Abstract

desenvolvimento e progressão tumoral são influenciados pelos macrófagos do microambiente circundante. Para investigar as influências de um microambiente inflamatório tumor no crescimento e metástase de câncer de próstata, o presente estudo utilizou um modelo de co-cultura de células cancerosas da próstata (PCA) com macrófagos associados a tumores (TAM) médio climatizados, (MCM). MCM promovido célula CaP (LNCaP, DU145 e PC-3) de crescimento, e um modelo de xenoenxerto em ratinhos nus consistentemente demonstrou que MCM pode promover o crescimento tumoral. MCM também estimulou a migração e invasão

in vitro

. derivado de somatostatina (smsDX) atenuou significativamente a proliferação TAM estimulada, migração e invasão de câncer de próstata. Imuno-histoquímica revelou que o NF-kB foi sobre-expressos em APC e BPH com amostras de tecido inflamatório crônico e foi positivamente correlacionada com infiltração de macrófagos. Outras investigações sobre o mecanismo subjacente revelou que o NF-kB desempenhou um papel importante na infiltração de macrófagos. SmsDX inibiu o ciclo parácrina entre as células da TAM e PCA e pode representar um agente terapêutico potencial para CaP

Citation:. Guo Z, Xing Z, Cheng X, Fang Z, Jiang C, Su J, et al. (2015) A somatostatina Derivados (smsDX) Atenua o TAM-estimulou a proliferação, migração e invasão de cancro da próstata através de regulamento NF-kB. PLoS ONE 10 (5): e0124292. doi: 10.1371 /journal.pone.0124292

Editor do Academic: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALY

Recebido: 30 de agosto de 2014; Aceito: 12 de março de 2015; Publicado em: 26 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.772.294). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comum que afeta os homens e representa a segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no mundo ocidental [1]. A maioria de cancro da próstata progride de neoplasia intraepitelial prostática através de adenocarcinoma localmente invasivo para cancro da próstata resistentes à castração (CRPC) [2], o que leva à elevada mortalidade e pouco tratamento é eficaz. Apesar de uma série de pesquisas, o mecanismo intrínseco sobre CRPC ainda é incerto. Recentemente, Zhu et ai descobriram que as citocinas, incluindo IL-1β produzido por macrófagos contribui para a progressão da CRPC [3].

Os macrófagos são geralmente as mais abundantes imune população presente no micro-ambiente do tumor [6/4 ]. Recentemente, dois estados distintos de macrófagos polarizadas foram identificados: a ‘classicamente’ activado (M1) e os macrófagos alternativamente ” activados (M2). E é agora geralmente aceite que a TAM tem um fenótipo M2 e pode produzir uma série de citocinas /quimiocinas no microambiente tumoral local que pode estar associado com a promoção do crescimento tumoral, angiogênese e metástase no câncer de próstata [7-10]. No entanto, o mecanismo detalhado permanece desconhecida.

factor nuclear kB (NF-kB) é um membro de uma família de factores de transcrição ubiquamente expressas que participa na inflamação, a imunidade e a oncogénese [11,12]. É amplamente presente na maioria (se não todos) células, incluindo macrófagos. E a sua activação aberrante também foi observada na maioria dos tumores. Recentemente, vários estudos têm demonstrado que as citocinas (por exemplo, IL-1 e TNF) produzidos pela TAM poderia promover a activação de NF-kB [13,14], em seguida, promover a proliferação de células de tumor, tumorigénese, migração e invasão [15,16]. Além disso, a activação de NF-kB em macrófagos poderia exacerbar a insensibilidade à insulina e afecta o metabolismo da glicose, e envolve em desordens metabólicas, incluindo a obesidade, resistência à insulina, diabetes do tipo 2 e aterosclerose [17-19]. Acredita-se que o NF-kB promove o crescimento celular e a oncogénese, pelo menos em parte, através da reorganização de circuitos metabólicos.

