Sumário

As metaloproteinases de matriz (MMPs) estimulam a invasão tumoral e metástases através da degradação da matriz extracelular. Aqui nós revelamos um papel inesperado para Mmp10 (estromelisina 2) na manutenção e tumorigenicidade de cancro do pulmão do rato as células estaminais-like (CSC). Mmp10 é altamente expresso em culturas enriquecidas em oncosfera CSCs e knockdown RNAi-mediada de

Mmp10

conduz a uma perda da expressão do gene marcador de células-tronco e a inibição do crescimento oncosfera, a expansão clonal, e crescimento transformado

in vitro

. Curiosamente, a expansão clonal de

Mmp10

oncosferas deficientes pode ser restaurada através da adição de proteína Mmp10 exógena ao meio de cultura, demonstrando um papel directo para Mmp10 na proliferação destas células. Oncosferas actividade de iniciação do tumor e metastático reforçada exposição quando injectado em ratinhos singeneicos ortotopicamente, ao passo que as culturas Mmp10 deficientes em mostrar um defeito grave na iniciação do tumor. Por outro lado, oncosferas implantado em isogénica não-transgénico ou

Mmp10

– /- ratos não mostram nenhuma diferença significativa no tumor de início, crescimento ou metástase, demonstrando a importância de

Mmp10

produzido por cancro as células, em vez de o microambiente do tumor na iniciação do tumor de pulmão e de manutenção. Análise de dados de expressão de genes a partir de cancros humanos revela uma forte correlação positiva entre o tumor e expressão Mmp10 comportamento metastático em muitos tipos de tumores humanos. Assim,

Mmp10

é necessário para a manutenção de uma altamente tumorigénico, o câncer de iniciação, a população de células-tronco do tipo metastático em câncer de pulmão. Nossos dados demonstram pela primeira vez que

Mmp10

é um gene de células-tronco crítica câncer de pulmão e novo alvo terapêutico para as células-tronco do câncer de pulmão

Citation:. Justilien V, Regala RP, Tseng IC, Walsh MP, Batra J, Radisky ES, et al. (2012) metaloproteinase de matriz-10 é exigido para o cancro do pulmão Stem Manutenção celular, Tumor Iniciação e potencial metastático. PLoS ONE 7 (4): e35040. doi: 10.1371 /journal.pone.0035040

editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de janeiro de 2012; Aceito: 08 de março de 2012; Publicação: 24 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Justilien et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Institutes of /Instituto de Saúde Nacional do Câncer (R01 e R21 CA081436-13 CA151250-01), a Fundação V para Pesquisa do Câncer, eo James e Esther Rei Programa de Pesquisa Biomédica (1KG-05-33971) para APF ; a Ruth A. Kirschstein Instituto Nacional do Câncer pós-doutorado (CA115160) para RPR; e um dos Institutos Nacionais de suplemento de Pesquisa em Saúde para promover a diversidade na concessão da pesquisa relacionada à saúde do Instituto Nacional do Câncer (VJ). APF é a professora Monica Flynn Jacoby of Cancer Research, um fundo de dotações que fornece suporte parcial para o programa de pesquisa do investigador. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é a principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos [1]. Resultado para pacientes com NSCLC continua pobre, ressaltando a necessidade de identificar os meios mais eficazes de prevenção, diagnóstico e tratamento. Tumores conter subpopulações de células que exibem características semelhantes estaminais que impulsionam patogénese [2], [3], [4]. Estas células cancerosas de iniciação ou do cancro da haste (CCC) exibem auto-renovação, a actividade de iniciação do tumor, a expansão clonal como “oncosferas”, a capacidade de suportar a manutenção de tumores e metástase, e de se diferenciar em células transitoriamente amplificação compreendendo o tumor grandes quantidades [2], [4], [5], [6]. CSCs partilham características moleculares com células-tronco embrionárias, incluindo expressão de aldeído desidrogenase (ALDH) [7], e haste marcadores de células, tais como CD133 [8], [9], Nanog [10], Oct4 [10], Sox2 [11] e receptores Notch [12]. CSCs têm sido descritos em muitas formas de cancro humano incluindo cancros do pulmão [9], [13]. O papel central das CSCs na tumorigénese indica que estas células têm de ser alvo terapeuticamente para conseguir um tratamento eficaz do cancro.

