Abstract

células estaminais mesenquimais do tecido adiposo (ADSCs) são uma importante fonte de células para a medicina regenerativa . O efeito terapêutico de células estaminais derivadas de tecido adiposo expandidas em cultura foi mostrada; No entanto, as condições óptimas de cultura livre de xeno continuam a ser determinado. Os pacientes com câncer, especificamente aqueles submetidos a cirurgia invasiva, constituem um subgrupo de pacientes que poderiam se beneficiar do transplante de células-tronco autólogas. Embora o potencial regenerador das suas ADSCs podia ser afectado pela doença e /ou tratamento, não temos conhecimento de qualquer estudo que avaliou o potencial terapêutico de ADSCs isoladas a partir de doentes com cancro, em referência à de ADSCs derivadas de indivíduos saudáveis. Aqui nós relatamos que ADSCs isoladas de tecido adiposo subabdominal de pacientes com neoplasias urológicas rendeu cinética de crescimento semelhantes, apresentados marcadores de superfície mesenquimais equivalentes e mostrou potencial de diferenciação semelhante em linhagens de células mesodermal distintas: adipócitos, condroblastos e osteoblastos que ADSCs isoladas de tecido adiposo de etário pareados participantes não-oncogênicos, todos sob condições de cultura de crescimento isento de Xeno. cariótipo molecular de pacientes expandido genomas ADSCs não apresentaram alterações relacionadas com a doença, indicando a sua segurança. Além disso, vesículas 100 nm identificado como exossomas (exos) que pode ser pelo menos parcialmente responsável pelos efeitos parácrinos terapêuticos atribuídos dos ADSCs foram efectivamente isoladas a partir de ADSCs e mostrou um teor de miARN equivalente independentemente eles eram derivados de pacientes com cancro ou não- participantes oncogênicos indicando que as capacidades de reparação de ADSCs expandido livre de xeno não sejam comprometidas pela condição do paciente e ADSCs, portanto, sua cultura livre de xeno expandidos devem ser adequados para o transplante de células-tronco autólogas em um ambiente clínico

Citation:. García -Contreras M, Vera-Donoso CD, Hernández-Andreu JM, García-Verdugo JM, Oltra E (2014) potencial terapêutico das células estaminais humanas adiposo-derivados (ADSCs) de pacientes com câncer: um estudo piloto. PLoS ONE 9 (11): e113288. doi: 10.1371 /journal.pone.0113288

Autor: Carlos Eduardo Ambrósio, da Faculdade de Ciências Animais e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil, Brasil

recebida: abril 11, de 2014; Aceito: 21 de outubro de 2014; Publicação: 20 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 García-Contreras et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Generalitat Valenciana (concede AP-014-10 e AP-222-11 para JMHA), Universidad Católica de Valência ” San Vicente Mártir “(concessão 2012-006-010 para JMHA) (subvenções 2011-011-02, 2011-011-04 e 2012-011-008 para eO), e do Instituto AITEX of Technology (concessão 2011-011-015 ao óxido de etileno). MGC recebeu uma bolsa da Universidade Católica de Valencia “San Vicente Mártir”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Todos os autores declararam não existem interesses conflitantes

Introdução

tecido adiposo humano é uma fonte abundante e acessível de células-tronco mesenquimais multipotentes (MSCs) que possuem grande potencial para aplicações terapêuticas em medicina regenerativa e engenharia de tecidos [1] – [3]. MSCs foram mostrados para serem capazes de se diferenciar em vários tipos de células da linhagem mesodérmica (osteoblastos, condrócitos e adipócitos), mas também na não-mesodérmica células da linhagem (neurónios, cardiomiócitos e pele ectodérmica) [4] – [7], reduzir a inflamação em tecidos danificados, estimulam a angiogénese e reduzir a apoptose [8] – [11]. MSCs papel na modulação da reparação dos tecidos e na imunomodulação tem sido atribuída ao seu potencial de secreção do factor parácrino, transferência mitocondrial e capacidade exossomo (exo) a secreção de [12] – [14]. Exos são secretados vesículas de membrana bilipídica de ~50-100 nm com uma carga complexa, que são facilmente internalizados pelas células alvo induzir efeitos fisiológicos variados [15] – [17]

