotecano. CHK1 foi activado a 5 uM em células LoVo parental, mas as células LoVo resistentes não mostram a activação de CHK1. (B) o dano ao DNA, como IR e UV induziu a ativação de CHK1 em células LoVo e LoVo-8R. A fosforilação de CHK1 em resposta a IV (10 Gy) e UV (50 J /m

2) foi mais elevada em células LoVo do que em células LoVo-8R. Gráfico mostra o nível de fosforilação de CHK1. As diferenças foram consideradas significativas para

p Art 0,05 pelo teste t. *, A comparação entre as células LoVo vs células LoVo-R8.

Sestrin3 knockdown reforçada citotoxicidade celular irinotecan em células LoVo resistentes

Para encontrar marcadores para resistência irinotecan, analisamos o up-regulada genes que se verificou estarem envolvidos na paragem do ciclo celular, com base nos dados de microarray. Sestrin3 foi dramaticamente sobre-regulada nas células LoVo-R8 (Tabela 1). Sestrin3 knockdown não afectou a toxicidade de irinotecano para as células LoVo parentais. A quantidade relativa de ARNm de nível Sestrin3 foi aumentada em células LoVo-R8, e análise de Western blot mostrou nível de proteína Sestrin3 também foi aumentada em células LoVo-R8 (Figura 4A e 4B). Usando a análise de qPCR, Sestrin3 transcrição foi confirmada a ser regulada negativamente por transfecção siSESN3, mas a viabilidade das células LoVo não foi afetada pelo tratamento siSESN3 (Fig 4C). Sestrin3 knockdown diminuiu a resistência das células LoVo-R8 para irinotecano, reduzindo a sua IC

50 valor de 4 uM (Fig 4D). Sestrins, uma família de proteínas de stress-induzível, partilham um elevado grau de homologia com a proteína bacteriana AhpD que é responsável pela catálise da redução de peroxirredoxinas. Medimos o acúmulo de ROS sob níveis Sestrin3 regulamentadas em cada linha de células (Fig 4E). células LoVo-R8 mostraram uma menor acumulação de ROS que suas células LoVo parentais. Sestrin3 knockdown aumento da produção de ROS em ambos os tipos de células.

(A) A quantidade relativa de mRNA nível Sestrin3 foi aumentada em células LoVo-R8 pelo tempo real PCR. (B) De acordo com upregulated transcrição Sestrin3, western blot mostrou nível de proteína Sestrin3 foi também aumentada nos LoVo-R8. Tratamento do nível de proteína efetivamente regulada de aumento da Sestrin3 em LoVo-R8 Sestrin3 siRNA (siSESN3). (C) Sestrin3 transcrição foi regulada negativamente por transfecção siSESN3 na análise qPCR (esquerda). células LoVo era suscetível a irinotecano com a dose-dependente, e viabilidade de LoVo não foi afetada, mesmo sob tratamento siSESN3 (direita). As células foram tratadas com siSESN3 durante 48 h. Os meios de cultura foram modificados com o meio contendo a concentração indicada de irinotecano e ainda incubadas durante 72 h. A viabilidade das células é apresentado como a percentagem relativa à de células não tratadas. (D) Sestrin3 transcrito foi também regulada para baixo em LoVo-R8 siSESN3 por transfecção em análise qPCR (esquerda). células LoVo-R8 foi resistente a irinotecano, mas foi alterado para ser susceptível de irinotecano por tratamento siSESN3 (à direita). imagens (E) de fluorescência de ROS intracelulares corados com o reagente verde CellRox. As células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou siSESN3. O ROS foi medida após 48 h. (F) de transferência de Western que mostra os níveis de proteína de AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, p70S6K, e p-p70S6K em LoVo e LoVo-R8 com ou sem irinotecano. (G) O gráfico mostra os níveis de proteínas. As diferenças foram consideradas significativas para

p Art 0,05 pelo teste t. *, A comparação entre o grupo sem irinotecan vs grupo com 10 mM irinotecan em LoVo e LoVo-R8; #, A comparação entre LoVo vs LoVo-R8.

Em seguida, examinaram a fosforilação da AMPK, mTOR, e p70S6K para investigar se Sestrin3 afeta a resistência ao irinotecano através da via AMPK /TORC1 ( Figura 4F e 4G). células LoVo-R8 mostraram níveis de expressão mais elevados de AMP activada proteína quinase (AMPK) e fosforilação de AMPK que as células LoVo parentais. A fosforilação de mTOR e S6K (p70S6 cinase), um substrato mTORC1 foi aumentada em células LoVo-8R. Além disso, as células LoVo-8R mostrou activação constitutiva de AMPK e mTOR com ou sem irinotecano em comparação com células LoVo.