MMPs têm sido implicados na proliferação do tumor de pulmão, invasão e metástase [14]. A estromelisina subfamília [estromelisina 1 (MMP3), 2 (Mmp10) e 3 (Mmp11)] é frequentemente sobre-expressa em NSCLC [15],. Curiosamente, Mmp10 é altamente expressa em tumores NSCLC, mas não células do estroma associado ao tumor, ao passo que MMP3 e Mmp11 são expressos predominantemente no estroma [17],. Recentemente, demonstrou que Mmp10 é necessário para o crescimento e invasão de transformada NSCLC humana células

in vitro

[19], é induzida em células estaminais bronco-alveolar (BASCs) transformadas por oncogénica

Kras

[ ,,,0],20], e promove

Kras

tumorigénese pulmonar mediada in vivo [21].

camundongos -deficient Mmp10

exibem um bloco no

Kras

-e formação de tumores induzidos por uretano, um efeito que se correlaciona com uma incapacidade de BASCs Mmp10 deficientes para expandir e passam por uma transformação em resposta a uretano ou

Kras

[21]. Assim, Mmp10 medeia iniciação do tumor através do controle da célula de expansão de iniciação tumoral (BASC).

Aqui, nós avaliamos o papel de Mmp10 na manutenção e potencial tumorigénico de CSCs do mouse pulmão totalmente transformadas. Culturas enriquecidas em CSCs de células de adenocarcinoma de pulmão de rato expressam elevados Mmp10, Nanog, Aldh1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 e Hey2. Estas culturas exibem um aumento do crescimento independente da ancoragem in vitro, e reforçada iniciação do tumor, o crescimento e disseminação metastática de tumores ortotópico em murganhos singeneicos. Estas propriedades estaminais do tipo requerem expressão de Mmp10 em células tumorais, mas não no estroma associado ao tumor. Nossos resultados indicam que Mmp10 é um candidato atraente para o desenvolvimento da terapia baseada em mecanismo de direcionamento CSCs do pulmão altamente tumorigénicas.

Resultados

oncosferas pulmão do rato expressam elevados Mmp10 e propriedades estaminais-como Mmp10-dependentes

Mmp10

é altamente induzida em células-tronco pulmonares bronco-alveolar de iniciação tumor (BASCs) após a ativação de oncogênico

Kras

[20]. Além disso,

Mmp10

-deficient exposição ratos diminuiu

Kras

formação de tumor de pulmão mediada e uma perda de

Kras

expansão mediada BASC in vitro e in vivo [21]. Para explorar directamente a importância de Mmp10 no pulmão CSC biologia, analisou-se as células CMT167 rato, uma linha celular altamente tumorigénica, metastático derivada de um adenocarcinoma pulmonar alveolar espontâneo num rato C57BL /6 [22], [23]. sequenciamento de DNA revelaram que as células CMT167 abrigar um activador

Kras

G12V

mutação (Figura 1A), tornando-se um modelo celular ideal para estudar Mmp10 em mutantes

Kras

CSCs pulmonares. Em contraste com as células CMT167 crescidas em cultura aderente (Figura 1B, à esquerda), as células cultivadas em meio para mastócitos definida em placas de baixa aderência crescer como oncosferas (Figura 1B, no meio) reminiscentes de culturas CSC a partir de linhas celulares de cancro do pulmão humano [13] . Estes oncosferas redifferentiate quando devolvidas à cultura aderente, exibindo morfologia comparável às células parentais (Figura 1B, à direita). CMT167 oncosfera culturas exibem um aumento de ~ 8 vezes na formação de colónia independente de ancoragem em comparação com as células parentais (Figura 1C), consistente com as propriedades tumorigénicas melhoradas de CSCs [13]. a formação de colónias reforçada é largamente perdida quando estas células são deixadas redifferentiate enviando-as para cultura aderente (Figura 1C). Foram obtidos resultados semelhantes utilizando uma segunda linha celular de adenocarcinoma de pulmão de rato, o carcinoma do pulmão de Lewis (LLC) (Figura S1A e B). células LLC crescido como oncosferas em exposição cultura de células-tronco reforçada a formação de colónias independente de ancoragem, mas perder essas propriedades quando retornou à cultura aderente. Estes resultados demonstram que as nossas culturas oncosfera são enriquecidas em câncer de células estaminais-like.

