Abstract

plasticidade celular regulado pelo balanço entre o mesenquimais para a transição epitelial (MET) e do programa oposto, EMT, é fundamental na cascata metastática. Vários factores de transcrição (TFS) são conhecidas por regular o EMT, embora os mecanismos de Met permanecem obscuros. Nós demonstramos uma nova função de dois TFs, OVOL1 e OVOL2, como indutores críticos de MET em cancros humanos. Nossos resultados indicam que o controle OVOL-TFS conheceu através de um ciclo de feedback de regulamentação com EMT-induzindo TF ZEB1, ea regulação do mRNA splicing induzindo epitelial emenda Regulatory Protein 1 (ESRP1). Usando modelos de tumores de próstata do rato que mostram que a expressão de OVOL-TFS em células de câncer de próstata mesenquimais atenua o seu potencial metastático. O papel da OVOL-TFS como indutores de MET é ainda apoiada pela expressão analisa em 917 linhas celulares de cancro, sugerindo seu papel como reguladores cruciais da plasticidade celular epitelial-mesenquimal no câncer

Citation:. Roca H, J Hernandez , Weidner S, McEachin RC, Fuller D, Sud S, et al. (2013) Fatores de Transcrição OVOL1 e OVOL2 Induzir o mesenquimais para epiteliais de transição em Câncer Humano. PLoS ONE 8 (10): e76773. doi: 10.1371 /journal.pone.0076773

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Centro, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Abril 2013; Aceito: 28 de agosto de 2013; Publicação: 04 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Roca et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por U54-CA163124, U01-CA143055, P50-CA69568 e PO1-CA093900 do National Institutes of Health. KJP é suportado como um Professor de Pesquisa Clínica American Cancer Society e como um Taubman Research Scholar da Universidade de Michigan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Mais de 90% das mortes relacionadas com o cancro resulta de metástase [1]. Por conseguinte, devemos promover nossa compreensão dos mecanismos de condução progressão e metástase do câncer. Epitelial para mesenquimal (EMT), eo processo inverso do TEM, são programas cruciais envolvidos na cicatrização de feridas e desenvolvimento dos órgãos início [2]. EMT e MET também podem desempenhar papéis críticos em ambos progressão e estabelecimento de colônias metastáticas [3] câncer. Quando as células cancerosas sofrer EMT, eles adquirem a capacidade de dissociar-se do tumor primário e entrar na circulação. Estas células circulantes são, então, capaz de difundir e passando por MET, resultando em tumores metastáticos. Entender essa plasticidade fenotípica é uma chave para impedir a progressão do câncer [4].

EMT está ligada a alterações na expressão genética e morfologia e está associada com a regulação negativa de proteínas de adesão celular, tais como E-caderina (E-cad ). Este processo permite que as células cancerosas se desassociar dos seus vizinhos, aumentando a sua mobilidade [5]. Tem sido proposto que EMT é regulada pelo feedback recíproco lacetes entre ZEB1 /ZEB2 TFs e membros da família MicroRNA miR-200 [6,7]. Especificamente, pode induzir ZEB1 EMT reprimindo proteínas epiteliais e por downregulating seus próprios miR-200 repressores. Ao mesmo tempo, o miR-200s reprimir ZEB1, bem como factores de células estaminais e reguladores envolvidos em epigenética EMT. Pensa-se que estes loops de feedback recíprocas são responsáveis, em parte, para a plasticidade fenotípica exibiu no câncer e metástase [4].

Outras proteínas podem servir como reguladores /indutores de EMT ou potenciais biomarcadores para células mesenquimais. Indução de EMT tem sido associada com a expressão TGF-p [8]. Em parte, isso ocorre através da regulação positiva ZEB1 /2, o que, por sua vez, inibe a proteínas reguladoras de splicing epitelial (ESRP) [9]. Regulação negativa do PEIS, e a repressão resultante de splicing alternativo, tem sido mostrado para ser crucial na EMT. Por exemplo, no cancro da mama, a repressão de PEIS resulta em uma mudança na expressão da isoforma de CD44 que é crítico na indução de EMT e progressão do cancro [10].