A somatostatina (SMS) é um polipéptido de ácido, o que é amplamente distribuído por todo o sistema nervoso central, periférico diferente tecidos e órgãos. Ela tem uma ampla gama de actividades biológicas em endócrina, e a inflamação do tumor. derivado de SMS (smsDX) baseia-se na sms14 natural, e pode ligar-se a todos os subtipos de receptores da somatostatina cinco (SSTR) [20]. Nossa pesquisa anterior encontrou smsDX poderia promover a apoptose, suprimir a proliferação, migração e invasão de células cancerosas da próstata [21]. E vários estudos mostraram receptor de somatostatina estava presente em macrófagos, SMS e o seu análogo pode modular a função dos macrófagos [22-24]. No entanto, o mecanismo permanece obscuro. Somatostatina e os seus análogos têm sido relatados em vários estudos para suprimir a actividade de NF-kB [25,26]. No entanto, se smsDX pode regular NF-kB no câncer de próstata permanece desconhecida.

O presente estudo avaliou a correlação entre a expressão de NF-kB e infiltração TAM no cancro da próstata (PCA), hiperplasia prostática benigna (BPH) e BPH com amostras de inflamação crônica através de imuno-histoquímica. Para simular o microambiente do tumor, um modelo de co-cultura de células LNCaP (CaP, DU145 e PC-3) com meio condicionado TAM (MCM) foram estabelecidas

In vitro

. MCM promoveu a proliferação, a migração e a invasão de células APC, e esta simulação pode ser inibida por smsDX. Outras investigações indicaram que a NF-kB desempenhou um papel vital neste processo, e pode estar envolvido em um loop autócrino /parácrino entre TAM e células APC. Nossos resultados sugerem que um microambiente inflamatório promove a progressão APC, e que smsDX pode representar uma droga auxiliar para o câncer de próstata devido ao seu potencial papel anti-inflamatório.

Resultados

expressão P65 é positivamente correlacionada com recrutamento de macrófagos nos tecidos da próstata humana

coloração imunorreactiva para a subunidade P65 de NF-kB foi avaliada na amostra de 24 APC, 12 BPH com inflamação crônica e 33 espécimes de BPH. Quando o grau de coloração em todas as amostras de tecido foi quantificado na escala de 0-3 +, observou-se um aumento gradual entre os tecidos BPH, com HBP espécimes inflamação crónica, e PCA. Nenhum dos tecidos BPH manchado como 3+, e 87,8% apresentaram 0+ ou 1+ coloração. A quantidade de coloração na BPH com amostras de inflamação crônica foi intermediária, com 75% das amostras que exibem 1+ ou 2+ coloração e 25% exibem 3+. Em contraste, todas as amostras de cancro foram 2+ a 3+ (37,5 e 62,5%, respectivamente), como mostrado na Tabela 1. Além disso, apenas fraca coloração P65 foi observada no citoplasma em tecidos BPH, P65 coloração foi observada em ambos citoplasma e núcleo de células inflamatórias do tumor e.

Para avaliar ainda mais a relação entre P65 e infiltração de macrófagos nos tecidos da próstata humana, seções não coradas foram immunolabeled com CD68. Como mostrado na figura 1, as células CD68-positivas e P65 foram coordenadamente expressas em níveis moderados a elevados de BPH com lesões inflamatórias crónicas e cancro da próstata. Em contraste, foi observada coloração mínima CD68 para BPH. Além disso, a maioria das células CD68-positivas exibiram características morfológicas de macrófagos. Portanto, a expressão P65 foi positivamente correlacionada com a densidade de macrófagos.

(A) coloração forte da NF-kB no citoplasma e núcleo de CaP. (B) a infiltração moderada de macrófagos em CaP. (C) coloração moderada de NF-kB, no citoplasma e núcleo de prostatite. (D) alta infiltração de macrófagos na prostatite crónica. (E) fraca coloração de NF-kB, no citoplasma da HBP. (F) a infiltração de macrófagos Mild em BPH. Todas as imagens são imagens representativas.

