pulmão de não pequenas células (CPNPC) é o mais comum tipo de câncer de pulmão, que compreende cerca de 75-80% de todos os cânceres de pulmão. A gemcitabina é um medicamento de quimioterapia aprovado para NSCLC. O objectivo deste estudo foi desenvolver uma nova estratégia para melhorar a eficácia terapêutica de gemcitabina NSCLC pelo péptido iRGD co-administrado. Mostrámos que as taxas de expressão positiva do avp3, avp5 e NRP-1 na linha de células A549 foram 68,5%, 35,3% e 94,5%, respectivamente. A quantidade de Azul de Evans acumulado no tumor do grupo de Evans Blue + iRGD foi 2,5 vezes maior que a do grupo de azul de Evans. As taxas de inibição do crescimento dos tumores do grupo iRGD, o grupo A gemcitabina e o grupo Gemcitabina + iRGD foram 8%, 59,8% e 86,9%, respectivamente. Os resultados de estudos de mecanismos mostraram que a expressão de PCNA no grupo Gemcitabina + iRGD diminuiu 71,5% em comparação com o do grupo A gemcitabina. A taxa de apoptose no grupo Gemcitabina + iRGD foi de 2,2 vez que o grupo de gemcitabina. Portanto, o Péptido de penetração do tumor iRGD pode aumentar a capacidade de penetração no tumor e eficácia terapêutica da gemcitabina no xenoenxerto A549. A aplicação combinada de gemcitabina com iRGD pode ser uma nova estratégia para melhorar a eficácia terapêutica clínica de gemcitabina em doentes com NSCLC

citação:. Q Zhang, Zhang Y, Li K, Wang H, Li H, Zheng J (2015) uma nova estratégia para melhorar a eficácia terapêutica de gemcitabina para Non-Small Cell Lung Cancer pelo tumor de penetração Peptide iRGD. PLoS ONE 10 (6): e0129865. doi: 10.1371 /journal.pone.0129865

Editor do Academic: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, ITALY

Recebido: 25 de outubro de 2014; Aceito: 13 de maio de 2015; Publicação: 12 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Natural Science Foundation da província de Jiangsu (BK2012146, https://www.jstd.gov.cn/), National Natural Science Foundation da China (81.301.946, https://www.nsfc.gov.cn/), Jiangsu Escritório Provincial da Fundação de Ensino (JHB2012-34, https://www.ec.js.edu.cn/), China Pós-Doutorado Science Foundation projecto financiado (2013M540467, https://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml) e Fundação Xuzhou Medical College (2012KJZ23, https://www.xzmc.edu.cn/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declaram que não têm interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo e continua a mostrar um aumento da incidência [1, 2]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é o tipo mais comum de câncer de pulmão, que compreende cerca de 75-80% de todos os cânceres de pulmão [3]. O diagnóstico é feito freqüentemente em pacientes com doença em estágio avançado, e em quase dois terços de todos os casos, o câncer já se espalhou para além de uma área localizada na altura do diagnóstico [4-6]. Isto limita as opções para a terapia e leva a um prognóstico ruim, com uma sobrevida média de menos de 12 meses [7, 8]. A maioria dos pacientes com CPNPC apresentam doença irressecável, e, portanto, as opções atuais de tratamento de quimioterapia e radioterapia são paliativos na melhor das hipóteses [7, 9]. Muitas drogas citotóxicas tradicionais, incluindo vindesina, carboplatina, etoposido, ifosfamida, mitomicina e ciclofosfamida, têm sido utilizadas como monoterapia nos casos de NSCLC. Nos últimos anos, alguns novos agentes quimioterapêuticos, tais como vinorelbina, paclitaxel, docetaxel e gemcitabina também têm sido aplicados para o tratamento de NSCLC. No entanto, estes agentes quimioterapêuticos oferecem apenas pequenas melhorias na sobrevivência geral [10].