Até à data diferentes métodos de isolamento e expansão. das MSCs foram aplicadas. A maioria dos animais incluem produtos derivados, como soro fetal de bovino, que é uma fonte de contaminação de vírus, bactérias, micoplasmas, priões ou outros agentes patogénicos ou tóxicos, e de antigénios xenogénicas que pode basculante respostas imunes indesejáveis ​​[18], [19]. cultura livre de Xeno poderia aumentar a segurança ea qualidade do

in vitro

células-tronco transplantadas -expanded [20], [21] e permitir o estabelecimento de métodos de expansão padrão, evitando variações de lote para lote. Contudo, a sua novidade e a grande diferença no preço limitar o número de estudos que utilizaram meio isento de xeno até agora.

Apesar de infusão alogênico de

in vitro

expandiu MSCs parece como uma opção promissora para certos fins [22] – [25] a maioria dos ensaios clínicos em curso ou concluídas até à data são baseados em tratamentos autólogos [26]. Neste sentido, a idade avançada e estado de doença pode limitar as opções individuais, especialmente desde que o número e potencial regenerativo de CTMs parece estar correlacionada negativamente com a idade [27], [28] e envelhecimento da população está em aumento.

Urologia pacientes com cancro são bons candidatos para agentes terapêuticos à base de células estaminais. Stem terapias celulares direcionados para promover a cicatrização após os procedimentos de cirurgia invasiva que muitas vezes se submetem ou concebidos para diminuir a incontinência urinária, um problema secundário comum associado à prostatectomia poderia resultar um benefício para eles. Além disso,

in vitro

MSCs autólogos expandidos poderia ser usado para cirurgias de remodelação de órgãos programadas ou engenharia de órgãos mesmo completa para transplante. No entanto, não temos conhecimento de qualquer estudo incidiu sobre a avaliação do potencial e da segurança dos MSCs câncer urológico para transplante autólogo terapêutico.

Aqui, foi realizada uma análise comparativa das MSCs obtidas a partir de gordura abdominal de pacientes com câncer urológicos e os participantes não-oncogênicos expandiu

in vitro

em condições livres de xeno em uma tentativa de determinar a sua adequação para as terapias à base de células autólogas utilizando as condições ideais para a clínica. Caracterização incluídos cluster de diferenciação (CD) padrões de expressão e morfologia, cinética de crescimento, plasticidade, liberação Exos como uma medida de MSCs potencial parácrina terapêutica e segurança.

Materiais e Métodos

recolha de amostras e ética declaração

Este estudo foi iniciado após aprovação pelo Comitê de Ética local do Hospital Universitário y Politécnico La Fe (Valência, Espanha). tecido adiposo abdominal recentemente excisadas foi coletada de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico urológico neoplásica ou de participantes não-oncogênicos após o consentimento informado correspondente foi assinado.

Assuntos

Todas as amostras foram materiais usados ​​recolhidos como um lado -product de cirurgia, de pacientes com câncer (n = 5) submetidos a procedimentos cirúrgicos eletivos abdominoplastia no Departamento de Urologia, Hospital Universitário y Politécnico La Fe, (Valência, Espanha) ou os participantes não-oncogênicos pareados por idade (± 5 y) ( n = 2) com um fundo étnico semelhante (Tabela 1). participantes não-oncogênicos correspondeu aos doadores multiorgânicas. Para todos os procedimentos descritos ADSCs de ambos os pacientes oncológicos e não oncológicos, como, respectivamente, as amostras de teste e de controlo foram obtidos e analisados, salvo indicação em contrário.