SmsDX inibiu a proliferação e colônia formação de MCM-promovido das células cancerosas da próstata

Para estudar os efeitos da MCM e smsDX sobre a proliferação de células APC, LNCaP, DU145 e PC-3 células foram expostas separadamente para MCM e smsDX durante 24, 48 e 72 horas em um ensaio de CCK-8. Consequentemente, MCM promoveu significativamente a proliferação de células LNCaP, DU145 e PC-3 em células de um modo dependente do tempo, ao passo que smsDX poderia enfraquecer o impacto de MCM sobre a proliferação celular (Fig 2). A viabilidade de células LNCaP, DU145 e PC-3 de células aumentou para 51,7%, 44,3% e 57,6%, respectivamente, após a exposição ao MCM, durante 72 h, no entanto, a viabilidade diminuiu para 44,8%, 44,1% e 41,6%, respectivamente, em cima smsDX tratamento.

O efeito de MCM e /ou smsDX sobre a viabilidade celular foi medida através do ensaio de CCK-8. células LNCaP (A), (B) células DU145 e (C) células de PC-3 foram co-cultivadas com MCM e /ou tratada com smsDX para 24, 48 e 96 h. A co-cultura com MCM promoveu significativamente a proliferação de células de CaP de uma maneira dependente do tempo, wheras smsdx poderia atenuar substancialmente esta influência. (D) O efeito da MCM e smsDX na formação de colónias. (E) O número de colónias, asclusters definidos de pelo menos 50 células, foi contado sob o microscópio. Os resultados representam as médias ± DP de três experiências independentes. Os dados são apresentados como os meios ± SD, * p 0,05, ** p . 0,01

Foram examinados mais profundamente os efeitos da MCM e smsDX sobre a formação de colónias de células APC. MCM facilitado drasticamente a formação de colónias de LNCaP, DU145 e PC-3 células. No entanto, o número de colónias foi diminuído significativamente após tratamento com smsDX como mostrado na Figura 2 (* P 0,05, ** P 0,01).

Efeitos de MCM e smsDX sobre a migração celular e invasão

In vitro

foram realizados ensaios de zero para avaliar os efeitos da MCM e smsDX sobre a migração de células APC. As capacidades de migração de células LNCaP, DU145 e PC-3 foram marcadamente aumentada após a co-cultura com MCM durante 24 h (Fig 3). Para testar ainda a influência de MCM e smsDX na migração celular e invasão, foi realizada Transwell ensaio. Os nossos resultados demonstraram que o número de células invasivas e migratórias que passam através do filtro aumentou significativamente quando os macrófagos foram cultivadas na câmara inferior (figura 3) (# P 0,05, ## P 0,01). No entanto, smsDX (10 nM) poderia inibir drasticamente a migração e a invasão de células APC.

(A, C, E) co-cultura com MCM reforçada a migração de células de LNCaP, células DU145 e PC-3. SmsDX suprimiu o efeito de MCM. (B, D, F) A alteração da migração é apresentada como a percentagem da distância inicial entre as duas extremidades. (G, I, L) migração Transwell e ensaio de invasão de células LNCaP, DU145 e PC-3 tratadas com células MCM e /ou smsDX. (H, J, M) A LNCaP, DU145 e PC-3 e as células que migraram foram contadas invadido com sucesso. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes. Os dados são apresentados como média ± DP, * p 0,05, ** p 0,01, # P 0,05, ## p . 0,01

SmsDX inibe o crescimento do tumor MCM-dependente num modelo de xenoenxerto

Depois de demonstrar a eficácia de smsDX na inibição da viabilidade celular APC e invasão

in vitro

, investigamos ainda mais o seu efeito antitumoral potencial em camundongos. As células PC-3 (5 × 10

6) foram injectadas subcutaneamente em cada flanco de ratinhos nus. O tratamento com MCM aumentou significativamente o volume médio do tumor. No entanto, o crescimento tumoral foi inibido após o tratamento com smsDX a 1 mg /kg /d (Figura 4) (* P 0,05, ** P 0,01). Além disso, nenhuma toxicidade significativa foi observada em ratos tratados com MCM e smsDX (1 mg /kg /d), tal como avaliado usando o peso de cada animal nos 3 grupos (Figura 4). Para investigar a expressão de NF-kB, bem como infiltração de macrófagos

in vivo

, imuno-histoquímica foi realizada em secções de parafina de PC-3 xenoenxertos de tumores de camundongos nus. NF-kB e CD68 foram altamente expresso em ratinhos tratados com MCM, e foram positivamente associada com o volume do tumor (Fig 4).