A gemcitabina é um análogo da desoxicitidina que é convertido in vivo em seus metabolitos activos, incluindo di- e trifosfato difluorodesoxicitidina [11]. O análogo de trifosfato de gemcitabina substitui um dos blocos de construção de ácidos nucleicos (neste caso, de citidina durante a replicação do ADN). Este crescimento prisões tumor processo e, finalmente, leva à apoptose. Outro alvo de gemcitabina é ribonucleótido-redutase. O difosfato análogo liga-se ao local activo da ribonucleótido-redutase e irreversivelmente a enzima inactiva. Uma vez que a enzima é inibida, a replicação do DNA e reparação são terminadas e apoptose é induzida [11-13]. Gemcitabina foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de avançado e metastático, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer de mama e câncer de ovário sozinho ou em combinação com outras drogas [14].

ensaios clínicos demonstraram que a gemcitabina pode prolongar a sobrevivência e melhorar a qualidade de vida de doentes com NSCLC avançado [14, 15]. Alguns estudos têm relatado que a gemcitabina produz consistentemente as taxas de resposta que excedem 20% quando usado como um agente único [14, 16, 17]. No entanto, gemcitabina muitas vezes não consegue alcançar o controlo de doenças adequado por causa da insuficiente citotoxicidade para as células tumorais e os efeitos secundários intoleráveis. A sobrevida média é estendida por apenas 2-4 meses, ea maioria dos pacientes morrem de progressão da doença [7, 9]. Portanto, um simples aumento na dose pode não melhorar o estado dos doentes; pelo contrário, isso pode levar a efeitos secundários graves.

Estudos anteriores demonstraram que a passagem de uma parede vascular e a penetração dentro do parênquima do tumor contra a pressão intersticial elevada em tumores permanecem um dos principais desafios para a terapêutica eficácia da maioria das drogas clínicas [18]. Alguns fármacos anti-cancro só pode penetrar uma distância de 3 a 5 diâmetros celulares dos vasos sanguíneos em tumores sólidos [19]. Por exemplo, a concentração de Doxorrubicina diminui exponencialmente à medida que a distância a partir de vasos sanguíneos do tumor aumenta, e atinge metade da sua concentração perivascular a uma distância de cerca de 40 uM [20]. A distribuição de trastuzumab (Herceptin), na zona interior de xenoenxertos de tumor da mama é também altamente heterogénea, o que resulta numa falta de exposição de muitas células tumorais para níveis detectáveis ​​do fármaco [21]. Portanto, o aumento da permeabilidade do tumor pode ser uma abordagem útil para aumentar a eficácia terapêutica dos fármacos de quimioterapia.

iRGD é um peptídeo de penetração do tumor (CRGDK /RGPD /CE) que tem uma permeabilidade específica em tecidos tumorais e na vasculatura tumoral [22]. O tripeptídeo RGD de iRGD pode vincular a aVp3 integrinas e avp5, as expressões de que são em grande parte restrita a tumores (incluindo vascularização do tumor e células) [22, 23]. Quando iRGD se liga a integrinas, a ligação peptidica entre os aminoácidos K ​​e G é clivado proteoliticamente por proteases associada à superfície celular; então, o motivo Regra C-end críptico (CendR) (CRGDK /R) é exposto. O motivo CendR seguida, liga-se a neuropilina-1 (NRP-1). A activação de NRP-1 aumenta a permeabilidade dos vasos sanguíneos e tecidos tumorais, o que permite que as drogas para penetrar no tecido interno do tumor muito mais facilmente [22-24]. Foi confirmado que iRGD tem potencial valioso como uma sonda de direccionamento para a imagiologia molecular de tumores e para a entrega da droga, e pode melhorar a eficácia de drogas até três vezes [24].

Neste estudo, combinamos gemcitabina com iRGD para tratar xenoenxertos de ratinhos nus de NSCLC humana estabelecidos com a linha de células A549. Os nossos resultados demonstraram que iRGD poderia estimular eficazmente A gemcitabina para inibir a proliferação de células tumorais e induzir a apoptose de células tumorais. A eficácia terapêutica in vivo também foi significativamente melhorada. Estes resultados sugerem que a terapia de combinação com iRGD pode ser um método prometedor para melhorar a eficácia clínica de gemcitabina para tratamento de NSCLC.

Materiais e Métodos

cultura celular

A A549 a linha de células derivadas de NSCLC humano foi adquirido a partir da Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), e cultivadas em meio F-12K (Gibco, Grand Island, NY, EUA) com 10% de fetal de soro bovino (Gibco, Grand Island, NY, EUA) e 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA).

