Sumário

Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel importante no desenvolvimento do câncer. Por clonagem e sequenciação de um HPV16

+ CaSki célula pequena biblioteca RNA, foram isoladas 174 miRNAs (incluindo o romance miR-193C) que poderiam ser agrupados em 46 espécies de miRNA diferentes, com miR-21, miR-24, miR- 27a e miR-205 sendo mais abundante. Nós escolhemos para estudo posterior 10 miRNAs de acordo com a sua frequência clonagem e associada seus níveis em 10 Câncer cervical ou linhas celulares derivadas de neoplasia intra-epitelial cervical. Não foi observada nenhuma correlação entre a sua expressão com a presença ou ausência de um genoma de HPV integrado ou epissomal. Todas as linhas celulares examinadas não continha qualquer detectável miR-143 e miR-145. linhas de células infectadas com o HPV expressa um conjunto diferente de miARNs quando cultivadas na jangada organotípicas cultivadas em comparação com a cultura de células em monocamada, incluindo a expressão de miR-143 e miR-145. Isto sugere uma correlação entre a expressão miRNA e diferenciação de tecidos. Usando matriz miRNA análises para colo normal pareados por idade e tecidos de cancro do colo do útero, em combinação com a verificação de transferência de Northern, identificamos miRNAs significativamente desregulados em tecidos de câncer cervical, com miR-126, miR-143 e miR-145 downregulation e miR-15b , miR-16, miR-146a, e miR-155 regulação positiva. Os estudos funcionais mostraram que tanto o miR-143 e miR-145 são supressora do crescimento celular. Quando introduzidas em linhas celulares, o miR-146a foi encontrada para promover a proliferação celular. Colectivamente, os nossos dados indicam que a regulação negativa de miR-143 e miR-145 e miR-regulação positiva de 146a desempenhar um papel na carcinogénese cervical

citação:. Wang X, Tang S, Le SY, Lu R, Rader JS , Meyers C, et ai. (2008) expressão aberrante de Oncogênicos e MicroRNAs tumor-supressora em câncer cervical é necessária para o crescimento de células cancerígenas. PLoS ONE 3 (7): e2557. doi: 10.1371 /journal.pone.0002557

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, China

Recebido: 10 Abril de 2008; Aceito: 13 de maio de 2008; Publicação: 02 de julho de 2008

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional do Câncer, Centro de pesquisa do Câncer e pelo NIH bolsas CA 94141 e CA 95713to JSR e CA 79006 a CM

Competir interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer cervical é um dos cancros mais comuns em mulheres em todo o mundo, com uma incidência global estimada em 470.000 novos casos e cerca de 233.000 mortes por ano [1], [2]. O câncer cervical é a principal causa de morte por câncer em muitos países com poucos recursos, onde rastreio generalizado por citologia cervical não está disponível. A incidência é menor em países desenvolvidos, como consequência do rastreio do colo do útero e de programas de educação sanitária ativos em andamento. taxas de cancro do colo do útero nos Estados Unidos foram estimados em 10.370 novos casos e 3.710 mortes em 2006 [3]. A relação causal entre HPV de alto risco de infecção (HR-HPV) e o cancro cervical tem sido bem documentada em estudos epidemiológicos e funcionais. HPVs de alto risco, tais como HPV16, HPV18 e HPV31, foram detectados em até 99,7% dos carcinomas de células escamosas do colo do útero e 94% -100% dos carcinomas de adenosina e adenoescamosos cervicais [4], [5]. As oncoproteínas de HPV de alto risco, E6 e E7, contribuem para a carcinogénese do colo do útero, por inactivação do tumor celular p53 e proteínas supressoras de pRb, respectivamente [6] – [8].