Apesar do nosso conhecimento crescente sobre EMT, os mecanismos mediadores TEM são muito menos entendida. Usando dois modelos de próstata e células mesenquimais do cancro da mama, descobrimos que TFs OVOL1 (OVO-1 como, Entrez Gene ID 5017) e OVOL2 (ID Gene 58495) estão associados com MET em nossos modelos, bem como em outros cancros. OVOLs são TFs de dedos de zinco que actuam como reguladores de embriogénese [11-13]. Em primeiro lugar, analisou como OVOLs controlar a expressão de EMT-induzindo TFs e ESRPs. Em seguida, estudaram como MET, induzida pela OVOL-TFS, correlaciona-se com factores-chave do desenvolvimento de células epiteliais em linhas de células 917 de câncer que estejam em conformidade com o células cancerosas humanas Encyclopedia [14], e investigou as implicações da MET na regulação da célula cancerosa invasão e metástase.

resultados

células mesenquimais estáveis ​​isolados a partir de células de câncer de próstata epiteliais estáveis ​​co-cultivados com macrófagos

Para estudar os mecanismos de EMT na metástase do câncer de próstata, primeiro gerada uma linha de células de modelo epitelial derivada de células positivas luciferase epitelial da próstata PC3 cancerosas. Isolamos uma subpopulação de células que expressam a luciferase que mostrou um fenótipo epitelial estável em cultura e os designou PC3-epi. Estas células foram seleccionadas com base em dois critérios: intensidade bioluminescente e a morfologia das células epiteliais. Consistente com o estado do epitélio, as células PC3-epi mantido alta E-cad, baixa Vimentin, e expressão indetectável do ZEB1 EMT-ativador (Figura 1A e 1B)

(A) de fase brilhante microscopia:. Morfologia alterações nas células mesenquimais PC3-EMT1, PC3-EMT12 e PC3-EMT14, em comparação com as células de cancro da próstata PC3-epi epiteliais. Barras de escala são 200 mm

(B) Immunoblot:.. A expressão de marcadores de EMT em linhas celulares de cancro mesenquimais PC3-EMT1, -EMT2, -EMT12, -EMT14 e -EMT17 comparação com epitelial PC3-Epi

(C) Microarray: expressão gênica análise comparando mesenquimais para epiteliais linhas celulares de cancro. Venn-I (VD-I) representa uma assinatura associada a EMT comum expressa nas linhas de cancro mesenquimais PC3-EMT1, -EMT12 e -EMT14 comparação com epitelial PC3-Epi. VD-II -. Assinatura Gene da VD-I cruzado com a assinatura do ZEB1 células silenciadas PC3-EMT1 e -EMT14 usando o shRNA-sh4, em relação ao embaralhar (SCR) shRNA controle

(D) brilhante da microscopia de fase: células PC3-EMT14 transfectadas com ZEB1-shRNAs: SH2, sh4 ou SCR. Barras de escala são 100 mm

(E) Immunoblot:.. A expressão de marcadores de EMT no PC3-EMT1 e -EMT14 transfectadas com ZEB1-shRNAs comparação com Scr ou controles não transfectadas

(F ) mapa de calor: 50 genes assinatura identificada no VD-II (painel C). genes regulados positivamente estão em vermelho, reprimidos em azul. Fold alterações em células cancerosas mesenquimais são em relação ao epiteliais PC3-epi, e em células transfectadas em SH4 são em relação ao controle de SCR.

Os imunoblots apresentados são representativos de duas experiências independentes, com resultados semelhantes. Veja também Figura S1 e Tabela S1.

A seguir, desenvolveu um modelo mesenquimais a partir de células PC3-EPI, através de interações com macrófagos. Colocámos a hipótese de que esta seria possível porque os macrófagos representam uma das principais células-infiltrados inflamatórios no microambiente tumoral e que têm sido implicados na metástase [15,16]. Co-cultura de CD14 + monócitos tratados com IL4 (M2-macrófagos) com PC3-Epi durante quatro dias induziu fortes alterações morfológicas consistentes com EMT, com concomitante declínio na expressão de E-cad e aumento Vimentin (Figuras S1A e S1B). A partir destas células foram isoladas sub-populações mesenquimais designados como PC3-EMT1, PC3-EMT2, PC3-EMT12, PC3-EMT14 e PC3-EMT17. Estas células mesenquimais demonstraram uma notável alteração fenotípica e expressão de ZEB1, que foi mantida de forma estável em cultura (Figura 1A e 1B). Em comparação com os PC3-epi as células epiteliais mesenquimais parentais expressaram níveis mais baixos de a molécula de adesão da célula epitelial EpCAM; No entanto, ainda cerca de 45% das células expressaram EpCAM na superfície da célula, como demonstrado por citometria de fluxo (Figura S1C).