As imagens do ratinhos nus (A) e os tumores extirpados (C) foram retirados de grupos diferentes. curva (B) de peso corporal de ratinhos nus portadores de tumores PC-3 em diferentes grupos. (D) Os gráficos representam a média dos volumes tumorais de xenoenxertos PC-3 tratadas com MCM e /ou smsDX. (E) A correlação entre CD68 e NF-kB em xenoenxertos de tumor APC. Os dados estão apresentados como médias ± SD, * p 0,05, ** p 0,01

SmsDX inibe a translocação nuclear e activação de NF-kB induzida por meio condicionado por macrófagos em células CaP

NF-kB pode representar um elo mecanicista crítica entre inflamação e câncer, e sua activação aberrante pode promover a proliferação de células tumorais, tumorigênese, migração e invasão [15,16]. O primeiro observada a expressão de P65 fosforilado, o qual modula a actividade de transcrição NF-kB [27,28]. Como se mostra na figura 5, a co-cultura com MCM significativamente sobre-regulada P65 fosforilado em células LNCaP, que foi mais fortemente expresso quando as células foram incubadas com MCM durante 30 min. Posteriormente, temos explorado o efeito da smsDX na fosforilação de P65. Os sobre-regulada níveis de fosforilação de P65 secundários ao tratamento MCM foram eficazmente suprimidas através smsDX em três linhas de células de CaP (Fig 5).

(A) Os níveis de NF-kB fosforilada nas células LNCaP após exposição a MCM para diferentes durações. (B-D) A fosforilase e níveis totais de NF-kB foram analisadas através de Western blotting. A quantificação da razão P-NF-kB /NF-kB foi determinado por análise de densitometria.

Para avaliar ainda mais os efeitos de MCM e smsDX sobre a translocação de NF-kB, citosólicas e proteínas nucleares foram extraídas, respectivamente. A análise por Western blot revelou que MCM reduziu a abundância de P65 no citoplasma de células LNCaP (figura 6). Além disso, foram observados níveis aumentados de P65 no núcleo (Figura 6), indicando que o NF-kB foi activado. No entanto, o tratamento com smsDX durante 24 h inibiu drasticamente o efeito de MCM na activação do NF-kB. Resultados semelhantes foram obtidos no DU145 (Figura 6) e linhas celulares de PC-3 (Fig 6). Os resultados na Fig imunofluorescência 7 ainda confirmado que, semelhante ao ensaio de Western Blot, um aumento significativo na acumulação nuclear de P65 foi observada após a co-cultura com MCM nas células LNCaP, e que smsDX drasticamente inibida translocação P65. Resultados similares foram observados no DU145 e PC-3 linhas de células (Fig 7).

(A, C, E) A expressão de p65 no citoplasma foi diminuída após a co-cultura com MCM, smsDX atenuada este efeito em LNCaP, DU145 e PC-3 células. A-tubulina foi escolhido como o controlo da carga de proteína citosólica. (B, D, F) em co-cultura com MCM aumentou a expressão de p65 nuclear, e o tratamento com smsDX reduziu o efeito de MCM. As histonas foram escolhidos como o controlo da carga de proteína nuclear. A quantificação do p65-C /a-tubulina e N-p65 /rácio de histona foi realizada como análise de densitometria.