células A) CMT167 abrigar um activador

Kras

G12V

mutação. sequência de ADN cromatograma da

Kras

alelo em células CMT167 revela um códon 12 mutação de glicina para valina (

Kras

G12V

) (seta vermelha). B) microfotografias de contraste de fase de células CMT167 aderentes parentais (

painel esquerdo

), oncosferas CMT167 em cultura de células-tronco (

meio do painel

) e redifferentiated células oncosfera após o regresso à cultura aderente (

painel

direita). C) CMT167 oncosfera culturas exibem crescimento independente de ancoragem melhorada. A média de fold-change a partir de células parentais CMT167 +/- SEM. n = 5, * p 0,00001; ** P . 0,00001

Para caracterizar ainda mais nossas culturas oncosfera, avaliou-los para a expressão de genes associados a células-tronco bem caracterizadas. QPCR revelou que CMT167 oncosfera culturas express elevada de ARNm durante muitos genes associados com o fenótipo de células estaminais [24], incluindo Nanog, Aldh1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 e Hey2 (Figura 2A). Surpreendentemente, estas culturas também expressam elevados de ARNm Mmp10 (Figura 2A), mas nenhum aumento no MMP2, MMP7, MMP9, Mmp11, MMP12 ou Mmp14, outras espécies Mmp comumente associada ao cancro do pulmão (Figura 2A). Como esperado, as culturas exibem uma perda de oncosfera de marcadores de células estaminais e expressão Mmp10 quando permitido redifferentiate em cultura aderente (Figura 2B). Um padrão semelhante de expressão do marcador com células-tronco foi observada em culturas de oncosfera de células LLC, incluindo um aumento dramático na MMP10, indicando que estas mudanças não são exclusivos do CMT167 oncosferas (Figura s1c). CMT167 oncosfera culturas secretam proteína Mmp10 elevada para o meio comparado com culturas parentais ou redifferentiated (Figura 2C), o que demonstra a importância funcional de expressão elevada Mmp10 nestas culturas. CD133 e Notch4 são dois marcadores de superfície altamente selectivos expressas em outros CSCs pulmonares [9],. Portanto, avaliamos a expressão destes marcadores em CMT167 parentais, oncosfera e redifferentiated culturas oncosfera por citometria de fluxo (Figura 2D). culturas de células parentais conter -8% CD133

+ /Notch4

+ células. Em contraste, as culturas oncosfera conter ~38% CD133

+ /Notch4

+ células e culturas redifferentiated ~ 6% CD133

+ /Notch4

+ células. Estes resultados são consistentes com a prevalência de CSCs em outras linhas de células de cancro do pulmão [9], indicando que estes marcadores são selectivos para culturas CSC-enriquecidos.

A) Expressão de marcadores de células estaminais no cancro e CMT167 parental culturas oncosfera. QPCR de genes associados a células-tronco do câncer; * P 0,05. B) QPCR para marcadores de células-tronco em, oncosfera e redifferentiated culturas oncosfera parentais. Vezes de células parentais +/- SEM, n = 3; * P 0,05. C) CMT167 oncosfera culturas segregam proteínas Mmp10 elevada. ELISA de sobrenadantes da cultura de pais, oncosfera e redifferentiated CMT167 oncosfera culturas. A média +/- SEM. n = 3, * P 1 × 10

-8 oncosferas comparada parentais; ** P 2 × 10

-8 oncosferas vs. oncosferas redifferentiated. D) A citometria de fluxo de CMT167 parental, oncosfera e redifferentiated culturas oncosfera para CD133 e Notch4.

Desde oncosferas expressam elevados Mmp10, nós próxima avaliou se Mmp10 é importante para a sua manutenção e crescimento. Foram identificados três lentivírus de ARNi dirigidas rato Mmp10 ARN que inibem a expressão Mmp10 (Figura S2A e B). Cada vírus knockdown Mmp10 causou uma inibição proporcional de crescimento independente de ancoragem em comparação com células de controlo (NT) RNAi não-alvo (Figura S2C). A construção Mmp10 ARNi mais eficaz (# 3) foi usado para desencadear knockdown eficiente de ARNm Mmp10 em ambas as culturas parentais e de oncosfera (Figura 3A). knockdown Mmp10 causou uma inibição de crescimento transformado (Figura 3B), e uma perda de expressão de Nanog, Aldh1, CD133, Notch3 e 4, Hey1 e 2, e Mmp10 (Figura 3C). Resultados semelhantes foram obtidos em LLC oncosfera culturas em que MMP10 foi derrubado por RNAi (Figura S3A-C). Mmp10 RNAi culturas oncosfera também exibiu uma diminuição na CD133