Discussão

O irinotecan tem sido amplamente avaliada como um agente único, bem como em regimes de combinação com outros fármacos quimioterapêuticos. Após a aprovação para o tratamento de câncer colorretal metastático, irinotecan tem sido usado para tratar uma série de outros tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, câncer gástrico, tumores cerebrais e câncer de mama. No entanto, a resistência aos medicamentos de tumor para Irinotecano tem limitado a sua eficácia em terapias clínicas. Foi estabelecida uma linha celular estável que é resistente ao irinotecano. A linha celular mais sensível foi seleccionado a partir de oito linhas celulares colorrectais, com base em ensaios de citotoxicidade. Nós induzida resistência crônica, expondo as células a um aumento da dose de irinotecano. Para confirmar a sua adaptação, células que adquiriram resistência foram cultivadas num meio isento de drogas durante três passagens. Após cultura em meio isento de droga, as células LoVo-R8, que tinha adquirido resistência a irinotecano mantido ao mesmo nível que as células recentemente estabelecidas. Os dados de microarray foram analisados ​​para identificar os principais genes que desempenham papéis importantes na resistência ao irinotecano. Foi obtido um total de 1165 genes diferencialmente expressos (degs). Uma análise enriquecimento Gene ontologia revelou que o nível de Sestrin3 foi dramaticamente aumentada. No entanto, os níveis dos outros dois membros da família Sestrin expressão, Sestrin1 e Sestrin2, foram ligeiramente alterado. Sestrins são uma família de proteínas altamente conservadas, stress-responsivo. Sestrin1 e Sestrin2 são transcricionalmente regulados pela p53. Sestrin3, regulamentada pelo fator de transcrição forkhead, exibe atividade oxidorredutase

in vitro

. Tem sido relatado que SESN3 pode proteger as células contra o stress oxidativo através da modulação peroxiredoxina regeneração (Prx) [10]. Esperava-se que a expressão Sestrin1 e Sestrin2 seria regulada para cima por vários agentes de dano de ADN são conhecidos por afectarem a progressão do ciclo celular, através da activação de p53. A partir dos nossos dados de matriz, S2 tabela apresenta os níveis de expressão de Sestrins, bem como os genes relacionados com a via de p53. Dos 24 genes identificados neste estudo como estando envolvido na via de irinotecano de cancro colorectal, os níveis de expressão

CES1

e

CES2

(envolvido na conversão da pró-droga para o irinotecano ) foram reduzidos em aproximadamente 25%. Dos 24 genes, que codificam as proteínas de ligação cassete de ATP (ABC) envolvidos no efluxo, como

ABCB1

e

ABCG2, eram os genes mais bem up-regulamentados. A resistência ao irinotecano é afectado pelos sistemas de reparação do ADN.

ERCC1

e

ERCC2

, que participam na reparação de excisão de nucleotídeos, mostrou algum aumento na sua expressão. No entanto, a expressão de

MLH1

e

MLH6

(envolvido no processo de reparo incompatível) mudou muito pouco. Dos 24 genes, os envolvidos na via apoptótica não apresentaram qualquer diferença na expressão entre as células sensíveis irinotecano e irinotecano-resistente. Considerando estas variações na expressão genética, a resistência adquirida à irinotecano em células LoVo-R8 pode ser devida a acumulação celular diminuída de irinotecan, ou a conversão de irinotecano a um metabolito activo SN-38, porque foi diminuído até certo ponto.

tratamento irinotecano está associada a paragem do ciclo celular G2. Nós investigamos a categoria de paragem do ciclo celular em Gene Ontology, para encontrar os objectivos-chave de resistência mediada pelo ciclo celular. Sestrin3 foi mostrado para modular Prx regeneração em células cancerosas. O nível de Sestrin3 expressão foi aumentado por meio da ativação da transcrição por FOXO1. Embora a família Sestrin está implicada no controlo do redox [5, 8, 12], estudos recentes têm demonstrado o papel de Sestrins na sinalização mTORC1. mTORC1 é inibida por membros da família Sestrin (SESN1 /2), através da activação mediada por AMPK do complexo TSC1 /2 [12]. Sestrin3 foi reportado para impedir mTORC1, com base na constatação de que FOXO1 /mediada por transcrição 3a-regulação de Sestrin3 prossegue para ativar a AMPK /TSC1 /2, o que, eventualmente, inibe a actividade mTORC1 [13]. Além disso, a activação mTORC1 leva à acumulação de ROS, resultando na activação de JNK sinalização /FOXO, e um circuito de retroalimentação positiva de expressão Sestrin [5, 14]. No entanto, o papel de Sestrin3 na oncogénese e resistência a drogas de cancro continua a ser ambígua. Exame da AMPK via /mTOR em células LoVo e LoVo-R8 mostraram que a AMPK sinal foi activada nas células tratadas irinotecano ou células irinotecano-resistentes (Fig 4F). Geralmente, espera-se que mTOR sinalização sob inibição por AMPK ativa induziria autofagia [15]. Em nosso estudo, no entanto, a ativação da AMPK não inibir a mTOR. Apesar de sinalização mTOR está intimamente associado com o sinal de AMPK e é de fato a jusante a AMPK, TSC1 /2 e Rheb são moléculas hub de mTOR via de sinalização integração de diversas entradas [16, 17]. O nosso estudo revela uma positiva ao invés de uma relação negativa entre a regulamentação AMPK e mTOR.

Nossos resultados e interpretações foram focados no efeito antioxidante do Sestrin3 sobre a resistência aos medicamentos contra o câncer. Em geral, as células de cancro submetidos a glicólise aeróbica para satisfazer a grande procura de nutrientes aplicada no ambiente celular e extracelular por sua proliferação rápida. Demandas de maior produção de energia trazem células cancerosas para enfrentar o estresse oxidativo grave, que ativa vários mecanismos de defesa e reparação contra as drogas genotóxicos, embora ROS também pode funcionar segundos mensageiros como específicas em cascatas de sinalização envolvidos na proliferação e diferenciação celular. Em células cancerosas, a acumulação de ROS pode estimular a proliferação celular, mutagênese e instabilidade genômica [18, 19]. Por conseguinte, a acumulação de grandes quantidades de ROS é detectada nas células transformadas com o

RAS

oncogene [18, 20, 21].