(a) a co-cultura com MCM promovida de forma significativa a acumulação nuclear de p65 em LNCaP células. O tratamento com smsDX p65 inibiu a translocação nuclear. (B e C) A expressão e translocação de p65 após exposição a MCM e tratamento com smsDX em DU145 e células PC-3, respectivamente, foram analisados ​​através de imunofluorescência.

Discussão

a presença de leucócitos nos tumores foi observada pela primeira vez no século 19 por Rudolf Virchow, esta observação desde a primeira indicação de uma ligação entre inflamação e câncer [29]. Estudos epidemiológicos mostraram recentemente que os macrófagos representam um componente principal do infiltrado de leucócitos de acolhimento na maioria dos tumores malignos [30]. No entanto, o significado clínico da TAM se infiltra no câncer de próstata permanece controverso. Kiran el al relataram que o número médio de TAM foi maior no cancro da próstata do que em tecido benigno [31], enquanto que Norio et al relataram o resultado oposto [32]. No presente estudo, observamos aumento da infiltração de macrófagos no câncer de próstata e BPH com inflamação crônica em comparação com o tecido benigno. O aumento da infiltração de TAM também tem sido relatado para ser associado com a progressão da CaP pobre [33]. Portanto, TAM pode representar um indicador em potencial de câncer de próstata. Alguns estudos anteriores revelaram também que M2-polarizados THP-1 macrófagos pode promover o crescimento tumoral, invasão e metástase [34,35]. No presente estudo, verificou-se que a TAM-como M2 do tipo macrófagos aumentou a migração e invasão das células cancerosas da próstata. Além disso, MCM promoveu a tumorigenicidade de células PC-3 num modelo de xenoenxerto em ratinhos nus. Além disso, a administração de smsDX atenuou o potencial migratório e invasivo de células de câncer de próstata, que foi estimulada por macrófagos M2 do tipo.

Também observamos que a expressão de NF-kB na APC e BPH com amostras de inflamação crônica foi significativamente maior do que em BPH, esta expressão foi positivamente correlacionada com a infiltração de macrófagos. Por isso, centrou-se na função de NF-kB neste processo. factor nuclear kB (NF-kB) é um factor de transcrição indutível dimérica que pertence à família Rel /NF-kB. A sobre-expressão de genes que codificam para factores RelA /NF-kB tem sido observada em muitos tumores [36-39], e acredita-se que a desregulação de NF-kB para promover a proliferação celular, motilidade, invasão e metástase na maioria dos tumores da próstata, incluindo câncer [40,41]. NF-kB é considerado para ser um produtor molecular maior de inflamação e pode promover a imunidade por controlar a expressão de genes envolvidos na inflamação [42]. O presente estudo demonstrou que os macrófagos ativados NF-kB na CaP. Isto levou à progressão de células cancerígenas da próstata após a co-cultura com MCM. No microambiente tumoral, citoquinas de MAT poderia activar o NF-kB em células tumorais, promovendo assim a tumorigénese. As células tumorais, por sua vez expressar CSF-1 e pode ainda estimular e recrutar macrófagos [43]. Portanto, há um lacete parácrina dentro de progressão tumoral TAM-melhorada. E NF-kB desempenha um papel importante na acção deste ciclo.

somatostatina e seus análogos são hormonas neuroendócrinas e representam mediadores importantes entre o sistema nervoso e o sistema imunitário. O nosso e por outros grupos descobriram que estas hormonas podem inibir a proliferação e invasão de vários tipos de tumores [21,44]. Mais recentemente, dados experimentais significativos demonstraram que os análogos de SMS exibem actividade anti-inflamatória devido ao seu efeito inibidor sobre a secreção de TNF-α, IL-8 e IL-1β [45,46]. No entanto, com o melhor de nosso conhecimento, não houve nenhum estudo sobre os efeitos dos análogos de SMS sobre a expressão de NF-kB e comportamento biológico das células APC nos um microambiente inflamatório. No presente estudo, descobrimos que smsDX atenuou substancialmente a estimulação mediada por macrófagos da proliferação de células APC e invasão através da inibição da expressão e atividade de NF-kB

in vitro

e

in vivo

. subtipos de receptores da somatostatina 1 e 2 foram detectados em macrófagos humanos [22], e somatostatina imunorreactiva foi detectada no citoplasma de macrófagos. Portanto, especula-se que poderiam ligar com smsDX SSTR1 2 ou na superfície de macrófagos e quebrar o circuito parácrina entre o tumor e o microambiente inflamatório, aliviando assim a progressão estimulada por macrófagos de CaP.