+ /Notch4

+ células em comparação com culturas oncosfera NT RNAi (Figura 3D). Curiosamente, Mmp10 knockdown também causou uma diminuição no CD133

+ /Notch4

+ células em culturas parentais (a partir de -11% para ~ 5%) (Figura 3D), indicando que Mmp10 é importante para a manutenção de um CSC população dentro das culturas parentais. QPCR

a) mostrando knockdown RNAi-mediada de Mmp10 em CMT167 parental e culturas oncosfera. Relativamente às células parentais NT; A média ± D.P., n = 3. * p . 0,0002 e ** p = 0,01 vs. controlo parental NT. B) Efeito do Mmp10 ARNi no crescimento independente de ancoragem de parental e CMT167 oncosfera culturas. Relativamente às células parentais NT +/- SEM, n = 5; * P 0,05 vs, NT; ** P 0,05 vs. NT parental. C) QPCR para marcadores de células-tronco em NT parental, e NT e Mmp10 RNAi CMT167 células oncosfera. Dobre de NT parental +/- SEM, n = 3; * P 0,05. D) A citometria de fluxo de células parentais e oncosfera NT e Mmp10 RNAi para CD133 e Notch4.

A seguir, determinou se Mmp10 é importante para a expansão clonal de oncosferas, uma característica bem definida de CSCs. células de oncosfera Mmp10 RNAi- e NT ARNi individuais foram plaqueadas em poços individuais de placas de cultura de tecidos de baixo-aderentes e deixou-se expandir clonalmente. Praticamente todas as células NT ARNi expandir em grandes oncosferas ao longo de um período de 15 dias (Figura 4A, superior), enquanto que a maioria das células Mmp10 ARNi permanecem como células individuais (Figura 4A, inferior). Resultados semelhantes foram obtidos em culturas de oncosfera LLC (Figura S3D). A diminuição da expansão clonal de oncosferas CMT167 era devido à perda de genética Mmp10 vez que a adição de Mmp10 recombinante para o meio de cultura renovado expansão clonal de células Mmp10 RNAi (Figura 4A, inferior). A quantificação confirmou que oncosferas NT ARNi crescer significativamente maior do que oncosferas Mmp10 ARNi, e adição de Mmp10 recombinante restaura o crescimento de células Mmp10 ARNi para que comparável às células NT RNAi não tendo qualquer efeito significativo sobre as células NT RNAi (Figura 4B). Exógeno Mmp10 conduziu também a re-expressão de CD133 e Notch4 em células Mmp10 RNAi (Figura 4C), e re-expressão de marcadores de células estaminais (nanog, Aldh1, CD133, NOTCH3, Notch4 e Hey2) (Figura S4A). A diminuição do crescimento clonal de oncosferas Mmp10 RNAi não é devido a uma perda de viabilidade celular, uma vez que estas células proliferam a uma velocidade indistinguíveis de oncosferas NT ARNi quando colocado novamente em cultura aderente (Figura S4B)

.

A) Fotomicrografias da expansão clonal de uma única NT e Mmp10 ARNi CMT167 células na presença ou ausência ou Mmp10 oncosfera recombinante. diâmetro B) Colony derivadas de células CMT167 NT e Mmp10 RNAi individuais. A média +/- SEM; n = 10, * p 0,05 vs. dia 1 de cada tratamento; ** P 0,05 vs. dia 15 NT RNAi sem Mmp10. C) A citometria de fluxo de NT e Mmp10 RNAi CMT167 oncosfera culturas +/- Mmp10 para CD133 e Notch4.