Isolamento de ADSCs

Isolamento de ADSCs foi levada a cabo usando um método mecânico e enzimática. O tecido adiposo foi transportado e lavou-se com solução salina de NaCl a 0,9% (B. Braun, Cat. 12606097), fragmentado com uma lâmina cirúrgica e digerido com 1 mg /ml de tipo I colagenase (Life technologies, Cat. 17100-017), durante 2 h a 37 ° C com agitação. O tecido digerido foi filtrada através de uma gaze para separá-lo do tecido não digerido e centrifugado a 500 g durante 7 minutos à temperatura ambiente (TA). O sobrenadante (adipócitos flutuante) foi descartada. O sedimento (ADSC fracção) foi ressuspenso em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS + Ca + Mg) (Gibco, Cat. 14025092) + 1% de BSA (Sigma, cat. A2153), filtrada através de uma malha de nylon de 140 um e centrifugou-se a 500 g durante 7 minutos à TA. As células foram então ressuspensas em tampão de lise de eritrócitos em gelo durante 10 min e centrifugou-se novamente a 500 g durante 7 minutos a 4 ° C. As células isoladas foram depois plaqueadas e expandidas em meio de cultura. O meio de cultura foi MesenCult-XF Médio (StemCell tecnologias, Cat. 05420) suplementado com 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina (10000 U /ml de penicilina, 10.000 ug /ml de estreptomicina, Gibco cat.15140-122), e 2 mM L-glutamina (Gibco, cat. 25030-081).

In vitro

expansão e amostragem de ADSCs

ADSCs foram cultivadas a 37 ° C em um 5 % de CO

2 atmosfera de ar com meio muda a cada 3 dias. Quando as células atingiram cerca de 80% de confluência, subcultura (passagem) foi realizada por desagregação usando o Kit MesenCult-ACF de dissociação (tecnologias Stemcell, Cat. 05426) (6 ml /balão), durante 5 min, depois de uma lavagem em solução salina de tampão fosfato (PBS ). As células foram contadas e re-plaqueadas numa cultura T-75 balão a uma densidade de 250.000 células. A solução de dissociação foi neutralizada usando o mesmo volume de MesenCult-ACF Inibição da Enzima Solução (StemCell tecnologias, Cat. 05428). As suspensões de células foram centrifugadas (500 g, 7 min) e os sobrenadantes descartados. As peletes foram ressuspensas em meio completo a uma densidade indicada. Contado foi feito no quarto de um Neubauer usando teste de exclusão Trypan Blue para células vivas (Sigma Aldrich, cat. T8154). Antes de cada passagem, as culturas foram documentados-photo. duplicações da população (DP) foram calculados usando a fórmula

x

= [log

10 (NH) – log

10 (NI)] /log

10 (2), onde NH é o número de colheita de células e NI número inoculados como descrito anteriormente [29]. Para obter a duplicação da população cumulativa, calculou-se a duplicação da população para cada passagem e, em seguida, adicionado ao número de população duplicando passagem anterior. As células, em seguida, foram submetidas a análises adicionais, incluindo ultra-morfologia, potencial de diferenciação, senescência e análise de epítopo. Alguns alíquotas foram sedimentadas e armazenado em -80 ° C para o isolamento de ARN.

A citometria de fluxo

Sobre 0,5-1 × 10

6 as células foram marcadas com os seguintes anti marcado fluorescentemente anticorpos -sangue humano: CD73, CD90, CD105, CD34, CD11b, HLA ABC e HLA-DR (Tabela 2) e analisados ​​em diferentes combinações. Em resumo as células foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente e protegida da luz, lavou-se (3x) com PBS centrifugando a 500 g a 4 ° C durante 7 min. As células lavadas foram ressuspensas em 1 ml de PBS. As amostras marcadas foram analisadas por fluorescência de fluxo de análise de separação de células activadas (FACS) (Beckman Coulter, Cytomics FC 500) aos canais de fluorescência específica para cada fluorocromo. As parcelas foram gerados usando o software de análise CXP (Beckman Coulter).

Adipog�ica diferenciação

Para diferenciação adipogênica, as células foram cultivadas em placas de 6 poços contendo 2 ml de Mesencult-XF basal meio suplementado com suplementos adipog�icas estimuladoras (MesenCult adipog�icas estimuladores suplementos (Humana), cat. 05403), durante 15 dias, em condições de crescimento normais (37 ° C, 5% de CO