miARNs são reguladora, não codificante RNAs sobre 21-23 nucleótidos de comprimento e são expressos em fases específicas do desenvolvimento do tecido ou diferenciação de células, e têm efeitos em larga escala sobre a expressão de uma variedade de genes ao nível pós-transcricional. Através de emparelhamento de bases com os seus ARNm-alvo, um miARN induz a degradação de ARN ou supressão de translação dos transcritos segmentados [9], [10]. miRNAs celulares são transcritos pela RNA polimerase II, transcrições, desde tampado, principal poliadenilado miRNA (pri-miRNA) que ostentem uma estrutura hairpin haste-laço de ~ 80-nts [11]. miARNs maduros resultar da transformação de pri-miARNs em dois passos sequenciais de clivagem mediada por duas enzimas de ARNase III Dicer, Drosha e [12]. Drosha, em complexo com DGCR8, cliva o pri-miARN a uma distância especificada (aproximadamente 11 pb) a partir da junção da haste de ARN de cadeia simples, no núcleo para se obter uma pré-miARN de um gancho de cabelo ~ 60 nt com um 2-NT 3 ‘overhang [13], [14]. Após a pré-miARN é exportada para o citoplasma por exportina 5 [15], [16], que é então reconhecida por Dicer, em complexo com a proteína dsRBD contendo parceiro VIH-1 ARN de TAR de ligação (TRBP) [17], para remover o terminal de circuito, deixando uma segunda saliência 2-NT 3 ‘[18]. Os 21- e 23-nt produtos miRNA resultantes contêm excesso de um 2-nt 3 ‘em cada vertente e agir como intermediários funcionais de RNAi que a clivagem do mRNA direta e translacional atenuação. Embora as suas funções biológicas permanecem em grande parte desconhecida, estudos recentes sugerem que miARNs contribuir para o desenvolvimento de vários cancros [19] e a função força como um componente importante da defesa natural das células contra a infecção virai [20] – [22]. Tem sido proposto que um perfil de expressão de miARN único para um cancro particular, seria um biomarcador útil para o diagnóstico do cancro [23] e prognóstico [24]. Neste estudo, utilizou-se várias abordagens para o perfil de expressão de miARN a partir de tecidos de cancro do colo do útero e as linhas celulares derivadas de cancro cervical, bem como a partir de queratinócitos vaginais infectado com o HPV. Nós demonstramos que um subconjunto de miRNAs é significativamente desregulada em cancros do colo do útero e lesões pré-neoplásicas.

Resultados

miRNA perfil de expressão em linhas celulares de cancro do colo do útero

Para investigar a expressão perfis de miARNs em células de cancro do colo do útero, que isolado ARN celular total a partir de células CaSki C-2 derivadas de cancro cervical, que contêm -500 cópias do genoma de HPV16 por célula. Os RNAs fraccionados com tamanhos de 15-30 nt foram clonados e sequenciados com base num protocolo publicada [25]. No geral, nós clonado um total de 174 miARNs de 363 clones de ADNc, que foram classificados em 46 espécies de miARN diferentes (Tabela 1), com miR-21, o miR-24, o miR-27a, e miR-205 sendo mais abundante. N-HPV16 derivado miARN foi clonado neste rastreio, todos os miARNs foram celular. Curiosamente, verificou-se que algumas cópias da clonado miR-21 e miR-205 teve heterogénea extremidades 3 ‘, com um nucleótido extra de C na extremidade 3’ de 68% dos miR-21 cópias e um L extra na extremidade 3 ‘ final de 33% das cópias de miR-205, presumivelmente derivados a partir da digestão de oscilação do pré-miARNs por Dicer (Fig. 1). Além disso, uma nova subespécie de miR-193, miR-193C (número de acesso do GenBank: EF100863), foi identificado três vezes a partir do rastreio e foi verificada por transferência de Northern. As subespécies de miR-193C difere de miR-193b por um nucleótido na posição nt 21 e pela falta de três nós no ‘final (miR-193b, 5′-aacuggcccucaaagucccgcuuu-3′ a 3; miR-193C, 5’-aacuggcccucaaagucccga -3 ‘). O perfil do miR-193C recentemente identificada que é 3-NT menor do que o miR-193b expressão foi semelhante ao de miR-21 em células HeLa e células 293, mas menos abundante do que o miR-27a. HeLa e células 293 não detectável produzido miR-205 como um dupleto, como visto em células CaSki (Fig. 2A).

setas acima da pré-miARN indicam locais de digestão de oscilação sobre a pré-miR-21 numa e pré-miR-205 em B, produzindo produtos com nucleótidos adicionais na extremidade 3 ‘. As sequências mostradas em vermelho correspondem a amadurecer miARN enquanto que mostrado em preto é a porção de pré-miARN que é removida durante o processamento.