culturas oncosfera exibem actividade de iniciação tumor Mmp10 dependente

in vivo

a seguir avaliou a actividade de iniciação do tumor de culturas de oncosfera e parentais por injecção ortotópico no lobo esquerdo do pulmão de ratos singénicos. As experiências iniciais determinaram que a injecção de 100.000 células CMT167 /luc parentais foi necessário para estabelecer tumores ortotópicos onde a injecção de tão poucos como 1.000 NT RNAi CMT167 /células luc de culturas oncosfera rotineiramente deu tumores. A injecção de 1.000 NT ARNi CMT167 /células de oncosfera luc levaram a grandes tumores onde a injecção de 1.000 células luc parentais NT ARNi CMT167 /ou células de oncosfera luc Mmp10 ARNi CMT167 /falhou em produzir grandes tumores, como determinado por imagiologia vivo de bioluminescência (Figura 5A). O exame patológico dos tecidos pulmonares no momento do sacrifício demonstraram que a tomada do tumor foi de 100% para as células NT ARNi CMT167 /luc oncosfera (9/9) com um tamanho de tumor médio de 3,63 +/-. 35 mm

2, mas apenas 45% tumor demorar para parental NT RNAi CMT167 /células luc (5/11), com um tamanho médio de tumor de 0,42 +/-. 06 mm

2, e 27% tumor demorar para Mmp10 RNAi CMT167 /células oncosfera luc (3 /11) com um tamanho de tumor médio de 0,36 +/-. 09 milímetros

2. Estes dados validam nossas medições in vivo de bioluminescência e demonstram que Mmp10 desempenha um papel crítico na actividade de iniciação do tumor e o crescimento de células de oncosfera luc CMT167 /. Curiosamente, Mmp10 knockdown em células parentais também leva a uma perda de formação de tumores in vivo (Figura S5A), indicando que Mmp10 é importante para a actividade de iniciação do tumor de uma população de células-CSC como presente em culturas de células parentais. NT ARNi CMT167 /luc culturas de oncosfera também gerou numerosos metástases aos lobos direito do tecido pulmonar, enquanto parental NT culturas /célula Luc ARNi CMT167 exibiu muito menos metástases e Mmp10 ARNi CMT167 /luc culturas de oncosfera menos ainda (Figura S5b), sugerindo um papel para o Mmp10 no potencial metastático, uma propriedade atribuída a CSCs pulmonares. Assim, Mmp10 é importante para o potencial tumorigénico aumentada observada em culturas de oncosfera.

A, o crescimento do tumor ortotópico após a injecção de 1.000 células de NT aderente, NT ARNi oncosfera ou Mmp10 ARNi culturas de oncosfera foi monitorizada por bioluminescência no indicado Os pontos de tempo; * P 0,05 (

painel esquerdo

). vistas laterais representativas de imagens bioluminescentes de ratos com tumores ortotópicos pulmonares (

painel direito

). função Mmp10 em tumores oncosfera CMT167 é célula autónoma. B) imagens bioluminescentes representativos de NT RNAi CMT167 oncosfera tumores ortotópicos implantadas em NTG e

Mmp10

– ratinhos receptores – /. Análise de C tamanho) do tumor e D) metástases em NTG ou

Mmp10

– /- ratos. C-D, n = 10, média +/- SEM.

tumorigenicidade é independente da Mmp10 no microambiente tumoral

Os efeitos da Mmp10 em células CMT167

in vitro

são célula autónoma. No entanto, não podemos descartar um papel para Mmp10 produzido por epitelial associado a tumor, estroma e /ou células do sistema imunológico em nossos estudos de tumores ortotópicos. Para abordar esta questão, nós injetado 1.000 células de NT RNAi CMT167 /culturas oncosfera luc em qualquer NTG ou

Mmp10

– /- ratos. Não houve diferenças significativas no crescimento tumoral (Figura 5B), o tamanho do tumor primário (Figura 5C) ou metástases (Figura 5D) foram vistos em NTG e

Mmp10

– /- ratos destinatário, indicando que Mmp10 expressa por oncosferas, mas não a partir de Mmp10 produzida por outras células associados ao tumor, é crítico para a formação de tumores. Nós anteriormente demonstrado que Mmp10 é expresso em níveis baixos infimamente no epitélio do pulmão, mas está altamente induzida em BASCs após activação oncogénica de

Kras

[20]. Assim, as células tumorais são a principal fonte de Mmp10 nos pulmões de ratinhos portadores de tumor.

culturas de oncosfera diferenciar-se em células tumorais o volume após a injecção ortotópico