Para avaliar as alterações de expressão de genes relacionados com EMT nós realizadas três análises de microarray, comparando PC3-EMT1, PC3-EMT12 e PC3-EMT14 para PC3-Epi. Foram identificadas uma assinatura de 867 genes que mostram mudanças na expressão (por duas vezes ou mais) em todas as três comparações, (VD-I, a Figura 1C). Usamos Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) para averiguar as funções moleculares mais significativamente enriquecidos associados com esta assinatura: ‘movimento celular’, ‘o crescimento e proliferação celular “,” sinalização célula-célula e interação’ e “morte celular” são todos consistentes com EMT (Tabela S1). ZEB1, que foi regulada positivamente em todas as três comparações, tem sido amplamente implicado em EMT e manutenção do estado mesenquimal [2,7]. Outros factores de transcrição de indução de EMT como caracol, ou TWIST1 Slug, frequentemente implicado na tumorigénese e metástase [2], não foram identificados entre o assinatura EMT comum de 867 genes descrito acima. Portanto, para compreender o papel da ZEB1 no programa de células EMT, nós transfectadas duas linhas mesenquimais (PC3-EMT1 e PC3-EMT14) com um dos dois vetores lentivirais ZEB1-shRNAs: SH2 e sh4, além do controle mexidos (SCR). Consistente com o papel de ZEB1 na EMT e manutenção do estado mesenquimal, silenciamento de ZEB1 induzida MET no PC3-EMT1 e PC3-EMT14, com as correspondentes alterações na morfologia celular (Figura 1D). Além disso, SH2 e sh4 induziu um declínio marcante na ZEB1, correspondendo a regulação positiva de E-cad (Figura 1E). Estas experiências sugerem fortemente um papel essencial de ZEB1 no estado EMT destas células. Quando o conjunto de genes diferencialmente expressos em células transfectadas em SH4 foi combinado com o assinatura EMT (VD-I), foram encontradas alterações de expressão em 50 genes que se correlacionam com MET transformação (VD-II, Figura 1C). Esta assinatura mostraram regulação oposto quando as células foram transfectadas com ZEB1 SH4-shRNA, em relação ao controlo scrambled (Figura 1F). Esta abordagem também identificou um conjunto de 4 TFs significativamente regulada negativamente nas células mesenquimais e reguladas positivamente pelo ZEB1-shRNA:. IRF6, ANKRD22, EHF e OVOL2

OVOL1 e OVOL2 regular MET no modelo de cancro da próstata

Tendo em conta as alterações observadas na expressão de IRF6, ANKRD22, EHF e OVOL2 em EMT, bem como o feedback observada entre ZEB1 e estes TFs, especulamos que as características EMT estáveis ​​mantida durante a propagação de PC3-EMT1 e células PC3-EMT14 são o resultado de um ciclo de realimentação de regulamentação. Do mesmo modo, uma vez que estes genes foram reprimidos na EMT, superexpressão eles podem induzir o TEM. Nós avaliamos o papel de cada um dos 4 TFs upregulated individualmente por transdução de células PC3-EMT14 com construções de lentivírus com superexpressão. A expressão destes 4 TFs nas células EMT demonstrado que OVOL2 apareceu para regular TEM, como observado por uma alteração na morfologia celular. Dadas as fortes paralelos entre OVOL2 e OVOL1, bem como o papel aparente de OVOL2 em MET, que considerou ainda se OVOL1 pode ter um papel na TEM. Embora OVOL1 não satisfazer o limiar de 2 vezes para ser incluído na assinatura de genes de microarranjos de ZEB1 células knockdown, a análise mostrou que qPCR é altamente regulada positivamente em células PC3-epi epiteliais e seguindo ZEB1 silenciamentos em comparação com o PC3- mesenquimais EMT14 (Figura 2A e Figura S2A). Portanto, nós também analisou a expressão de OVOL1 nas células PC3-EMT14 mesenquimais. A sobre-expressão de ambos OVOL1 e OVOL2 induzida uma transformação acentuada da morfologia celular e um aumento paralelo na expressão de E-CAD (Figura 2B e 2C). Além disso, ambos os OVOLs aumento da expressão de ESRP1 (figura 2C, painel esquerdo) [17]. Por qPCR Em seguida, analisamos as mudanças na expressão de vários fatores de transcrição de indução de EMT: ZEB1, ZEB2, Caracol, Lesma e TWIST1 (Figura 2C, painel da direita). Entre esses fatores ZEB1, ZEB2 e Slug revelou uma diminuição significativa na expressão, que se correlaciona com o TEM. Constatou-se que as mudanças de expressão observados em OVOL1 e OVOL2 correspondem a alterações nos níveis de proteínas por transferência de Western (Figura 2D). Nós, então, comparada lisados ​​celulares de OVOL1 e células OVOL2-sobre-expressam a PC3-Epi, PC3-EMT14-EV e células sobre-expressam o FT IRF6 e ANKRD22, também regulada por ZEB1 (Figura 1F). Resgate de E-cad e perda de vimentina foram induzidos em ambas as células que sobre-expressam OVOL, enquanto nenhuma alteração significativa foi observada em células que expressam os outros TFs (IRF6 e ANKRD22) (Figura 2E). Embora qPCR refletiu uma mudança significativa na expressão de Slug, o Oeste não mostram uma mudança no nível de proteína nas células OVOL com superexpressão, sugerindo que a regulação de translação pode desempenhar um papel nos níveis de lesma. Dos cinco TFs testadas, estes resultados indicam que OVOL1 OVOL2 e são indutores principais de Met nestas células