A citometria de fluxo

Um total de 1 × 10

6 células A549 foram incubadas com anticorpos fluorescentes marcado diluído em 100 de solução salina tamponada com fosfato ul (PBS) durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas, suspensas e avaliadas com uma máquina de FACS (FACSCanto II, Becton-Dickinson, EUA). Um anticorpo de controlo de isotipo foi utilizado em todas as análises. Finalmente, todos os dados foram analisados ​​pelo software FlowJo (árvore da estrela, EUA). anticorpo de integrina avp3 conjugado com FITC de murganho anti-humano e de integrina avp5 anticorpos foram adquiridos a Chemicon (CA, EUA). O anticorpo de controlo de isotipo, de rato conjugado com FITC IgG1K, foi adquirido a partir de eBioscience (San Diego, CA, EUA). rato conjugado com PE NRP-1 anticorpo anti-humano e seu controle isotipo foram adquiridos de MACS Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Nordrhein-Westfalen, Alemanha).

Ratos e in vivo

in vivo experiências envolveram ratos 6 semanas de idade do sexo feminino BALB /C nu (Vital River Laboratory animal Technology Co., Ltd, Beijing, China), que foram alojados em biotério livre de patógenos específicos do Centro Experimental animal, Xuzhou Medical College (China ). Os animais foram alojados com uma luz de 12 horas ciclo /escuro, em temperatura (22 +/- 1 ° C) e humidade (55 +/- 5%) ambiente controlada. Todos os ratos tiveram acesso livre à água estéril e alimentos. Todas as gaiolas alojados até 6 animais e aparas de madeira contidos e um sistema de fornecimento de ar independente. Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados e revistos pelo Comité Institucional de Animal Care and Use of a Jiangsu Provincial Academia de Medicina Chinesa (SCXK 2012-0005). Durante os experimentos in vivo, os animais em todos os grupos experimentais foram examinados diariamente para a atividade física. No final da experiência, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical.

modelo de tumor

O modelo NSCLC humano foi estabelecida como previamente descrito [25]. Em resumo, 1 x 10

7 células A549 foram injectadas nas axilas membro esquerdo de ratinhos nus de 6 ratinhos BALB /c. Quando os tumores cresceram até cerca de 150 mm

3, os tumores foram colhidos e segmentados em blocos de tecido (4-6 mm

3 em tamanho). Em seguida, as axilas membro esquerdo de ratinhos nus BALB /c foram inoculados s.c. com os blocos de tecido, utilizando um trocarte. Os ratos foram tratados quando os tumores cresceram até ao tamanho desejado.

Imunofluorescência coloração

Quando os tumores atingiram cerca de 200 mm

3, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram dissecados e seccionados num crióstato. As secções dos quatro grupos (n = 3) foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o mesmo anti-humano avp3, avp5 e seus anticorpos de controlo de isotipo como os utilizados na análise de citometria de fluxo. As secções dos dois grupos foram coradas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo primário de coelho anti-humano de NRP-1 (Abcam, Beverly, MA, EUA) e o seu anticorpo de controlo de isotipo (Abcam, Beverly, MA, EUA). Em seguida, as secções foram coradas com uma IgG anti-coelho de cabra conjugado com 549 DyLight (H + L) anticorpo secundário (EarthOx, San Francisco, CA, EUA) a 37 ° C durante 1 hora. foram então observados e fotografados todas as seções com um microscópio de fluorescência (DS-Ri1, Nikon, Japão).

Tumor permeabilidade ensaio

Quando os tumores atingiram cerca de 150 mm

3, um total de 50 mg /kg de azul de Evans, 4 mg /kg iRGD, 50 mg /kg de azul de Evans + 4 mg /kg iRGD em 200 ul de PBS como veículo, ou 200 ul de PBS por si só foram injetadas nos quatro grupos de ratinhos portadores de tumores (n = 3), respectivamente. Trinta minutos mais tarde, os ratinhos foram anestesiados com hidrato de cloral e foram perfundidos através do coração com PBS com 1% de BSA. Em seguida, os órgãos e tecidos de tumor foram recolhidas. Para quantificação de Azul de Evans, 10 uL de N, N-dimetilformamida foi adicionado para cada 10 mg de tecido. Após homogeneização, as misturas foram incubadas a 37 ° C durante 24 horas, as misturas foram depois centrifugadas, e os sobrenadantes foram colhidos. Finalmente, a quantificação foi realizada através da medição da absorvância a 600 nm com um espectrofotômetro (BioTek Epoch, EUA).