CSCs iniciar e manter tumores através da manutenção de um CSC populacional e se diferenciar em células transitoriamente-amplificando que compõem o tumor granel. Para avaliar o destino de oncosferas CMT167 após a formação do tumor ortotrópicos, foram isoladas células tumorais de tumores ortotópicos derivadas a partir destas culturas e analisou-los para CD133

+ /Notch4

+ células (Figura 6). Na altura da injecção, as culturas de oncosfera apresentaram enriquecimento significativo em CD133

+ /Notch4

+ (células ~36%) (Figura 6A). Em contraste, as células de tumor isoladas de tumores ortotópicos consistia em -11% CD133

+ /Notch4

+ células, consistentes com as células parentais CMT167 (Figura 6B). Estes dados indicam que as culturas de oncosfera propagar uma população de CD133

+ /Notch4

+ células-tronco semelhantes, e também se diferenciam em transitoriamente amplificar as células tumorais in vivo. Exploramos também a distribuição de CMT167 células em tumores ortotópicos oncosfera por imuno-histoquímica para Mmp10 e Notch4 (Figura 6C). Os tumores primários derivados de oncosferas exibiram coloração ligeiramente elevada Mmp10 com coloração mais escura Mmp10 em áreas onde o tumor interage com estroma circundante. estroma associado a um tumor e mancha epitélio pulmonar normal negativo para Mmp10, consistente com a falta de expressão Mmp10 no epitélio pulmonar normal [20]. coloração Notch4 exibiu um padrão semelhante, indicando a co-expressão de Mmp10 e Notch4 em células tumorais na interface do tumor e estroma circundante (Figura 6C, superior).

análise citométrica de fluxo para a expressão de CD133 e Notch4 em CMT167 oncosferas antes da injecção em ratinhos singeneicos ortotopicamente (a) e células isoladas a partir de tumores CMT167 ortotópicos (B). C) coloração Mmp10 e Notch4 em um tumor oncosfera CMT167 primário (

painéis superiores

) e lesão metastática (

painéis de fundo

).

expressão Mmp10 está associada com metástase de células de câncer de pulmão

evidências recentes indicam que CSCs residir em nichos pré-metastáticos responsáveis ​​pela disseminação do tumor metastático. Dada a associação do potencial stemness e metastático, avaliamos a expressão de Mmp10 e Notch4 em lesões metastáticas de tumores derivados de oncosferas. Curiosamente, ambos Mmp10 e coloração Notch4 era intensa e uniforme em lesões metastáticas (Figura 6C, inferior), indicando que estas lesões são enriquecidos em Mmp10-Notch4 CSCs duplamente positivas. A associação similar de expressão Mmp10 com lesões metastáticas em tumores humanos foi observada quando analisamos os conjuntos de dados de expressão de genes publicamente disponíveis de tumores humanos usando a ferramenta de bioinformática NextBio. A análise revelou uma forte correlação positiva entre a expressão Mmp10 e potencial metastático em NSCLC humano, cancro colorrectal, melanoma, cancro da mama, carcinoma da célula renal e cancro da próstata (Tabela 1). Assim, Mmp10 parece desempenhar um papel generalizada na malignidade humana.

Discussão

Uma pequena subpopulação de células estaminais-como auto-renovação pode ser responsável pelo início, manutenção, progressão e metástase de tumores. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na manutenção CSC. CSCs pode escapar quimioterapia convencional, devido à sua resistência aos medicamentos intrínseca e /ou imobilidade relativa, resultando na recorrência da doença e pior prognóstico do paciente. Portanto, estratégias terapêuticas que visam erradicar CSCs podem melhorar a evolução clínica de pacientes com câncer.

Apesar de MMPs muito tempo têm sido implicados na progressão tumoral e metástase, que recentemente demonstrou que Mmp10 é abundante em NSCLC humana e

Kras

-transformed BASC células iniciadoras de cancro do pulmão [19], [20], e que Mmp10 é necessário para o crescimento e invasão transformado de células NSCLC humanas

in vitro

[19]. Além disso, Mmp10

– /- ratos apresentam uma diminuição significativa na urethane- e

Kras

tumorigênese pulmonar induzida devido a um defeito de Mmp10 deficiente BASCs para expandir em resposta a oncogênicos

Kras

[21]. Aqui, nós relatamos o resultado surpreendente que Mmp10 promove iniciação do tumor de pulmão e metástase através da manutenção de uma população CSC-like de células tumorais de pulmão.