(A) qPCR:.. A expressão de ARNm em PC3-EMT14-SH4 relação ao PC3-EMT14-Scr

(B) em fase brilhante microscopia: as células PC3 que expressam-EMT14 OVOL1 OVOL2 e exibem um fenótipo epitelial, em comparação com o PC3-EMT14 parental. Barras de escala são 100 mm

(C) qPCR:. A expressão dos marcadores de células epiteliais E-cad e ESRP1, e as células PC3-EMT14 TFs ZEB1, ZEB2, Slug, Caracol, e TWIST1 no indutor de EMT expressando OVOL1 e OVOL2 relação ao empty-vector (EV) de controle

(D) Immunoblot:.. a expressão da proteína OVOL1 e OVOL2 em células transfectadas foi confirmada usando OVOL1 ou específicas-V5 anticorpos, respectivamente

(e) Immunoblot: Expressão de epitelial marcador e-cad e marcadores mesenquimais ZEB1 e vimentina. Mudanças na expressão de Slug foram mínimas e não se correlacionou com o TEM. células PC3-EMT14 expressando IRF6 ou ANKRD22, EV e epitelial PC3-Epi são controles

(F) Invasion ensaio /migração:. Imagens representativas e gráficos de invasão de células cancerígenas usando um ensaio de câmara de Boyden. Os gráficos de barras de OVOL1 e OVOL2 expressando células PC3-EMT14 EV relativa. Por cento invasão representa o invasor rácio /células migrantes. O gráfico é representativo de um de três experiências independentes

(L) qPCR:. Expressão de células PC3-epi-transfectadas com OVOL1 shRNAs (a, b, c) ou OVOL2-shRNAs (d, e, F), em relação ao controlo não-silenciamento PC3-epi-NS (representada pela linha tracejada)

(H) de imunotransferência:. células PC3-epi transfectadas com ambos OVOL1 e OVOL2 shRNAs (SH-OVOL1 /2) demonstram uma diminuição no e-cad e aumento Vimentin, o que sugere uma transformação parcial EMT

(I) Esquema:. o promotor ZEB1 com locais potenciais OVOL2 de ligação (triângulos laranja) de acordo com o consenso geral: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A). TaqMan concebido pares de iniciadores são mostradas como setas pretas. A numeração é relativo ao local de iniciação da transcrição (1). A sequência de um local de ligação putativo OVOL2 que corresponde ao ADN chip no células que expressam OVOL2 está em 320

(J) qPCR ChIP:. (Esquerdo) mostra cromatina entrada de PC3-EMT14-OVOL2 em relação ao EV, e demonstra que foram utilizadas quantidades semelhantes de ADN (para a direita). descreve o DNA ChIP utilizando anticorpos OVOL2. Primers são nomeados após a sua iniciador directo (ver o painel I). Os resultados foram normalizados para os controlos de entrada. O gráfico mostra uma experiência representativa de três com resultados semelhantes.

Resultados

qPCR foram normalizados a p-actina. Os gráficos mostram média +/- SEM; Os valores de p são representados como * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. Os imunoblots qPCRs e são representativos de duas experiências independentes, com resultados semelhantes. Veja também Figura S2.

Para entender a implicação do MET OVOL mediada no potencial invasivo das células PC3-EMT14 mesenquimais, usamos ensaio de câmara de Boyden em células com superexpressão OVOL1 /2. Ambos os OVOLs afetou significativamente a capacidade de invasão de PC3-EMT14. No caso de OVOL1, observou-se a migração celular reduzida, o que afectou a razão de migração invasão (índice de invasão) comparada (Figura 2F). células com superexpressão OVOL2 demonstraram um declínio significativo em ambos os invasão e migração, com um índice de invasão altamente reduzida. Estes resultados suportam o papel de OVOL1 e OVOL2 na diminuição da migração e invasão, como esperado para MET células reprogramadas.