In vivo os estudos de eficácia

Quando os tumores atingiram cerca de 100 milímetros

3 após 10 dias, os ratinhos foram divididos em quatro grupos (n = 6). Ao todo, 100 mg /kg de gemcitabina (Merck, Darmstadt, Alemanha), 4 mg /kg iRGD, 100 mg /kg de gencitabina + 4 mg /kg iRGD em 200 ul de PBS como veículo, ou 200 ul de PBS por si só foram injectados no ratos dos quatro grupos, através da veia da cauda. As injecções foram administradas duas vezes por semana para um total de 8 vezes. O volume dos tumores foi medido em duas direcções perpendiculares, com um compasso de calibre, e o peso dos ratinhos nus foi calculada a cada três dias. O volume foi medido utilizando a seguinte fórmula: V = 0,5 × (W

2 × G), em que V = volume do tumor, W = perpendicular menor diâmetro e L = maior diâmetro perpendicular. No dia 30, os ratinhos foram sacrificados, os tumores foram recolhidos e pesados. A razão de inibição do crescimento do tumor (TIGR) foi calculada usando a fórmula TIGR = (W – W

T) /W x 100%, onde W é o peso médio do tumor do grupo de controlo e W

t é a média o peso do tumor do grupo de tratamento. Todos os tumores foram cortados em duas partes, respectivamente, e foram processados ​​tal como descrição seguinte.

imuno coloração

Uma metade de cada tumor colhidas no final do estudo de tratamento foram fixadas em 10% neutra formalina tamponada, embebidos em parafina, cortados em secções e 3-5μm [26]. As experiências foram realizadas com um sistema de estreptavidina-peroxidase (SP), de acordo com o protocolo do fabricante (BIO-ZSGB, Pequim, China). antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) foi detectado com um PCNA anti-anticorpo (Abcam, Beverly, MA, EUA). A visualização foi realizada através de microscopia de fluorescência (DS-Ri1, Nikon, Japão). Para determinar o índice de PCNA IOD, cinco zonas visuais representativos que foram positivas para PCNA foram examinados a partir de cada tumor. O índice de PCNA para cada área seleccionada foi analisado utilizando o software de IPP.

ensaio TUNEL

As secções de parafina foram preparadas como descrito acima. As células apoptóticas foram detectadas utilizando um kit de TdT-dUTP mediada marcação terminal usuario (TUNEL) de acordo com o protocolo do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). O número de células positivas TUNEL foi contado em cinco campos seleccionados aleatoriamente a partir de cada tumor, e o índice apoptótico para cada campo foi calculada como a percentagem de células positivas TUNEL-100 em relação a células seleccionadas aleatoriamente.

? Western blot? análise

A outra metade de cada tumor foi congeladas em nitrogênio líquido. Em seguida, a proteína total foi extraída. PCNA foi detectada por transferência Western normal com o mesmo anticorpo anti-PCNA que o utilizado na experiência imuno-histoquímica. IRDye 800CW IgG de cabra anti-coelho (H + L) anticorpo (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA) foi utilizado como anticorpo secundário. β-actina também foi detectado como um controlo interno. As imagens foram obtidas pela Odyssey (LI-COR, EUA) e quantificações intensidade das bandas de Western blot foram realizadas pelo software ImageJ (National Institutes of Health, EUA).

A análise estatística

SPSS versão 16.0 para Windows foi utilizado para todas as análises. Os dados quantitativos são apresentados como a média ± desvio padrão (SD); uma comparação entre diferentes grupos foi realizada por amostra independente-t-teste, enquanto que várias amostras foram comparadas com um ANOVA de uma via, com α = 0,05 como o nível para o teste. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos em P 0,05.