Recentemente, distúrbios metabólicos incluindo a obesidade, diabetes tipo 2 e aterosclerose foram histologicamente visto como inflamação crônica de baixo grau com infiltração de macrófagos significativa [47,48]. Os macrófagos têm sido observados para estar em estreita proximidade com as células metabólicas e foram observados de possuir uma vasta assinatura transcricional que regulava o metabolismo de adipocytessuch como piruvato carboxilase, PPAR-γ, apolipoproteína C1, etc. [18]. Em indivíduos obesos, o excedente de energia ou produtos de macrófagos pode activar NF-kB, provocando mais recrutamento de macrófagos, e activação a iniciação e manutenção de uma reacção inflamatória que resulta em resistência à insulina [18]. Além exacerbando insensibilidade à insulina periférica, NF-kB também pode afectar o metabolismo da glicose e da respiração mitocondrial, o que é importante para o crescimento celular e oncogénese [49]. Nosso estudo anterior relatou que smsDX pode afetar o metabolismo celular ea função mitocondrial de células APC. Portanto, especula-se que smsDX pode atenuar o efeito de MCM nas células PCA através de acção sobre o metabolismo celular, além de anti-inflamação.

Tomados em conjunto, este estudo demonstra que a TAM pode promover o desenvolvimento e progressão de CaP, e que smsDX atenua esse efeito de regulação de NF-kB para baixo. Estes resultados indicam que smsDX pode ser uma droga terapêutica promissora para pacientes com câncer de próstata.

declaração Materiais e Métodos

Ética

Todos os espécimes humanos foram obtidos durante a cirurgia terapêutica. Este estudo foi realizado utilizando as amostras sobre as prateleiras após o diagnóstico patológico. Nós telefonou para todos os pacientes e obtiveram verbalmente consentimento informado. Este é especificamente aprovado pela Comissão de Shan Dong University Qilu Hospital de experiências humanas. Todos os cuidados com os animais e os protocolos experimentais respeitou as regras manejo animal do Ministério da Saúde da República Popular da China (documento No 55, 2001). Todos os animais foram mantidos no Laboratório de Key of Cardiovascular remodelação e Pesquisa Function no Hospital Qilu da Universidade de Shandong. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Shan Dong Universidade de experiências humanas Qilu Hospital e pelo Comitê de Cuidado Animal da Universidade de Shandong.

Pacientes e espécimes

Um total de 24 pacientes diagnosticados com CaP e 45 pacientes diagnosticados com HBP tratados no Serviço de Cirurgia Departamento de Urologia, Qilu Hospital da Universidade de Shandong entre outubro de 2010 e julho de 2012, foram incluídos neste estudo. Thereinto, dezesseis dos pacientes CaP foram submetidos a biópsia prostática transretal, e 8 pacientes foram submetidos a ressecção transuretral da próstata. Doze dos 45 pacientes hiperplasia prostática benigna (BPH) foram diagnosticados com a inflamação da próstata crônica histológica. Os parâmetros clínicos e classificações patológicas são apresentados e resumidos na Tabela 1. Nenhum dos pacientes tinham recebido terapia adjuvante pré-operatório. O diagnóstico de cada caso foi confirmado por dois patologistas.