. expressão de miR-193C em CaSki, HeLa, e células 293. CaSki e os seus subclones células C-2 C-V e [72] foram comparadas com células HeLa (HPV 18

+) e células 293 (HPV

-) para a expressão de miR-193C por Northern blotting. O ARN total (30 ug) de CaSki, HeLa, e células 293 foi separado num gel desnaturante de poliacrilamida a 15%, transferidas para uma membrana Gene Screen-Plus e depois sondado separadamente com um sentido (s) ou um anti-sentido (AS) miR sonda -193c. Subsequentemente, a membrana foi sondado com sondas anti-sentido para miR-21, o miR-27a, o miR-205, ou U6, respectivamente. B. miARN expressão em linhas celulares derivadas de cancro cervical. ARN celular total (30 ug) foi extraído a partir de várias linhas de células com ou sem infecção pelo HPV. Northern blotting foi utilizado para examinar a expressão de 10 miARNs de linhas celulares de cancro, oito W12 dois subclones celulares, células HaCaT, colo normal e tecidos de cancro do colo do útero (Ambion). C. regulação negativa do miR-143 em tecidos de câncer do colo do útero. Os ARNs totais de dois pares de (NT) cérvix vs normal do cancro do colo do útero tecidos (Ca) a partir de amostras clínicas e um par de cérvix normal e cancro do colo do útero comprado de Ambion foram comparados quanto à expressão de miR-143 por Northern blotting. U6 também foi apagado como um controlo interno para o carregamento da amostra no painel A, B, e C.

Com base nestes resultados de clonagem, nós analisamos ainda várias linhas celulares de cancro do colo do útero disponíveis com ou sem infecção por HPV por transferência Northern para a expressão de 8 miARNs com uma frequência relativamente elevada de clonagem e 2 miARNs (miR-143 e miR-145) que não foram isolados no nosso clonagem (Tabela 1). Oito linhas celulares de cancro do colo do útero; dois isolados da linha de células W12 (20861 com genomas HPV16 integradas e 20863 com genomas episs�ica HPV16) originalmente isolado de uma neoplasia cervical intra-epitelial (NIC) tecidos de biópsia [26] e as células HaCaT (uma linha de queratinócitos da pele HPV-negativo imortalizado) [27 ] foram examinados para a expressão das 10 miARNs. A emparelhados RNAs totais por câncer de colo do útero e tecidos cervicais normais adjacentes comercialmente obtidos a partir Ambion, também foram comparados. Todas as linhas de células e tecidos de cancro cervical mostrou um perfil semelhante expressão miRNA. Este perfil de miARN diferiam dos tecidos cervicais normais com expressão reduzida de miR-27a, o miR-143 e miR-145 (Fig. 2B). Em contraste, o tecido de cancro do colo do útero e as linhas de células, excepto SiHa (HPV 16

+), HeLa (HPV 18

+), e células C33A (HPV

-), havia um aumento da expressão de miR-205 quando em comparação com o tecido cervical normal (Fig. 2B). SiHa, HeLa, e células C33A não têm expressão de miR-205. Em todas as linhas de células, a expressão do miR-143 e -145 era menos do que o que foi observado no tecido de cancro do colo do útero. Apesar da presença de algumas diferenças na expressão de miARN indivíduo de uma linha celular para outra, não fomos capazes de especificar um perfil desses miARN detectados são expressão em correlação com a presença de genomas de HPV integrado ou epissomais. A infra-regulação de miR-143, o qual é derivado a partir do mesmo precursor de miARN de miR-145 [28], foi ainda confirmada como sendo específico para o cancro, comparando a sua expressão em tecidos de cancro do colo do útero para cérvix normal (Fig. 2C).