2). Os meios de cultura não foi alterado, a menos que forma tornou-se amarelo /cor de laranja, no caso em que uma mudança de meia-forma foi realizada. Após o período de incubação de 15 dias, o meio foi removido e as células foram lavadas em PBS. A fixação com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 30 min foi seguido por duas lavagens em água destilada e uma de 60% de isopropanol, cada uma durante 5 min à TA. Adipog�ica diferenciação foi confirmada por coloração com Oil Red O (Sigma, cat. O0625) seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, as células foram incubadas com Oil Red O corante à temperatura ambiente durante 10 min em 2 ml. Corante foi cuidadosamente removida e a placa foi lavada quatro vezes com água destilada. Em seguida, as células foram observadas utilizando um microscópio óptico (microscópio Nikon Eclipse TE2000-L luz invertido, Nikon Inc., Melville, NY, EUA) e fotografados. Os adipócitos foram identificadas como células com vesículas lipídicas manchadas de vermelho [4], [20], [30].

diferenciação osteogénica

As células foram cultivadas em placas de seis poços contendo 2 ml de MesenCult MSC Meio basal (Humana) (Stemcell tecnologias, cat. 05401) suplementado com osteogénica Suplemento Estimulador (tecnologias stemcell, cat. 05405), beta-glicerofosfato 1M (tecnologias stemcell, cat. 05406), dexametasona (tecnologias stemcell, cat. 05407) e ácido ascórbico (tecnologias stemcell, cat. 07157) por 15 dias (meio osteogênico). As placas foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2 e o meio de cultura foi mudado de três em três dias. Após o período de 15 dias, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS. Após a fixação das células com PFA a 4%, durante 30 min as células foram lavadas três vezes com água destilada. Alizarina S coloração vermelha (Sigma, cat. A5533) foi usada para confirmar a diferenciação osteogénica utilizando o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram incubadas em 2 ml de solução de alizarina de sódio à TA durante 30 min. O corante foi removido cuidadosamente e lavagem extensiva com água destilada seguida. (Microscópio Nikon Eclipse TE2000-U invertido, Nikon Inc., Melville, NY, EUA), as células fixas e tingidas foram observadas utilizando microscopia óptica e fotografado [20], [30].

condrogênica diferenciação

para a diferenciação condrogénica, as células foram cultivadas em placas de seis poços contendo 2 ml de meio completo suplementado com StemPro condrogénese Differentiation Kit (Gibco, cat. A10071-01) durante 15 dias. As placas foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5%

2 e CO meio de cultura foi mudado de três em três dias. Após o período de 15 dias, o meio de diferenciação foi removido e as células foram lavadas com PBS. Em seguida, fixadas com glutaraldeído a 2% durante 20 min e lavadas três vezes com PBS. As células foram depois incubadas em solução de azul Alcian 8GX (Acros Organics, gato. 400460100) durante a noite à TA. O corante foi cuidadosamente removida e a placa foi lavada três vezes com HCl 0,1 M e duas vezes com PBS. (Microscópio Nikon Eclipse TE2000-U invertido, Nikon Inc., Melville, Nova Iorque, EUA), após fixação e coloração, as células foram observadas utilizando um microscópio óptico, fotografadas e [4], [20], [30].

a senescência β-galactosidase associada coloração

senescência dependente do pH associada com a actividade β-galactosidase foi analisado utilizando o kit de coloração SA-β-gal (Cell Signaling Technology, cat. 9860) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, as células foram incubadas em solução recentemente preparada associada à senescência β-galactosidase mancha azul (X-Gal) durante a noite a 37 ° C. Nas seguintes células manhã foram observados e imagens obtidas em microscópio de luz invertida Nikon Eclipse TE2000-U (Nikon Inc, Melville, NY, EUA).

RT-PCR

O RNA total foi extraído a partir de células em cultura com o kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion, gato. AM1560) de acordo com o protocolo do fabricante. rendimentos e pureza do RNA foram determinadas pelos 260/280 e 260/230 nm com um rácios Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, Wilmington, EUA). O ADNc foi preparado utilizando 100-200 ng de ARN total e M-MuLV da transcriptase (New England Biolabs, cat. EP0352) por oligo-dT escorva reversa. O ADNc foi amplificado por PCR utilizando os ABI GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Boston, MA) e as seguintes condições de ciclo: 94 ° C durante 30 s, 54-60 ° C (dependendo do iniciador TM) 30 s , e 72 ° C durante 30 segundos (35 ciclos), após um único ciclo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min. conjuntos de iniciadores de PCR estão apresentados na Tabela 3. Os produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 2% e visualizada com corante realsafe.