linhas de células e cultura de células

linhas de células CaP Humano (LNCaP, DU145 e PC-3) e THP-1 células CaP foram adquiridos de o Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT) contendo soro fetal de vitelo a 10%, a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. Becasue TAM representa uma população distinta M2-polarizada macrófagos [50], monócitos THP-1 foram diferenciadas em macrófagos em meio RPMI contendo 5 ng /mL de forbol 12-miristato 13-acetato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 48 h de acordo com protocolos previamente estabelecidos [51]. Em seguida, os sobrenadantes das culturas foram esterilizadas por filtração e armazenadas a -20 ° C até que esteja pronto para uso.

imuno análise

A imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente [52]. Resumidamente tecidos parafina-embedded foram desparafinados e reidratadas. Após a recuperação de antigénios, todas as amostras foram expostas ao anticorpo primário (CD68 01:50, P65 1: 100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante a noite a 4 ° C, e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários conjugados com biotina durante 30 minutos a 37 ° C, seguido de complexo de avidina-peroxidase biotinilada, durante 20 min a 37 ° C. A coloração foi executado com tertrahydrochloride 3,3N-diaminobenzidina e hematina. O nível de expressão da proteína foi avaliada de acordo com a percentagem de células de tumor coradas positivamente e a intensidade da coloração por dois patologistas como descrito anteriormente [53]. Resumidamente, a percentagem de coloração positiva foi pontuada como 0 (0-9%, negativa), 1 (10% -25%, esporádica), 2 (26% -50%, focal) ou 3 (51% -100%, difusa), e a intensidade de 0 (sem coloração), 1 (fraca coloração, visível na ampliação elevada), 2 (moderada coloração, visível a baixa ampliação) e 3 (coloração escura, notavelmente positiva a baixa ampliação). A pontuação total imunocoloração foi calculada com o valor de pontuação por cento positividade × pontuação intensidade de coloração, que variou de 0 a 9. O nível de expressão da proteína foi definida da seguinte forma: “0+” (negativo, a pontuação 0), “1 +” ( fracamente positivo, a pontuação 1-3), “2+” (positivo, a pontuação 4-6), e “3+” (fortemente positiva, score7-9).

ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada através de ensaio de CCK8. Resumidamente, as células LNCaP (6 × 10

3 células /cavidade), DU145 (4 × 10

3 células /poço) e PC-3 (4 × 10

3 células /poço) as células em 200 ul de meio foram semeadas em placas de 96 poços. Depois de 12 horas para a adesão, o meio foi substituído por meio condicionado por macrófagos com /sem smsDX (10 nM). Após 24-72 horas, as células cultivadas foram tratadas com 20 ul de contagem celular Kit-8 (Dojindo, Japão) e incubados a 37 ° C durante um período adicional de 4 horas de acordo com as instruções de fabrico. A absorvância foi determinada a 450 nm.

Clone ensaio de formação de

LNCaP, DU145 e PC-3 de células a uma densidade de 1 x 10

3 células /poço foram semeadas em 6- placas de poços. Após a incubação, meio com /sem smsDX (10 nM) durante a noite condicionado foi adicionado ao meio, e as células foram incubadas em 5% de CO

2 e 37 ° C durante duas a três semanas. Quando os clones visíveis formadas sobre as placas, as células foram lavadas os clones com PBS e fixadas com metanol pré-arrefecido, e coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 20 min. As colónias contendo mais do que 50 células foram contadas sob um microscópio. A taxa de formação clone = (o número de clone /o número de inoculação de células) × 100%.

In vitro

zero ensaio

células CaP foram semeadas em 24 poços pratos. Após incubação durante 24 horas, cada poço foi riscado manualmente com uma ponta de pipeta de 200 uL, lavou-se três vezes com PBS e incubadas com meio condicionado com /sem 10 nM smsDX. As imagens foram tiradas novamente após 24 horas. A distância entre as duas bordas de células foram analisados ​​utilizando o software ImageJ.