perfil de expressão de miARN em tecidos cervicais normais e cancerosos

Desde a nossa abordagem de clonagem tem uma limitação no isolamento de baixa miARNs abundantes e Northern blotting é limitada pela sonda escolhida, os dois métodos podem não ser a melhor distinguir uma diferença de uma linha celular para outra nos miARN perfil de expressão. Para investigar se os miRNAs são diferencialmente expressos em tecidos de cancro cervical, foram coletadas cinco pares de tecidos normais e cancerosos cervicais pareados por idade e compararam seus perfis de expressão usando uma matriz de análise miRNA contendo 455 miRNAs. Apenas quatro pares de amostras qualificado para a análise de agrupamento final determinado pela análise de consistência amostra. Uma análise da expressão abundância, com base numa densidade do sinal ≥20,000, mostraram que ambos os tecidos cervicais normais e cancerosos apresentam expressão abundante de miR-23a, 23b-miR, let-7a, deixou-7c, 7d e deixou-, enquanto que uma expressão elevada de miR-26a, miR-29a, miR-99a, miR-100, miR-125b, miR-143, miR-145, miR195 e miR-199 só foi observada em tecidos cervicais normais e alta expressão de miR-16, miR-21, o miR-205, e deixa-7f foi observada apenas em tecidos de cancro do colo do útero, apesar de que os níveis relativamente baixos de miR-16 e miR-21 foram observados a partir de uma população de células homogéneas em algumas linhas celulares (Fig. 2B). Expressão de miR-143 e miR-145 mostraram uma redução superior a 2,7 vezes nos tecidos de cancro do colo do útero. Usando uma análise de agrupamento, observou-se um aumento da expressão significativa de 18 miRNAs no cancro do colo do útero e 15 miRNAs no colo normal (P 0,05, t-teste) (Figura 3A, miRNAs na cor vermelha.). Para verificação, um conjunto de sondas de miRNA selecionados foram usadas para realizar uma análise de transferência de Northern para dois duas amostras de câncer normal e. Fomos capazes de confirmar que os tecidos de câncer tinham reduzido expressão de miR-126 e miR-424, e aumento da expressão de miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155 e miR-223 (Fig 3B. E 3C), após o nível de miARN individual em cada amostra foi quantificado e normalizado para expressão U6.

O RNA total (5 ug) isolado a partir de tecidos normais da mesma idade do colo do útero (NT) e tecidos de cancro do colo do útero (Ca) foram analisados por análise de matriz de miARN. O tecido de cancro 1, 3, e 5 foram infectadas com HPV 16 e o ​​tecido de cancro 4 foi infectado com HPV45. A. Um gráfico agrupamento foi criada usando um método hierárquico daqueles miARNs com a densidade do sinal em mais do que 1000 e mostra um aumento (vermelho) ou diminuída (verde) expressão (P 0,05) de miARN indivíduo de 4 cervical normal e canceroso pareados por idade tecidos (Tabela S1). O cabeçalho da coluna indica o código das amostras individuais no ensaio. Cada linha mostra o padrão de expressão de miRNA individuais como uma relação de expressão transformou-log2, com a expressão mais intimamente relacionado acompanhado por um ramo e agrupados por um algoritmo médio-linked. comprimentos dos ramos refletir graus de semelhança entre os padrões de expressão de miRNA. escala de cor na parte superior do painel representa o grau de expressão com base numa relação calibrado. O verde indica uma menor expressão em comparação com a média (zero), indica preto expressão igual à média, e vermelho indica maior expressão em comparação com a média. B. Verificação de miARN perfil de expressão por Northern blotting. ARN celular total (30 ng) isolado a partir de cada tecido foi sondado com oligo anti-sentido para cada indivíduo miARN indicado. Uma banda adicional em cada blot indica um produto oscilação de Dicer digestão. gráficos C. Bar mostrar os níveis relativos de os miRNAs examinados normalizados para U6 ARN em cada tecido no painel B.

miRNA perfil de expressão em tecidos jangada derivadas de queratinócitos infectados com o HPV