qRT-PCR

O ARN total foi isolado a partir de e ADSCs exossomas com o Kit de isolamento miRvana miARN (Ambion, gato. AM1560) utilizando o protocolo do fabricante. Transcrição reversa foi realizada utilizando Kit miScript II RT (Qiagen, Cat. 218161) de acordo com as orientações do fabricante. Os ADNc foram utilizados para a PCR em tempo real utilizando o kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen, Cat. 218073). As sequências dos iniciadores directos utilizados são mostrados na Tabela 4.

isolamento exossomo

Exos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura de células sem xeno de células estaminais adiposos, determinada por ultracentrifugação. fracções de sobrenadante recolhido a partir de culturas adsc foram centrifugadas a 300 g durante 10 minutos, 2000 g durante 20 min e 10000 g durante 20 min para eliminar grandes células mortas e detritos. Depois, filtração através de filtros de 0,22 mícrons para eliminar as impurezas, o sobrenadante final foi ultracentrifugado a 110000 g durante 70 min para sedimentar exos. Exos recuperadas foram lavadas com PBS e centrifugou-se novamente a 110.000 g durante 70 min. O sedimento foi ressuspenso em 50 ul de PBS para se obter uma fracção EXO concentrada.

análise Western blot

e ADSCs Exos foram lisadas em tecido de Proteína Reagente de Extracção (T-PER) (Thermo Scientific, cat. 78510) seguindo as recomendações do fabricante. As concentrações de proteína foram medidas pelo método de Bradford (Thermo Scientific Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay, gato. PI-23200). As amostras foram misturadas com tampão não redutor de amostra SDS Tris-glicina, em seguida, aquecido 95 ° C durante 5 min e carregada num gel de SDS-poliacrilamida a 10%. O gel foi executado sob condições de desnaturação a 80 V durante 2 h, em seguida, transferidos para uma membrana de PVDF (GE Healthcare Life Sciences, cat. 0485288). Após transferência, as membranas foram bloqueadas em 3% de leite não gordo PBS durante 2 h e incubou-se à TA durante 2 h com CD63 anti-coelho (Abgent, gato. AP5333b). Após lavagem em PBS-T, as membranas foram incubadas durante 1 h com anticorpo secundário de cabra anti-coelho ligado a HRP (Santa Cruz, cat. Sc-2004) e reveladas com substrato Luminata Forte Ocidental HRP (Millipore, cat. WBLUF0500) usando um ImageQuant LAS 4000 sistema de detector chemiluminesce.

a microscopia eletrônica

Para a análise ultra-estrutural, as células foram cultivadas em lamelas permanox (8 lâminas de câmara também) a uma densidade de 3,5 × 10

3 células /câmara. As câmaras foram mantidas num incubador humidificado (37 ° C, 5% de CO

2) e meio de cultura foi mudado de três em três dias até confluência sub. As células foram então lavadas três vezes com meio recém-preparado, uma vez com PBS e em seguida fixadas com glutaraldeído a 3,5% durante 30 min a 37 ° C. A solução fixadora foi removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram pós-fixadas em 2% de OsO

4 durante 30 minutos à temperatura ambiente e coradas em acetato de uranilo a 2% no escuro, durante 1 h a 4 ° C. Finalmente, as células foram desidratadas em etanol, lavou-se com óxido de propileno (Baker Lab, Deventry, Holanda) e embebidos durante a noite em Araldite (Durcupan, Fluka, Buchs SG, Suíça). Após a polimerização, as culturas foram incorporados separado da câmara de corrediça e colada (Super cola, Loctite) de blocos de Araldite. Secções semi-finas (1,5 uM) foram cortados com um ultramicrotomo (Ultracut UC-6, Leica, Heidelberg, Alemanha) montados em lâminas e coradas com 1% de azul de toloudine. cortes ultrafinos (70 nm) foram preparados com o ultramicrotome e coradas com citrato de chumbo. As imagens foram obtidas com um microscópio eletrônico de transmissão (FEI Tecnai Espírito G2, Eindhoven, Holanda), usando uma câmera digital (Morada, Soft Imaging System, a Olympus).