Resultados

A expressão de NRP-1, ανβ3 e ανβ5 na linha de células A549 derivados de NSCLC humana

A expressão das integrinas é em grande parte restrita a tumores (incluindo a vasculatura do tumor e as células), e outros locais de angiogénese ou a reparação dos tecidos [22, 27]. A neuropilina-1 também é sobre-expressa em muitos tumores [22, 28]. A capacidade de penetração no tumor de iRGD depende principalmente das moléculas ανβ3, ανβ5 e NRP-1 sobre-expressa em células cancerosas [18]. A fim de confirmar a expressão destas moléculas na linha celular A549 NSCLC humano, foi realizada uma análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Fig 1A, as taxas de expressão positiva de avp3, avp5 e NRP-1 foram 68,5%, 35,3% e 94,5%, respectivamente. Este resultado demonstrou que a linha de células A549 pode ser usado para estabelecer um modelo de NSCLC humano para estudar os efeitos de iRGD co-administrado.

(A) Análise da expressão de avp3, avp5 e NRP-1 em células A549 por citometria de fluxo. (B) Análise da expressão de avp3, avp5 e NRP-1 em xenoenxertos A549 por coloração por imunofluorescência. EG, grupo experimental; CG, grupo controle. Ambos avp3 e avp5 estão manchadas verde. NRP-1 está manchado de vermelho. Os núcleos são corados azul. Ampliação, × 400; Barras de escala = 50 mm.

Para confirmar a expressão de ανβ3, ανβ5 e NRP-1 em tecidos tumorais, desenvolvemos a /c nu modelo de xenoenxerto de ratinho BALB com a linha de células A549 NSCLC humano. A expressão de avp3, avp5, e NRP-1 foi ainda detectado por imunofluorescência. Como mostrado na Fig 1B, aVp3 (esquerda), avp5 (meio) e NRP-1 (para a direita) foram sobre-expressos em tecidos de xenoenxerto.

tumoral-a penetração de Azul de Evans de co-administrado com iRGD

para confirmar o efeito in vivo do péptido iRGD-tumoral penetrante, corante azul de Evans foi utilizado como uma droga modelo para determinar se iRGD pode promover a absorção de uma droga num tumor [18]. Azul de Evans é um corante de ligação a albumina, que pode penetrar os órgãos através do sangue e os órgãos de corante azul. Comparado com os controlos, os tumores do grupo de Evans Blue + iRGD foram tingidos de um azul mais profundo, o que era visível a olho nu. No entanto, a cor azul dos órgãos normais, incluindo o coração, fígado, baço, pulmão e rim, não foi evidente (Fig 2A e 2B). Para confirmar adicionalmente que o efeito de iRGD para promover especificamente a absorção de corante azul de Evans no tecido tumoral, o azul de Evans nos tumores e órgãos foi extraído e analisado quantitativamente por espectrometria. Os resultados mostraram que, em geral, a quantidade de Azul de Evans no grupo de Azul de Evans e no grupo de Azul de Evans + iRGD foi maior do que no grupo de PBS ou iRGD (Fig 2C). A quantidade de azul de Evans nos tumores do grupo de Evans Blue + iRGD foi 1,5 vezes maior do que no grupo de Azul de Evans (Fig 2C). No que diz respeito aos outros órgãos, não foi observada nenhuma diferença aparente entre o grupo de Azul de Evans e Azul de Evans do grupo iRGD + (Fig 2C). Estes dados demonstram que iRGD tem o potencial para promover especificamente a absorção de fármacos e permitir-lhes penetrar no tumor.

(A) As imagens representativas de acumulação de Azul de Evans em órgãos normais e em tumores de murganhos que receberam diferentes tratamentos. A intensidade da cor azul indica a quantidade de Azul de Evans acumulada. (B) Imagens do tumor em (A). (C) Quantificação de azul de Evans extraída a partir de tumores e órgãos em (A) por medição de OD600. n = 3; As barras de erro, significa ± SEM; ***

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A eficácia terapêutica de gemcitabina co-administrado com iRGD

Para determinar a concentração apropriada de gemcitabina para experiências in vivo, quatro doses de gemcitabina (80 mg /kg, 100 mg /kg, 120 mg /kg e 140 mg /kg) foram utilizados para tratar grupos de quatro ratinhos duas vezes uma semana, durante duas semanas, respectivamente. Duas semanas mais tarde, os ratinhos de 80 mg /kg e 100 mg /kg grupos pareciam normais. No entanto, foi evidente que os ratos de 120 mg /kg grupo faltava energia e sofreram uma perda de apetite. Além disso, os ratos do grupo de 140 mg /kg, tinham diarreia. Para reduzir o impacto dos efeitos secundários, escolhemos a dose de 100 mg /kg em experiências in vivo.