A seguir, utilizado shRNAs para OVOL1 (shOVOL1-a, b, c) e OVOL2 (shOVOL2- d, -e, f), para reduzir a sua expressão em células PC3-epi epiteliais (Figura 2G). Nenhum dos shRNAs afetados expressão E-cad. No entanto, em células com expressão diminuída OVOL2, observou-se uma regulação positiva significativa (até 3 vezes) de ARNm ZEB1. Estes resultados sugerem que uma alteração de 3 vezes na expressão ZEB1 não é suficiente para induzir EMT em células PC3-epi. Além disso, como observado por qPCR, a expressão de ZEB1 é mais de 20 vezes superior em PC3-EMT14 em comparação com células PC3-epi (Figura S2a). Além disso, dada a função similar de OVOL1 e OVOL2 na indução de TEM é tentador especular que eles poderiam substituir um pelo outro. Isto pode explicar porque um knockdown de apenas um dos OVOL não é suficiente para induzir uma mudança significativa na E-cad. Para testar esta possibilidade foi realizado um knockdown duplo com shRNAs para cada um dos OVOL-TFS. Apesar de não selecção de células transfectadas foi possível (ambas as construções shRNA expressaram a GFP), uma população total de células transfectadas com shOVOL1-A e shOVOL2-d (shOVOL1 /2-a /d) demonstrou uma regulação positiva significativa de vimentina e uma diminuição parcial na E-cad relação ao controle células PC3-Epi-NS (Figura 2H). No geral, estes resultados sugerem um papel crítico de ambos os OVOLs na manutenção do estado epitelial dessas células e, por conseguinte, um knockdown duplo seria necessária para induzir e manter o estado mesenquimais. Por conseguinte, uma maior knockdown de OVOL1 e OVOL2 induziria uma transformação EMT mais completa em células cancerosas.

Outros experimentos em células de câncer de próstata induzidos a sofrer EMT levou a conclusões semelhantes sobre a regulação do OVOL e ZEB1 TFs. Por exemplo, a proteína transmembranar tetraspanina-8 (TSPAN8) foi identificado na assinatura mostrado na Figura 1F como um gene regulado positivamente em células EMT e regulados negativamente por ZEB1-shRNA. A sobre-expressão de TSPAN8 nas células PC3 e DU145-epi epiteliais levou a transformação parcial EMT caracterizado por a regulação positiva de ZEB1 e a regulação negativa dos TFs OVOL em ambas as linhas celulares (Figura S2B-E).

um repressor transcricional função de OVOL2 foi anteriormente mostrado nos queratinócitos, onde OVOL2 reprimidos c-Myc e Notch1 [18]. Uma vez que a expressão ZEB1 aumentou significativamente em células diminuiu com OVOL2 (Figura 2G), testou-se OVOL2 interage directamente com o promotor ZEB1. Foi realizada imunoprecipitação da cromatina (ChIP) visando o promotor ZEB1 em células de controlo PC3-EMT14-OVOL2 e com dois anticorpos, anti-OVOL2 e anti-V5-tag. Nós projetamos 7 iniciadores TaqMan e sondas que medem o promotor -4.848-530 pb (Figura 2I) e encontrou vários locais potenciais OVOL2 Encadernação: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A) [18]. Com ambos os anticorpos, observamos sobre o enriquecimento de 50 vezes para o primer mesmo /sonda-position (+ 382 /+ 530) quando se comparam as células de controlo (Figura 2J e Figura S2B) OVOL2-expressar e. Em contraste, a cromatina de entrada de ambos os tipos de células apresentaram amplificação semelhante com todos os pares de iniciadores. Estes resultados indicam a ligação específica de OVOL2 ao promotor ZEB1 na região 325, onde um local de consenso de OVOL2 foi identificado (Figura 2I). Além disso, uma vez que nenhum fragmento de cromatina específica foi amplificado com -115 /+ 29 iniciadores, é improvável que OVOL2 liga-se ao local 115, um outro local potencial na região proximal (Figura 2I). Fragmento 123 – (- 115) = 238 bp é significativamente menor do que 530 – (115) = 415 pb; mas sobre o mesmo tamanho de + 530 – (325) = + 205 pb. Por conseguinte, uma ligação para o local 115 implicaria uma suspenso específica de um fragmento de cromatina que devem ser detectados, com os -115 /+ 29 iniciadores. Juntamente com os dados shRNA e expressão, estes resultados sugerem que OVOL2 atua como um repressor da transcrição direta de ZEB1.