Exos purificados foram fixadas com 1% de glutaraldeído em PBS . Depois de enxaguar, uma gota de 20 ul da suspensão foi carregada numa grelha Formvar /revestida a carbono, coradas negativamente com 3% (w /v) de ácido fosfotúngstico aquosa durante 1 min, e observadas por microscopia electrónica de transmissão (TEM) a uma Tecnai espírito G-2 do aparelho; (FEI, Eindhoven, Holanda).

cariótipo Molecular

matrizes Affymetrix CytoScan750 foram utilizados para avaliar cópia ganhos número e perdas de heterozigotia (LOH) em amostras de ADSCs de pacientes e participantes não-oncogênicos . Essas matrizes contêm mais de 2,6 milhões de marcadores de número de cópias dos quais 750.000 são SNPs “genótipo-capazes” e 1,9 milhões são sondas não-polimórficas. O DNA foi extraído a partir de ADSCs para cada uma das duas amostras dos pacientes oncológicos analisados, utilizando um QIAamp DNA Mini-kit (Qiagen, Cat. 51306), seguindo as instruções do fabricante. quantidade e qualidade do DNA foi medida com espectrofotômetro NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific) por razões compreendidas em 260/280 nm. A integridade do ADN total foi medido por electroforese em gel de agarose a 0,8%. número de cópias e genotipagem análises foram realizadas utilizando software de análise cromossômica Affymetrix Suite (ACS) no Serviço de Array, Genomic Unidade IIS La Fe.

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​pela não pareado 2 caudas

t

teste ou múltipla t de Student, conforme indicado. O método de Holm-Sidak correcção foi utilizado para determinar a significância das diferenças em comparações múltiplas. Os dados correspondem a médias ± DP de pelo menos três replicados independentes. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, EUA); valores com

p

. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

População e celulares rendimentos

média de idade da paciente era 60, intervalo entre 38 e 72 anos, (n = 5), e os participantes não-oncogênicos idade média foi de 59, de 41 a 77, (n = 2) (Tabela 1). Os pacientes sofriam de renais, bexiga ou próstata e tecido saudável veio de doadores que sofreram morte traumática acidental.

rendimento celular média derivadas de tecido adiposo haste após a expansão inicial foi de (2,28 ± 4,62) × 10

5 e (3,10 ± 5,4) x 10

5 células por grama de tecido de ambos os participantes de pacientes ou não oncogénicos, respectivamente. Os rendimentos foram altamente variável com tendência a obter rendimentos mais baixos a partir de pedaços maiores de tecido (Tabela 1).

O potencial de crescimento e senescência

Para investigar o potencial de crescimento celular de células a partir de qualquer grupo de participantes, duplicações da população (PD) de cada amostra foi determinada em cada passagem até à passagem 6, o equivalente a 58 dias em cultura, em média (Figura 1). A diferença entre pacientes (6,292 ± 1,394) e do dador (4,869 ± 1,801) PD não foi significativa (p 0,5), como determinado por análise de teste-t não emparelhado dos dados. Semi-confluência na passagem 1 variou cerca de 3,6 ± 1,2 DP para os pacientes e 2,02 ± 1,7 DP para os participantes não-oncogênicos (Figura 1), coincidindo com os relatórios anteriores [31] – [33].

Os resultados são apresentados como duplicações Preenchendo cumulativos de ADSCs derivados de cinco pacientes com câncer diferentes e dois participantes não tumorigénicas (doadores) em condições de cultura livre de Xeno. Os números de células foram determinados no final de cada passagem e cumulativos duplicações da população foram calculados como descrito em Materiais e Métodos.