para investigar se as assinaturas de miRNA observados em tecidos de câncer do colo do útero são específicos para o cancro do colo do útero, examinamos a expressão miRNA em lesões pré-neoplásicas. A falta de culturas celulares convencionais para multiplicação HPV tem seriamente limitados a nossa compreensão do ciclo de vida do HPV e patogénese. No entanto, os HPVs infecciosas foram produzidas com sucesso a partir de culturas de jangada derivadas de queratinócitos humanos [29], [30] e a indução de lesões pré-neoplásicas em tecidos jangada por infecção pelo HPV com a morfologia semelhante à de neoplasia intra-epitelial cervical [31] torna este sistema de grande vantagem para os nossos estudos. Usando análises matriz miARN, compararam-se os perfis de expressão de 455 miARNs humanos em queratinócitos humanos primários infectados com HPV18 (HVKs vaginais) em culturas de monocamada e em tecidos jangada estratificados e diferenciados. Uma análise da expressão abundância, com base numa densidade do sinal ≥20,000, mostrou que o miR-21, o miR-23a, 23b-miR, miR-26a, o miR-205, deixe-7c, e deixar-7F abundantemente expressa em HVKs tanto em monocamada culturas e culturas jangada. Três miRNAs abundantemente expressas apenas em culturas em monocamada (miR-24, miR-29a e miR-221) e 11 miRNAs abundantemente expressa apenas nas culturas de jangada estratificados e diferenciados (miR-27a, miR-27b, miR-200b, miR- 200c, miR-203, miR-638, deixe-7a, deixe-7b, deixe-7d, deixe-7e, e 7g deixá-). Utilizando uma análise de agrupamento, que ainda determinado que 16 miARNs foram regulados positivamente (fig. 4A, balsa em vermelho) e 25 miARNs foram regulados negativamente (Fig. 4A, balsa em verde) em culturas de jangada quando em comparação com os níveis de expressão na monocamada correspondentes culturas (P 0,05, teste t). Para confirmar as observações, as amostras emparelhadas foram analisadas quanto à expressão de miARN por Northern blotting utilizando um conjunto de sondas específicas de miARN (Fig. 4B e 4C). A quantificação de cada nível de miARN em cada amostra foi normalizada para expressão U6. Confirmou-se que a expressão de miR-26b, o miR-195 e miR-200c foi aumentada nas culturas jangada, mas a expressão do miR-143 e miR-145 foi reduzida (Fig. 4B e 4C). O aumento da abundância de miR-200c que mostra 67% mais do que a expressão em jangadas em monocamadas (P 0,08) por análise de matriz foi verificada por transferência de Northern. Embora a regulação positiva de miR-15a e miR-223 e a regulação negativa do miR-218 e miR-424 foram observadas tanto nas jangadas (lesões pré-neoplásicas) e em tecidos de cancro do colo do útero, a maioria das assinaturas de expressão de miARN não mostrou correlação entre a dois tecidos (comparar Fig. 4A a Fig. 3A). No entanto, a regulação negativa de miR-146a foi observado nas culturas de jangada, em vez de a regulação positiva visto em tecidos de cancro do colo do útero e foi ainda confirmada por Northern blotting (Fig. 5), o que indica que a sobre-regulação da expressão de miR-146a é específico de cancro do colo do útero. Em contraste, foi observado um ligeiro aumento da expressão de miR-21 e miR-26b em ambas as lesões pré-neoplásicas (jangadas infectadas pelo HPV) e tecidos de cancro do colo do útero e assim, a sua expressão não aparece específico do cancro (Fig. 5).

tecidos Raft (culturas) com infecção HPV18 foram derivadas de queratinócitos humanos vaginais (HVKs) em culturas em monocamada com transfecção de ADN HPV18. ARN total de células (5 ug cada) extraído de cada tipo de células foi comparado em paralelo para expressão de miARN usando análises matriz miARN. A. Um gráfico agrupamento foi criado por um método hierárquico daqueles miARNs com uma densidade de sinal em mais de 1000 obtido a partir de três transfecções independentes em cada grupo (Tabela S2). O gráfico mostra diminuiu (verde) ou aumento (vermelho) expressão (p 0,05) dos miRNAs individuais a partir HVKs indiferenciadas em monocamadas (mono) versus HVKs estratificados e diferenciados em jangadas. Ver outros detalhes na Fig. 3A. B. Verificação de expressão miRNA de HVKs indiferenciadas em monocamadas e HVKs estratificados e diferenciados em jangadas por transferência Northern. ARN celular total (30 ug cada) isoladas de HVKs diferenciadas ou indiferenciadas foi sondado com sondas miRNA selecionados. gráficos C. Bar mostrar os níveis relativos de os miRNAs examinados normalizados para U6 RNA em cada amostra no painel B. M = cultura em monocamada, R = jangada.

A. Os ARNs totais de HVKs em duas jangadas e duas culturas em monocamada (mono) foram comparados com dois cancro do colo do útero (CA) para tecidos da expressão do miR-146a, por Northern blotting. Os níveis de miR-21 e miR-26b de expressão foram examinados como controle de miARN. Pequeno U6 ARN nuclear também foi apagado como um controlo interno para o carregamento da amostra. gráficos B. Bar mostrar os níveis relativos de os miRNAs examinados normalizados para U6 RNA em cada amostra no painel A. M = cultura em monocamada, R = jangada.