Transwell ensaio de invasão

ensaio de invasão Transwell foram realizados como descrito anteriormente [54]. Em resumo, um total de 5 × 10

4 células suspensas em 100 de meio isento de soro ul foram adicionados às câmaras superiores do sistema Transwell (24 poços, de 8 mm de tamanho de poro; Corning Costar, Lowell, MA, EUA) revestidos com 2 mg /ml de Matrigel (BD Biosciences). TAM meio condicionado com /sem 10 nM smsDX foi então adicionada à câmara inferior. Após 24 horas, as células não invadidos na câmara superior foram removidas cuidadosamente com um cotonete de algodão enquanto as células ligadas à superfície inferior foram fixadas com metanol e coradas com solução pré-arrefecida de 1% eosina. Pelo menos dez campos de cada câmara foram seleccionados aleatoriamente e as células foram contadas ao microscópio.

Para o ensaio de migração, as células foram semeadas em câmaras superiores sem revestimento de Matrigel. O resto do ensaio foi realizado como o ensaio de invasão Transwell. Após 24 horas, as células na superfície inferior foram contadas também em pelo menos dez campos aleatoriamente, em seguida, o número de células foi analisada estatisticamente.

imunofluorescência

CaP células foram plaqueadas em vidro revestido de fibronectina lamelas. Após 24 h de incubação, as células foram lavadas com PBS, fixadas em metanol pré-arrefecido, e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100. As células fixadas foram pré-incubadas em soro de cabra normal a 1,5% e ainda incubadas durante a noite com um anticorpo primário contra P65 (diluição 1: 100) a 4 ° C. Após incubação com anticorpo de IgG anti-coelho de cabra conjugada com fluoresceína a 37 ° C, as lamelas foram montadas em lâminas de a com PermaFluor aquoso. A fluorescência foi observada utilizando um microscópio Zeiss Axioplan Universal.

Western blotting

As células foram lisadas em tampão RIPA contendo inibidores de protease 1%. Para isolar componente citoplasmático de uma nuclear, as células foram tratadas com CaP um kit de extracção de proteína nuclear (Beyotime Biotecnologia, Wuhan, China) e centrifugou-se a 3400 r.p.m. durante 10 min a 4 ° C. Os componentes nucleares e citoplasmáticos foram então sujeitas a transferência de Western. Quantidades iguais de proteínas de cada amostra foram separados através de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de PVDF utilizando um aparelho de transferência húmida (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas com leite não gordo a 5% durante 2 h à temperatura ambiente e incubadas com os anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. As membranas foram subsequentemente expostas aos anticorpos marcados com peroxidase de rábano secundárias (1: 2000) durante 1 h à temperatura ambiente, e reatividade foi detectado usando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham, Pittsburg, PA). Os níveis de proteína foram analisados ​​usando software ImageJ.

Tumor modelo de xenotransplante

isentos de agentes patogénicos camundongos BALB /c nu 4-5 semanas de idade (pesando 19 ± 2 g, grau SPF, SCXK2011 certificado -0012) foram comprados do Departamento de Ciência animal Laboratory da Universidade de Pequim (Beijing, China). Um total de 5 × 10

6 de células PC-3 foram recolhidas, misturadas com Matrigel e injectadas subcutaneamente no flanco de ratinhos nude. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em três grupos (5 por grupo). Os ratinhos foram dadas de MCM com ou sem smsDX a uma dose de 1 mg /kg /d por meio de injecção intraperitoneal, durante 4 semanas com monitorização semanal do tamanho do tumor e o peso corporal, enquanto que os ratinhos de controlo receberam o mesmo volume de solução salina normal. Todos os ratinhos foram sacrificados utilizando pentobarbital de sódio a 8 semanas após a inoculação das células de cancro e os tumores foram recolhidos.

A análise estatística

Os dados são principalmente apresentados como a média ± DP. pacote de software SPSS (versão 13.0; SPSS, Chicago, IL) foi utilizado para todas as análises estatísticas. diferenças significativas entre os valores de tratamento e controle foram analisados ​​utilizando análise de teste t ou one-way bicaudal de Student de variância sempre que apropriado. Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P 0,05. Cada variável foi testada duas vezes e o experimento foi repetido três vezes.

Reconhecimentos

American Journal Experts editar este manuscrito.