CSCs são definidos por sua capacidade de expandir clonalmente, diferenciar-se em células tumorais em massa , e iniciar tumores nos animais receptores. Aqui nós mostramos que Mmp10 é abundante em culturas oncosfera CSC-enriquecido a partir de linhas de células de adenocarcinoma de pulmão dois rato e é necessário para o crescimento transformado reforçada e expansão clonal

in vitro

, e para a iniciação do tumor

in vivo

. A inibição de

expressão Mmp10

em oncosferas diminui significativamente a expressão de factores de transcrição associadas a células estaminais e marcadores de superfície celular, indicando que Mmp10 é crítica para manter a identidade do pulmão CSC. expressão Mmp10 também é elevada em CSCs isolados a partir de linhas celulares de cancro do pulmão de pequenas células humanos [27], sugerindo que Mmp10 pode também funcionar na manutenção desses CSCs.

A chave para a segmentação de forma eficaz NSCLC CSCs será a precisão identificar esta subpopulação dentro de tumores. BASCs são as células putativos de iniciação do tumor a partir do qual

Kras

tumores induzida rato pulmonares se originam. expressão BASCs exposição de superfície Sca1, SPC e ccsp, no entanto, até à data, as células estaminais broncoalveolar humanas que co-expressa SP-C e ccsp não ter sido isolado, e Sca1 não é expresso em células de pulmão humano [28]. Curiosamente, CMT167 oncosfera culturas não são apenas enriquecido em ccsp

+ /RCM

+ células (dados não apresentados), mas também em CD133

+ /Notch4

+ células, dois marcadores implicada tanto humana e CSCs de ratinho a partir de vários tipos de tumores, incluindo pulmonar [25], [29]. A inibição da sinalização Notch bloqueia a capacidade de neurospheres CSC derivadas de glioblastoma para propagar tumores e esgota CD133

+ células-tronco como em neurospheres [29]. Da mesma forma, Notch blocos de inibição de proliferação e atividade de iniciação tumor de CSCs pulmão humano [25]. Observamos enriquecimento significativo de Notch4

+ /CD133

+ células em CMT167 oncosferas com poucas células positivas individuais que sugerem que a co-expressão destas moléculas é necessário para manter CMT167 CSCs. Assim, Notch4 e CD133 podem ser marcadores úteis de CSCs do pulmão entre as espécies.

Nossos dados fornecem evidência direta de que o papel da

Mmp10

no pulmão CSCs é célula autónoma. O nosso modelo de tumor ortotópico Mmp10 mostra a coloração em células tumorais, mas não estroma associado a um tumor ou epitélio pulmonar morfologicamente normais. Mais importante ainda, não foram observadas diferenças significativas no número de tumor, o tamanho ou lesões metastáticas formados por células oncosfera ortotopicamente injetado singênica NTG ou Mmp10

– /- ratos. Assim, enquanto muitos MMPs produzidos pela associado a um tumor jogada estroma papéis proeminentes nas propriedades invasivas e metastáticas de células de tumor de pulmão, Mmp10 é produzida principalmente por células de tumor de pulmão para suportar o crescimento autónomo de CCC. Os dados são consistentes com numerosos relatos de que Mmp10 é expresso em células NSCLC humanas e não tecidos circundantes normais do pulmão ou associados a tumores [15], [17], [18]. Estudos futuros incidirá sobre a determinação dos mecanismos moleculares que contribuem para a proliferação CSC Mmp10 mediada.

mau resultado em pacientes com câncer de pulmão é devido à difusão e resistência das células tumorais à quimioterapia metastático, duas características atribuídas a CSCs. Em tumores primários derivados de oncosfera-observamos reforçada Mmp10 e Notch4 coloração na interface entre o tumor e o tecido circundante, o que sugere um papel para Mmp10

+ /Notch4

+ células na invasão tumoral. Estes dados são consistentes com o nosso financiamento anterior que Mmp10 é necessário para a invasão de células NSCLC humanas

in vitro

[19], e nossa constatação atual que Mmp10 contribui para o comportamento metastático de tumores CMT167 oncosfera derivados. Interessantemente, as células tumorais dentro de lesões metastáticas uniformemente expresso Mmp10 e Notch4 sugerindo que eles são derivados a partir de, e altamente enriquecida em, CSCs. Mmp10 knockdown leva a uma redução significativa nas lesões metastáticas, indicando a importância da Mmp10 no comportamento metastático.