Embora tenha sido observado nenhum comportamento crescimento anormal de câncer ADSCs paciente, que era importante para determinar se essas células poderiam apresentar quaisquer vantagens de crescimento em períodos de cultivo mais longos. A fim de avaliar a expansão em tempo relacionadas com a senescência celular, duas das amostras analisadas, correspondendo aos pacientes 1 e 2 foram ainda crescidas para passagens tardias, especificamente até passagem 10 e 8, respectivamente. Crescimento depois da passagem 10 em cultura não foi exponencial (Figura 1), indicando um potencial de expansão limitada nas condições de crescimento usadas. A senescência foi determinada por alterações na actividade β-galactosidase de início

vs

final passagens. Como mostrado na Figura S1, actividade β-galactosidase aumenta com a passagem. A maioria das células em passagens precoces não apresentaram evidência para o processamento do substrato cromogénico X-gal como células de passagens posteriores fez. Este aumento na coloração β-gal entre passagens precoces e tardias (0,0390 ± 0,0046 0,1717 ± 0,0181 vs) foi significativa (p 0,005). Isto sugere que a senescência replicativa de MSC é um processo contínuo dependente do tempo como proposto anteriormente [31], também para ADSCs obtidos a partir de doentes com cancro.

Além disso, avaliou-se o processo de senescência-associado de autofagia por RT análise-PCR de genes relacionados à autofagia. No final passagens (passagens 8-10), os níveis de expressão de mRNA apareceu Atg5 upregulated (1,61 ± 0,04 vezes), enquanto Atg7 foram ligeiramente inibida (-1,10 ± 0,03 vezes) e os níveis de Beclin1 mostraram uma regulação negativa marcada (-10,80 ± 0,03) (Figura S1 C). A grande acumulação observada de autofagossomas, nestas passagens tardias, evidenciado por análise ultra-estrutural das suas citoplasma (Figura S1 D, E) coincidiu com uma redução na taxa de crescimento, sugerindo que o aumento da autofagia no final de passagens associadas com a senescência replicativa, como relatado anteriormente [34] – [36]. O fato de que ADSCs de pacientes senesce sobre a cultura indica que eles não são tumorigénico.

Morfologia

Para analisar possíveis alterações morfológicas entre os participantes não-oncogênicos e ADSCs neoplásicas paciente em diferentes passagens, avaliamos sua características morfológicas e ultra-estruturais por microscopia de contraste de fase e microscopia de transmissão de electrões (TEM) em cada passagem até à passagem 4, que representa a passagem recomendado para a terapia de [37]. Imagens revelaram todas as células tinham fuso e morfologia forma multipolar. Não foi observada diferença morfológica entre as células de um ou outro grupo de participantes (Figura 2 A, B).

imagens de contraste de fase representativos de

in vitro

expandidas ADSCs de pacientes com câncer (A) e não participantes -tumorigenic (doadores) (b) em passagem 4 e coloração azul de toluidina de cortes semifinos seções das mesmas células (C e D, respectivamente) (ampliação de 20X).

secções semi-finas fez não mostram quaisquer diferenças morfológicas apreciáveis, quer, com a maioria das células que apresentam um único núcleo (Figura 2 C, D). Os núcleos continham um ou dois nucleoplasm nucléolos e abundante. Células tinham membranas intactas com estruturas pseudópodos na superfície e estruturas de organelas intactas. retículo endoplasmático rugoso (RE) e as mitocôndrias foram detectados em ambas as zonas interiores endoplasmático e periféricas. As zonas periféricas exibiu ausência de organelas, mas continha vacúolos e vesículas.

Para aumentar a resolução obtivemos eletrônica de transmissão de imagens microscópicas de ambos os grupos de ADSCs. As células na passagem 2 mostrou abundante e ampliada RE rugoso, numerosos cisternas do Golgi e um grande número de dictiossomos distribuídos ao longo do citoplasma, que também continha mitocôndrias, gotas lipídicas e feixes de filamentos abundantes (Figura 3 A, B). corpos eletrodensas também foram encontrados ao lado dictiossomos.

ADSCs de pacientes com câncer na passagem 2 (A) e de passagem 4 (C) mostram citoplasma enriquecidos com organelas e núcleo grande (N), com cromatina ligeiramente comprimido. Um detalhe do ADSC de passagem 2 (B) mostra o enriquecimento organelo, retículo endoplasmático rugoso (setas) e cisternas do Golgi grande (asterisco) com algumas gotas de lípido (Li). ADSCs na passagem 4 (C) mostram invaginations proeminentes nucleares (setas) e nucléolos alargada (Nu). A baixa ampliação também mostra organelas eletro-densos abundantes. Em uma maior ampliação abundante áspera cisternas do retículo endoplasmático, gotas lipídicas (LI) e estruturas membranosas abundantes ou autofagossomas são apreciados (D). Barra de escala 10? M (A-C); 1 m (B-D).