Redução de miR-143 e miR-145 em lesões cervicais e o cancro cervical são supressiva no crescimento de células do cancro do colo do útero

Tendo demonstrado uma regulação negativa significativa de miR-143 e miR-145 no cancro do colo do útero e as lesões pré-neoplásicas, nós investigamos se esta regulação negativa é importante no desenvolvimento de câncer cervical. Para resolver esta questão, sintético miR-143 e miR-145 precursores foram transientemente transfectados em células HeLa e o efeito de sobre-expressão das suas miARNs maduros sobre o crescimento de células HeLa foi avaliada por contagem de células. Como mostrado na Fig. 6, tanto o miR-143 e miR-145 foram encontrados supressiva (p 0,005 para miR-143 e P 0,008 do miR-145,

t

-test) para o crescimento de células HeLa. Este efeito supressor sobre o crescimento das células não foi uma resposta de células imediata; Pelo contrário, foram necessárias duas transfecções celulares consecutivos com cada miARN com um intervalo de 48 horas. Os dados sugerem que tanto miR-143 e miR-145 provavelmente terá que ser regulada negativamente nas células do colo do útero para a progressão do tumor.

A. miR-143 e miR-145 são supressiva para o crescimento de células HeLa. As setas indicam os pontos de tempo quando as células receberam um miARN (30 nM) transfecção específica. As células viáveis ​​em cada grupo foram contadas nos pontos de tempo indicados. Os dados representam a média ± DP de duas experiências, cada uma realizada em triplicado. B. Níveis relativos de miR-143 e miR-145 em células HeLa em 96 horas após a primeira transfecção transiente. ARN celular total extraído foi examinado por ensaio de ligação miARN. Um nível de ARNt em cada amostra foi utilizada como um controlo de carga.

Aumento miR-146a no cancro do colo do útero promove a proliferação de células

Considerando-se um aumento de 6 vezes da expressão de miR-146a em tecidos de cancro do colo do útero, a hipótese de que um elevado nível de miR-146a pode desempenhar um papel no crescimento celular do cancro do colo do útero. A nossa abordagem inicial usando inibidores anti-miR-146a ou usando um oligo-morphonino para bloquear o miR-146a maturação para derrubar expressão de miR-146a em linhas celulares de cancro do colo do útero não conseguiu induzir um efeito fenotípico (dados não mostrados). Para nossa surpresa, descobrimos que todas as linhas celulares de cancro do colo do útero examinados não expressou nenhuma detectável miR-146a (Fig. 7A). Subsequentemente, o miR-146a foi introduzido por transfecção transitória em células HeLa, uma HPV18

+ linha celular de cancro do colo do útero e as células HCT116, uma linha celular de cancro colorectal (Fig. 7B). Uma proliferação lenta, mas significativamente aumentada de células HeLa de ambos (p 0,009,

t

-test) e HCT116 (P 0,019,

t

) -test células foi observada na presença de exógeno miR-146a. Pelo cálculo das contagens de células de cada grupo, foi demonstrado que ambas as células HeLa e as células HCT-116 contendo o miR-146a teve um tempo de duplicação de 2-3 horas mais rápido do que o das células com miR-controlos (Fig. 7C e 7D). Estes dados sugerem que as funções de miR-146a como um fator de crescimento em câncer cervical.

A. Nenhuma expressão de miR-146a em linhas celulares derivadas de cancro cervical e de uma linha de queratinócitos derivadas da pele humana, as células HaCaT. ARN celular total foi extraído de linha celular individual e examinados para miR-146a e miR-21 de expressão por Northern blotting. U6 em cada amostra serviu como controlo de carregamento de amostra. B. nível relativo de miR-146a em células HeLa e HCT116 às 96 horas após a primeira transfecção. ARN celular total extraído de cada grupo foi examinado por Northern blotting. C e D. miR-146a, promove a proliferação celular. As setas indicam os pontos de tempo quando as células receberam transfecção com miR-146a ou o miR-controlo (30 nM). As células viáveis ​​em cada grupo foram contadas nos pontos de tempo indicados. Os dados representam a média ± DP de duas experiências, cada uma realizada em triplicado.

Discussão

Neste estudo, demonstramos perfis de expressão de miRNA no cancro do colo do útero e HPV pré induzida por infecção lesões neoplásicas em tecidos jangada. Embora ambos os tecidos de cancro e tecidos jangada infectadas pelo HPV cervical com lesões pré-neoplásicas mostraram uma regulação positiva de miR-15a e miR-223 e regulação negativa de miR-143, o miR-145, o miR-218 e miR-424, a maioria dos a expressão de miARN mostrou nenhuma correlação entre os dois tecidos e pode delinear a progressão da doença. No entanto, um elevado nível de expressão de miR-146a foi encontrado para ser específico para o cancro do colo do útero, desde a sua expressão foi regulada para baixo tanto em tecidos normais e em tecidos jangada infectadas pelo HPV com lesões pré-neoplásicas.