As células mesenquimais formam tumores mesenquimais in vivo

Para determinar o potencial tumorigénico do PC3-EMT12 e PC3-EMT14, nós subcutaneamente inoculados ratos NSG imunocomprometidos. Ambas as linhas celulares de cancro mesenquimais formada predominantemente tumores mesenquimais do tipo caracterizadas por baixo E-cad e alta ZEB1, enquanto os tumores PC3-epi apresentou alta E-cad e baixa expressão ZEB1 (Figura S3A). Vimos há diferenças significativas nas taxas de crescimento do tumor entre os grupos (Figura S3B). Para avaliar o potencial metastático das células mesenquimais, foi utilizado o modelo de ratinho de injecção intracardíaca (ICI) da metástase do cancro [19]. Observamos mais ratos com metástases em vários sites nos grupos injetados com células PC3-EMT14 (Figura 3A) PC3-EMT12 ou. Eles também mostrou uma carga tumoral total mais elevada (cerca de uma ordem de grandeza) e diminuiu a sobrevivência do rato, em comparação com ratinhos injectados com células PC3-epi parentais (Figura 3B e Figura S3C). coloração simultânea com E-cad e ZEB1 anticorpos demonstraram que metastáticos PC3-EMT12 e PC3-EMT14 tumores exibida características típicas mesenquimais (baixo E-cad e alta ZEB1), enquanto que os tumores metastáticos de células PC3-epi exibido predominantemente características epiteliais (alta E- cad e baixa ZEB1) (Figura 3C e Figura S3D-e). Nossos resultados sugerem que as células mesenquimais (PC3-EMT12 e PC3-EMT14) formam metástases que mantêm o fenótipo mesenquimal. Notavelmente, alguns tumores metastáticos de células PC3-epi exibiu tanto mesenquimais e características epiteliais, embora a maioria dos tumores PC3-epi demonstraram o fenótipo epitelial (Figura 3C). A Figura 3C mostra um rato injectado com células PC3-epi, onde um tumor no fémur esquerdo foi predominantemente tipo mesenquimal, ao passo que o tumor no direito apresentaram um fenótipo altamente epitelial. Importante, encontramos plasticidade celular epitelial-mesenquimal semelhante em um tumor metastático isolado a partir do fémur de um paciente com cancro da próstata avançado. IHC coloração de secções de tumor com E-cad e ZEB1 anticorpos mostraram regiões com ambos altamente epitelial (alta E-cad, baixa ZEB1) e com características mesenquimais (baixo E-cad e alta ZEB1) (Figura 3D).

(A) Metástase:. A percentagem de ratinhos inoculados com ICI-múltiplos sinais de luciferase aos 21 e 35 dias

(B) carga tumoral: Os ratinhos receberam a ICI e foram fotografadas por semana durante 35 dias. expressão de luciferase é representado como regiões de interesse (ROI-fótons /s)

(C) IHC:. simultânea ZEB1 e coloração E-cad de metástases detectadas no fêmur e fígado de PC3-Epi ou PC3-EMT14 ratinhos injectados. células Observe o mesenquimais (ZEB1

alto /E-cad

Baixa) (setas pretas) e epiteliais (ZEB1

baixo /E-cad

alto) (setas verdes) de câncer, descrevendo a EMT /plasticidade MET em subpopulações de PC3-Epi e PC3-EMT14. Barras de escala são 100 mm (preto) e 20 mm (vermelho)

(D) IHC:. ZEB1 ou E-cad coloração de metástase do fémur de um paciente com câncer de próstata avançado. Observe o mesenquimais-like (ZEB1

elevadas (setas pretas) /E-cad

baixas (setas amarelas)) e epitelial (ZEB1

baixo /E-cad

elevadas (setas verdes)) câncer células. Barras de escala apresentados representam 100 mm (barra preta) e 50 mm (barra vermelha)

(E) Metástase: a.. A percentagem de ratos ICI-inoculados com múltiplos sinais de luciferase aos 21 e 35 dias

(F) carga tumoral: Os ratinhos receberam a ICI e foram fotografadas por semana durante 35 dias. expressão de luciferase é retratado como regiões de interesse (ROI-fótons /s)

(G) IHC:. ZEB1 ou E-cad coloração de metástases no ICI-ratos. Observe o maior E-cad e menor expressão ZEB1 nas células metastáticas expressar OVOL1 ou ZEB1-shRNA (sh4). barra de escala representa 100 mm

Os gráficos mostram média +/- SEM.; Os valores de p foram calculados e representados como * p 0,05; ** P 0,01. Todas as imagens IHC são representativos de um em cada três seções que mostram resultados semelhantes. Ver também figura S3.