Análise do perfil de expressão de dados em NSCLC revelou uma correlação significativa entre a expressão Mmp10 e a progressão do tumor, invasão local e metástases distantes [30 ]. Observou-se associações semelhantes entre a expressão e o comportamento Mmp10 metastática do cancro humano colorrectal, melanoma, mama, renal e cancros da próstata (Tabela 1). Assim, Mmp10 pode desempenhar um papel comum no comportamento metastático de diversos tipos de cancros humanos. Usando uma abordagem de bioinformática, que recentemente demonstraram que a expressão Mmp10 em tumores humanos está associada com ambas as assinaturas genéticas de células-tronco embrionárias e potencial metastático [21]. Curiosamente, os CSCs parecem promover quimiorresistência e um estudo recente revelou que é sobre-expresso em Mmp10 resistente a cisplatina em comparação com células sensíveis a cisplatina humanas de adenocarcinoma do ovário [31]. Mais estudos serão necessários para determinar se Mmp10 promove metástase e chemoresistance em células tumorais humanas, mantendo uma altamente metastático, a população de células-tronco do câncer resistente à quimioterapia, como os nossos dados presentes em células de adenocarcinoma de pulmão de rato poderia prever.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, enzimas e células

CMT167 e LLC

gene knockdown lentiviral RNAi-mediada que expressam luciferase de vaga-lume foram um presente do Dr. Raphael Nemenoff (University of Colorado, Denver, CO) e foram caracterizada anteriormente [32]. Resumidamente, as células foram transfectadas com pGL3 contendo constitutivamente a luciferase de pirilampo conduzido por um promotor de SV40 e as células que expressam a luciferase elevada foram seleccionados através de resistência à neomicina [32]. domínio catalítico proMmp10 humana recombinante foi expressa em E. coli estirpe BL21 (DE3), isolado a partir de corpos de inclusão, purificada, redobrada, e activada

In vitro

por tratamento com acetato de 4-aminof, essencialmente como descrito anteriormente para MMP3 [33]. Os detalhes da construção e os métodos foram submetidos para publicação em outro lugar [34]. As concentrações de Mmp10 activada foram determinadas por absorvância de UV a 280 nm, utilizando um coeficiente de extinção molar calculada de 29910 H

-1cm

-1. A actividade específica de Mmp10 (43,75 U /mg; 1 L = 100 pmol /min a 37 ° C) foi determinado como descrito anteriormente [19]. 100 U /ml de Mmp10 foi adicionado, como indicado nas legendas das figuras.

vectores lentivirais contendo curto hairpin ARNi contra Mmp10 rato foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich. Um vector lentiviral de controlo não-alvo que contém uma construção de ARN de gancho de cabelo curto que não reconhece qualquer rato ou genes humanos (NT) foi utilizado como um controlo negativo. As células foram transduzidas com lentivírus recombinante e transf ectantes estáveis ​​seleccionadas pela resistência à puromicina como descrito anteriormente [19]. ARNi sequências são fornecidas na Figura S1A. Eficiência de Mmp10 knockdown foi avaliada por PCR quantitativa (qPCR).

Enriquecimento, a expansão clonal e rediferenciação de CSCs pulmonares

CSCs foram enriquecidas a partir de células LLC CMT167 e por cultura de 10.000 células /ml em soro livre de DMEM-F12 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 50 ug /ml de insulina (Sigma-Aldrich), 0,4% de albumina de bovino Fracção V (Sigma-Aldrich), N-2 Plus Media Suplemento (R D Systems , de Minneapolis, MN), B-27 Suplemento (Gibco-Invitrogen), 20 ug /ml de EGF (PeproTech) e 10 ug /ml de bFGF (PeproTech) (meio de CSC) em ultra-baixo frascos de fixação (Corning, Corning, NY) para suportar o crescimento de oncosferas indiferenciadas. oncosfera culturas foram expandidas por tripsinização e dissociação mecânica, seguida por re-plaqueamento das suspensões de células individuais (10.000 células /ml) em meio fresco a CSC. Oncosferas foram recolhidos para experimentos após 2 semanas em cultura não aderente. Colunas, quer dizer; Colunas, quer dizer;