Para determinar se a eficácia terapêutica de gemcitabina será melhorada quando administrado em combinação com iRGD, gemcitabina e iRGD foram co-administrados para tratar os ratinhos com xenoenxertos A549 tal como descrito na secção de Métodos. Como mostrado na Fig 3A, os tumores do grupo de Gemcitabina + iRGD cresceram mais lentamente do que aqueles do grupo de gemcitabina, e esta diferença era estatisticamente significativa. Esta observação foi também confirmada por uma análise do peso do tumor (Fig 3B). A taxa de inibição do crescimento dos tumores foi ainda analisada. O grupo iRGD, o grupo gemcitabina, e o grupo Gemcitabina + iRGD mostrou uma taxa de inibição do crescimento do tumor de 8%, 59,8% e 86,9%, respectivamente. Estes resultados demonstraram que iRGD poderia aumentar a eficácia terapêutica da gemcitabina NSCLC xenoenxertos humanos em que foram co-administrados. A análise de mudança de peso corporal dos ratinhos experimentais mostrou que o peso corporal dos ratos, tanto no grupo de gemcitabina e o grupo Gemcitabina + iRGD diminuiu aproximadamente 5% no final da experiência. No entanto, não se observou nenhuma diferença significativa entre os dois grupos (Fig 3C). Estes resultados demonstraram que iRGD obviamente não exacerbar os efeitos colaterais de gemcitabina.

(A) A curva de volume do tumor durante o tratamento. As setas indicam o momento da injecção. O dia em que começou o tratamento foi registado como dia 0. O volume do tumor foi medido uma vez a cada três dias até ao dia 30. (B) O peso médio do tumor de cada grupo no final do tratamento. (C) A curva de deslocamento do peso corporal dos ratos durante a experiência. n = 6. As barras de erro, significa ± SD; ns, não significativo; ***

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A inibição da proliferação de células após o tratamento com a co-administrada gemcitabina e iRGD

gemcitabina exerce um efeito terapêutico contra o cancro através da inibição da síntese de ADN nas células cancerosas e interrupção do seu progresso da fase G1 para a fase S [3, 29, 30]. PCNA, uma proteína de 36 kDa, é expresso principalmente durante a fase S e G2 fase precoce do ciclo celular em células de proliferação [31]. Portanto, PCNA pode ser utilizado como um marcador de proliferação celular. Para confirmar ainda mais a função de iRGD no aumento do efeito anti-tumoral da gemcitabina, o nível de expressão de PCNA nos tumores foi detectada por coloração imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig 4A, o nível de expressão de PCNA foi significativamente reduzida em ratos que foram tratados com gemcitabina (com ou sem iRGD) em comparação com o nível de expressão em ratinhos que receberam PBS ou iRGD; o nível de expressão de PCNA foi menor nos ratos que foram tratados com gemcitabina + iRGD em comparação com ratinhos que foram tratados com gemcitabina sozinha. Para a análise quantitativa da figura 4A, o nível de expressão de PCNA no grupo Gemcitabina + iRGD foi reduzida em aproximadamente 71,5% comparada com a do grupo de gemcitabina, e esta diferença era estatisticamente significativa (Figura 4B). Além disso, o tecido de tumor do grupo de Gemcitabina + iRGD mostraram anomalias estruturais em ninhos de cancro e alterações morfológicas na maioria dos núcleos. As alterações morfológicas nos núcleos será descrito em detalhe mais tarde no manuscrito.