De acordo com os resultados mostrados na Figura 2B-E, o efeito da sobreexpressão OVOL1 é semelhante ao OVOL2. Ambos induzem MET e ZEB1 downregulation. Além disso ZEB1-shRNA induz a expressão de ambos OVOL1 e OVOL2 e MET na mesenquimais células PC3-EMT14 (Figura 2A). Para elucidar o papel do OVOL TFs no potencial metastático das células, nós inoculados camundongos via ICI com células epiteliais com superexpressão OVOL1 (PC3-EMT14-OVOL1), ZEB1-shRNA (PC3-EMT14-sh4) ou o controle mexidos (PC3- EMT14-SCR). Foram avaliados a progressão do tumor por bioluminescência e observou que induziu MET em células PC3-EMT14 reduziu significativamente o potencial metastático. Ambos ZEB1-shRNA e expressão OVOL1 reduziu o número de ratinhos com metástases de tumores em locais múltiplos (Figura 3E). Além disso, a carga global tumor diminuiu significativamente quando comparado com camundongos injetados com células de controlo PC3-EMT14-Scr (Figura 3F). IHC coloração de tumores metastáticos com E-cad e ZEB1 revelou que MET tinha ocorrido em células tumorais que expressam OVOL1 ou ZEB1-shRNA, como indicado pela positiva E-cad e reduzido expressão ZEB1 em contraste com as células de controlo mesenquimais (Figura 3G). induzida por OVOL

MET reduz o potencial metastático das células cancerosas mesenquimais

Para investigar ainda mais o potencial metastático das células que expressam OVOL, foi utilizado um modelo de camundongo ortotópico de câncer de próstata [20]. Na análise bioluminescência, vimos um fardo semelhante total do tumor (ROI) em todos os grupos (Figura 4A). Vinte e oito dias após a inoculação, o número de ratinhos com metástases foi significativamente menor no grupo injectado com as células que expressam OVOL (Figura 4B e 4C). Nós ressecado tumores primários 42 dias após a inoculação, gravou seus pesos, e analisadas secções tumorais por IHC. os pesos dos tumores de próstata ortotópicos foram significativamente maiores em ratinhos inoculados com PC3-EMT14-OVOL2, enquanto que os ratinhos injectados com células PC3-EMT14 de controlo apresentou os menores pesos (Figura 4D). A redução observada no potencial metastático de células que expressam OVOL em nosso modelo correlaciona com um relatório anterior que mostra que os ratos com maiores tumores de próstata ortotópicos tinha um fardo metastático [20]

(A) Carga tumoral reduzido:. A expressão de luciferase é descrito como regiões de interesse (ROI-fótons /s) em ratos com injeções ortotópicos

(B) Metástase: a. (Esquerda) a percentagem de ratos ortotopicamente inoculados com múltiplos sinais de luciferase aos 21 e 28 dias (direito ). mostra o número total de metástases por grupo dividido pelo número de ratos (n) por grupo em 28 dias

(C) Imagem:. Imagens representativas de expressão luciferase em ratinhos 28 dias após receber injeções ortotópico. . Metástases para cada grupo são circulados em vermelho quer nas imagens ventral ou dorsal e excluindo os suspeitos para corresponder ao mesmo tumor

(D) Peso do Tumor: Os pesos médios dos tumores ortotópicos (próstata) ressecados a 42 dias (n = 4)

(e) IHC:. e-CAD, e coloração ZEB1 de tumores metastáticos em ratinhos que receberam injecções ortotópicos de cada grupo inoculado com células que expressam OVOL ou controlo PC3-EMT14. Observe o maior E-cad e menor expressão ZEB1 em células cancerosas que expressam OVOL. A barra de escala representa 100 fim. O IHC mostra uma coloração representante de uma das três secções, com resultados semelhantes

Os gráficos mostram média +/- SEM.; Os valores de p foram calculados e representados como ** P 0,01. Veja também Figura S4.

IHC coloração dos tumores revelou que os tumores PC3-EMT14 (ortotópicos e metástases) são predominantemente mesenquimais e são na sua maioria negativa para a expressão E-cad e positivo para ZEB1 (Figura 4E e Figura S4A). Estas células mesenquimais podem proliferar e formar metástases. Este foi ainda demonstrada pela coloração positiva Ki67 de células negativas E-CAD nas secções tumorais metastáticas de ratinhos PC3-EMT14 (Figura S4B). Embora não podemos excluir a possibilidade de MET transitória seguido de EMT, estes resultados sugerem que as células mesenquimais não precisa se submeter a MET para colonizar o tumor. Em contraste, as células que expressam OVOL formado tumores e metástases ortotópicos com forte fenótipo epitelial, caracterizado por uma elevada expressão de E-cad e reduzido ZEB1; o que sugere fortemente que a OVOL-TFS induzir e estabilizar MET nessas células (Figura 4E e Figura S4A).