Os núcleos continham um ou dois nucléolos e apresentou cromatina ligeiramente comprimido, às vezes mostrando invaginações profundas e nucleoplasm abundante. Na passagem 4, as células mostraram algumas ligeiras diferenças no que diz respeito à passagem 2, incluindo uma maior tendência para núcleos invaginada, maior nucléolo e um aumento no número de feixes de filamentos e do número de estruturas do corpo do tipo membranoso eletrodensas ou autofagosomes (Figura 3 C, D). No entanto, há diferenças qualitativas poderiam ser apreciada entre os grupos, o que nos permite concluir que ADSCs de pacientes com câncer são idênticos aos dos participantes não-oncogênicos ao nível morfológico.

Imunofenótipo

A fim de confirmar que os nossos ADSCs expandidas cumpridos os critérios mesenquimais mínimos estabelecidos pela Sociedade Internacional de Terapia Celular [38] foi realizada a análise de citometria de fluxo de ADSCs de pacientes e participantes não-oncogênicos na passagem 4 (Figura 4 a-G e Figura S4 A- F).

de células activadas por fluorescência fluxo representativas (FACS) e análise por RT-PCR de

in vitro

ADSCs expandidas de doentes com cancro na passagem 4. As células foram positivas para CD105 (a), CD73 (B), CD90 (C), CD29 (H-6), CD44 (H-7) e HLA ABC (F), mas não expressam CD11b (D), NODAL (H-3), UTF1 (H-4 ), ABCG2 (H-5), ou HLA DR (L); enquanto que CD34 era parcialmente positiva (E), como descrito anteriormente. Lanes H-1 e H-2 mostram RT-PCR amplificação da casa mantendo genes GAPDH e β-actina, respectivamente.

Como esperado, as células foram positivas para o mesenquimais CD73, CD90 e marcadores CD105 e negativa para o marcador hematopoiéticas CD11b. Além disso, eles foram positivas para o antigénio HLA de classe I histocompability-ABC, mas não expressam moléculas de superfície de HLA-DR sob um estado não estimulado, como previamente descrito [38]. Inesperadamente, o CD34, um marcador para células progenitoras hematopoiéticas e endoteliais [39], foi positivo em 12/03% das células.

também realizada a análise de RT-PCR para marcadores mesenquimais e pluripotência adicionais. As mesenquimais CD44 e CD29 marcadores foram claramente positivos, enquanto foi obtida nenhuma amplificação da pluripotência nodais e UTF 1 marcadores. Nós também não conseguiu amplificar o ABCG2 proteína de transporte de multi-resistência que é um marcador de pluripotência anteriormente associado a uma subpopulação de MSCs com potencial neurogénica [40], sugerindo uma possível limitação destas células para a terapia de tecido nervoso. Os perfis de superfície antigénio descritos foram semelhantes para as MSCs de pacientes e participantes não oncogénicos (dados não mostrados).

plasticidade celular

A plasticidade dos ADSCs expandidas foi determinada pelo seu potencial de diferenciação. As células na passagem 4 a partir de pacientes ou controlos foram cultivadas em meio de diferenciação específica, tal como descrito em Materiais e Métodos. As células em meios adipog�icas continha vacúolos abundantes distribuídos ao longo dos seus citoplasmas, como mostrado por coloração com Oil Red O (Figura 5 A, D), indicando que tinha ocorrido a diferenciação de adipócitos. Osteogenesis foi evidenciado pela presença de agregados com estruturas de nódulos semelhante os quais foram corados com deposição mineral detecção de Vermelho de Alizarina (Figura 5 C, F). diferenciação condrogênica foi avaliada usando a coloração azul Alcian que revelou alto teor de proteoglicanos específicas de cartilagem nas culturas (Figura 5 B, E). ADSCs a partir de ambos os pacientes (Figura 5 A-C), e os participantes não oncogénicos (Figura 5 D-F), foram igualmente capazes de eficientemente diferenciando-se em osteócito, condrogénica e linhagens osteogénicas indicando que ADSCs derivada dos seus doentes com cancro possui plasticidade celular similar