(A) Análise de coloração imuno-histoquímica. células PCNA-positivas nas seções estão manchadas marrom. Os núcleos são corados azul. figuras representativas de cada grupo são apresentados; n = 6; Ampliação, × 400; Barras de escala = 50 uM. (B) Os correspondentes resultados de análise quantitativa de PCNA são mostrados em (A). Cinco campos de cada secção de tecido do tumor foram seleccionados aleatoriamente para o cálculo do valor IOD da região positiva através de um software de IPP, o que indica a quantidade de expressão do antigénio. (C) análise de transferência de Western. A proteína total a partir dos tecidos tumorais foi extraída. PCNA foi detectado com β-actina como um controlo interno. n = 3. (D) Os resultados da análise quantitativa de PCNA são mostrados em (D). A intensidade de cada faixa foi analisada pelo software ImageJ. As intensidades médias de PCNA foram padronizados para a p-actina. As barras de erro, significa ± SD; ns, não significativo; ***

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Para confirmar ainda mais o nível de PCNA expressão, foram extraídas da proteína total dos tecidos tumorais em cada grupo. Os níveis de PCNA foram detectados por Western blotting com β-actina como um controlo interno. Cada faixa foi digitalizado, e uma análise quantitativa foi realizada com o software ImageJ. O nível de expressão de PCNA em tecido de tumor de ratinhos do grupo de Gemcitabina + iRGD foi significativamente reduzida em comparação com o de ratos no grupo de gemcitabina (Figura 4C e 4D).

Juntos, estes resultados confirmaram ainda que o a eficácia terapêutica de gemcitabina foi aumentada quando foi co-administrado com o péptido de penetração do tumor iRGD.

a indução da apoptose por co-administrada gemcitabina e iRGD

Demonstrou-se que a gemcitabina pode inibir replicação do DNA e reparação, que em última análise leva a célula a apoptose [3]. Para confirmar a eficácia terapêutica aumentada do co-administrada gemcitabina e iRGD, células apoptóticas em xenoenxertos tratados foram detectados utilizando um ensaio de TUNEL. Como mostrado na Fig 5A, as células apoptóticas foram mais visível nos tumores do grupo Gemcitabina + iRGD do que em tumores do grupo de gemcitabina. O índice apoptótico foi definida como a percentagem de células positivas TUNEL-versus o número total de células. De acordo com a análise estatística mostra na Fig 5B, a taxa de apoptose do grupo Gemcitabina + iRGD foi de 2,2 vez que o grupo de gemcitabina. Estes resultados confirmam ainda que iRGD aumentada a eficácia terapêutica de gemcitabina nos xenoenxertos de NSCLC.

(A) células apoptóticas nos tecidos de tumor foram detectadas através de um ensaio de TUNEL. núcleos TUNEL-positivas são manchadas marrom, e os núcleos TUNEL-negativos estão manchadas azul. Os valores aqui apresentados são representativos de seis tumores em cada grupo. As setas indicam os corpos apoptóticos. Ampliação, × 400; Barras de escala = 50 uM. (B) A análise quantitativa do índice de apoptose em cada grupo. A percentagem de células positivas TUNEL foi contado a partir de 100 células de tumor seleccionadas aleatoriamente por secção. Cinco secções foram contadas por tumor. n = 6; As barras de erro, significa ± SD; ***

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Discussão

Este estudo teve como objetivo reavaliar o uso de peptídeo iRGD, demonstrou que aumentou a acumulação e eficácia terapêutica de drogas no xenotransplante NSCLC estabelecida com células A549 linha que mostrou alta expressão de avp3, avp5 e NRP-1. Os nossos dados mostraram que iRGD foi capaz de aumentar significativamente o tumor-penetração de Azul de Evans, bem como a eficácia terapêutica da gemcitabina no xenoenxerto NSCLC humana. A avaliação posterior mostrou que a proliferação e apoptose de células tumorais no grupo iRGD + gemcitabina foi mais inibiu significativamente do que no grupo controle.