OVOL TFs orquestrar um programa de transcrição e splicing-regulação que induz MET em células cancerosas humanas

a seguir, olhou para resultados consistentes usando matrizes de cDNA de tecidos a partir de secções de tumores de câncer de próstata humanas (n = 40), através da avaliação de expressão de e-cad, OVOL1 e OVOL2. Para demonstrar a correlação entre o E-cad e OVOL-expressão normalizamos cada valor de amostra para o valor médio de todas as amostras de tumor. Observou-se forte correlação entre a E-cad e OVOL1 (r = 0,66) e OVOL2 (r = 0,7) em todos os tecidos tumorais da próstata testados (Figura 5A)

(A) qPCR:. CDNAs de câncer de próstata primário humano tecidos (n = 40; Origene) foram analisados ​​para a expressão de e-cad, OVOL1 e OVOL2. Os resultados foram normalizados para a p-actina e mostrado em relação à média de todas as amostras de câncer para cada gene como:.

log ((Valor do Gene (X) para uma amostra) /(Valor do Gene (X ) para o cancro médio)). Os valores da amostra são mostrados nos gráficos de pontos e a correlação de OVOL1 ou expressão OVOL2 com E-cad foi calculada (r). O gráfico mostra uma experiência representativa em duas com resultados semelhantes

(B) diagrama de Venn:. Representa os resultados de ARN-SEQ de genes expressos diferencialmente em comum o OVOL células e PC3-epi que expressam, em relação ao PC3- EMT14. A intersecção de A e B representa uma assinatura de transcrição epitelial comum de 277 genes. Os dados de ARN-SEQ foi analisada a partir de pelo menos duas réplicas biológicas para cada linha celular

(C) Ponto trama:. Análises de correlação Expressão dos 277 genes identificados na assinatura epitelial do painel (B). Correlação é retratado entre PC3-Epi, PC3-EMT14-OVOL1 ou PC3-EMT14-OVOL2

(D) diagrama de Venn:. Compara os resultados do painel (B) com os genes que se correlacionam com a expressão do OVOLs em 917 linhas de células de cancro humano. A partir dos 129 genes que correlacionados (r 0,5), com a expressão OVOLs nas linhas de células cancerosas 917, 67 genes são induzidos pela expressão de ambos OVOL1 e OVOL2 em PC3-EMT14 (C intersecção D)

(E) mapa de calor: análise ConceptGen do 67 gene-assinatura a partir do painel (D) revelou uma lista de 18 genes anotados com funções relacionadas com o estado epitelial das células

p> Table <(F): 45. genes negativamente correlacionada com a expressão OVOL2 (r -0,5) em toda 917 linhas celulares de cancro. Entre estes 45 genes, o 10 mostrado também são regulados negativamente pela expressão OVOL2 em PC3-EMT14. §§2.086.13/4.812.91/2.31+NM_016351ADAM221.000.400.4+NM_014324AMACR5.292.350.45+NR_036556ANKRD540.9900+NM_001010986ATP11C4.321.500.35+NM_174957ATP2A30.2600+NR_024597C11orf7300.46INF+NM_001001389CD440.395.1313.20+NM_001185177CES300.31INF+NM_203356CTAGE50.550.130.24+NM_001085460CTNND112.895.420.42+NM_133375DIS3L1.5000+NM_004432ELAVL21.450.370.26+NM_001135023ELMOD3*0.352.497.06+NM_001135022ELMOD3*3.761.850.49+NM_203343EPB4100.97INF+NM_001184939EPB41L5*1.493.662.47+NM_020909EPB41L5*1.740.620.36+NM_017848FAM120C1.860.920.5+NM_001015045FAM13A3.331.560.47+NM_001134456FAM55C5.552.650.48+NM_000802FOLR10.060.325.44+NM_001018100GCOM11.144.523.96+NM_001193322IKBKE0.9000+NM_016291IP6K26.1000+NM_177535_1MAGED4B9.113.070.34+NM_145687MAP4K422.7410.810.48+NM_001042453MST400.31INF+NM_022764MTHFSD1.670.750.45+NM_203318MYO18A2.385.782.43+NM_001098623OBSCN0.220.673+NM_001128629PAK63.016.252.07+NM_001166109PALLD1.846.803.69+NM_001146105PARP95.5311.412.06+NM_001184917PCYT21.103.142.85+NM_153321PMP2213.015.040.39+NM_182948PRKACB3.740.900.24+NM_001164758PRKAR1B*1.404.293.06+NM_001164759PRKAR1B*5.132.190.42+NM_002840PTPRF1.696.523.85+NM_144489RGS35.161.430.28+NM_138484SGOL100.41INF+NM_001135054SIGIRR15.506.130.4+NM_020428SLC44A2*5.8922.833.88+NM_001145056SLC44A2*28.715.320.19+NM_001104590SLFN111.800.600.33+NM_001184749SLITRK40.280.090.32+NM_001128210SPRED24.300.370.09+NM_001198531TCF7L22.050.740.36+NM_001167912VEPH14.4100+NM_014667VGLL42.556.172.41+NM_139119YY1AP12.084.912.36+NM_001145448ZNF2000.500.150.3+Table 0,01;