Em 2009, Teesalu et al. primeiro relataram a regra péptido C-terminal (iRGD), e demonstraram que o péptido possui a actividade de células, vasculares e penetração do tecido NRP-1-dependente [32]. Os relatórios subsequentes mostraram que iRGD poderia melhorar a divulgação e antitumoral eficácia intratumoral de Doxorrubicina [33-35], Paclitaxel [36, 37] e endostatina [38] através da conjugação com estas drogas ou veículos carregados com a droga em experiências com animais. Os outros relatórios demonstraram que iRGD também pode aumentar a acumulação e eficácia antitumoral intratumoral de paclitaxel, doxorrubicina, Transtuzumab [24, 39], A cisplatina [40], por co-administração com esses fármacos. Em 2014, Akashi et al. informou que gemcitabina foi coadministrated com iRGD para tratar o câncer de pâncreas em modelos murinos [41]. Para o nosso conhecimento, este estudo demonstrou, em primeiro lugar a eficácia da co-administrado iRGD e gemcitabina na xenotransplante NSCLC humana estabelecida com linha de células A549.

O relatório de Akashi mostrou que os modelos de câncer pancreático sobre-expressar NRP-1 são sensíveis a co-administração iRGD. O tratamento com o péptido de gemcitabina mais iRGD resultou numa redução significativa do tumor em comparação com a monoterapia com gemcitabina nos modelos de cancro pancreático com estabelecidas linhas de células [41]. Os nossos resultados mostraram que ανβ3, ανβ5 e NRP-1, que medeiam a actividade tumoral-a penetração de iRGD, foram sobre-expressos em A549 A linha de células humanas NSCLC e xenoenxerto estabelecidos com esta linha de células. A eficácia terapêutica de gemcitabina foi significativamente aumentada pela co-administrado iRGD no murino modelo de cancro NSCLC. Em conjunto, estes estudos confirmaram os efeitos do iRGD para aumentar a difusão e intratumoral eficácia anticancerígena em modelos de cancro da NRP-1-sobre-expressos.

A gemcitabina é um análogo de nucleósido amplamente utilizado como a quimioterapia de primeira linha de NSCLC avançado [42 ]. etal Gridelli. informou que a taxa de resposta (RR) entre 233 pacientes receberam gemcitabina foi de 16%, enquanto que o tempo médio de progressão ea sobrevida global (OS) eram 17 semanas e 28 semanas, respectivamente [43]. O estudo MILES-2G fase 2 do agente único gemcitabina em pacientes idosos com NSCLC avançado mostrou um RR 17,6%, um tempo médio de progressão da doença de 16,1 semanas e OS mediana de 41,3 semanas [44]. Vários outros estudos que empregam gemcitabina sozinha mostrou mesma atividade com a RR ea PFS mediana e OS variando 16-38,5%, 3-5.4 e 6.6-7.7 meses, respectivamente [45-48]. Portanto, a eficácia terapêutica da gemcitabina NSCLC tem o espaço para ser ainda mais melhorada. Os nossos resultados mostraram que o péptido iRGD aumenta os efeitos de gemcitabina co-administrados no xenoenxerto de NSCLC. Estes resultados demonstraram a possibilidade de que iRGD melhora o efeito de gemcitabina em doentes com NSCLC.

No entanto, a eficácia de iRGD só é apreciável na linha celular empregando. A aplicação clínica deve ser dada uma consideração cuidadosa. O entendimento actual do mecanismo pelo qual iRGD melhora a eficácia terapêutica da gemcitabina NSCLC é limitada. Embora sem efeitos colaterais evidentes foram observados em nosso estudo, a segurança desta terapia de combinação ainda precisa de uma avaliação mais aprofundada. O motivo de CendR iRGD também podem ser utilizados por vírus e toxinas microbianas, a fim de obter a entrada nas células e espalhar dentro dos tecidos do corpo [49, 50]. iRGD também pode promover a absorção de gemcitabina em tecidos normais que estão danificados, ea reparação dos tecidos que se segue pode causar mais danos ao corpo.

Conclusão

Em resumo, através de um A549 NSCLC humana nu modelo de xenoenxerto de ratinho, foi confirmado que iRGD pode promover a inibição da proliferação de células tumorais e a indução de apoptose por gemcitabina e, por conseguinte, aumentar a eficácia terapêutica de gemcitabina in vivo. A co-administração de gemcitabina e iRGD pode ser uma nova estratégia para melhorar a eficácia terapêutica clínica de gemcitabina em doentes com NSCLC.