Encontrar de regulação negativa de miR-143 e miR-145 e a regulação positiva de miR-146a no cancro do colo do útero foi em particular atraente por duas razões: (1) o miR-143 e miR-145 são expressas a partir do mesmo precursor de miARN [28] e são regulados negativamente igualmente em lesões pré-neoplásicas induzidas pelo HPV, em nosso caso, em tecidos jangada infectadas pelo HPV, sugerindo que a sua redução ocorrer em um passo inicial antes do desenvolvimento do câncer. Regulação negativa de miR-143 e miR-145 foi encontrada em vários outros tipos de cancro, incluindo o cancro colorrectal [32], linfoma de células B [33], e, recentemente, no cancro do colo do útero [34], [35]. Assim, a nossa descoberta é importante para a compreensão dos mecanismos pelos quais o miR-143 e miR-145 estão envolvidos na carcinogénese. A inibição por miR-143 e miR-145 de crescimento de células HeLa implica que o miR-143 e miR-145 provavelmente terá que ser regulada negativamente para que o crescimento do cancro. (2) A sobre-regulação de miR-146a em tecidos de cancro do colo do útero, mas não em lesões pré-neoplásicas induzidas por HPV ou em linhas celulares de cancro derivadas de indica que o miR-146 de expressão é específica do cancro do colo do útero,. Vários estudos mostram que o miR-146a é um gene de NF-kappaB-dependente [36] – [38]. Expressão de miR-146a parece variar em diferentes tecidos de cancro em que foi observado um aumento do nível de miR-146a em linhas de linfoma de Burkitt com EBV-LMP1 (latent membrane protein 1) expressão [37], [38], mas uma diminuição nível no câncer de próstata hormônio-refratário [39] e carcinoma de tireóide papilar [40]. No cancro do colo do útero, upregulation de expressão miR146a parece alheio a qualquer da expressão do gene HPV desde a sua expressão foi ainda reduzida em tecidos jangada produtiva HPV-infectados. Curiosamente, todas as linhas celulares de cancro do colo do útero e uma linha de queratinócitos da pele examinados não contém detectável miR-146a, sugerindo que o miR-146a em tecidos de cancro do colo do útero é regulada por um factor ausente numa população de células homogéneas ou é expressa por um outro tipo de células no cancro tecidos. Assim, concluímos que a sobre-regulação da expressão de miR-146a no cancro do colo do útero é benéfico para o crescimento do cancro, como a introdução de miR-146a em células cancerosas aumento do tempo de duplicação celular e promover a proliferação celular.

Aproximadamente 800 miARNs humanos têm sido previsto . Destes, mais do que 450 (https://microrna.sanger.ac.uk/sequences, 2006) agora foram identificados no ser humano [41], [42] [43], [44], e as suas funções estão a começar para ser elucidado [45]. Neste estudo, nós clonado e identificou 174 miRNAs que foram agrupados em 46 espécies de miRNA diferentes. Uma nova subespécie de miR-193, miR-193C, também foi clonado e identificado a partir de nosso miARN rastreio da biblioteca. Rastreio de 10 linhas celulares derivadas de cancro da cervical ou CIN tecidos para a expressão de 10 miARNs sugeriu que a presença ou ausência de genomas de HPV integrado ou epissomais não tem efeito sobre a expressão de miARN analisados. Além disso, não fomos capazes de identificar um único miRNA derivados de HPV16 de HPV16

+ CaSki células por esta abordagem, embora outros vírus de DNA nuclear fazer miRNAs codificam [46], incluindo EBV [47]; KSHV [48] – [50]; HSV-1 [51], [52]; e SV40 [53]. A clonagem negativo para miARNs derivados de HPV16 sugere que o genoma de HPV16 em células CaSki integrado não parece expressar miARNs virais. Outro estudo que utilizou HPV31 diferenciada

LKP1 células contendo + -50 cópias de um genoma de HPV31 epissomal por célula também não conseguiu identificar miARNs derivados de vírus [54].

relatórios recentes sugeriram que miARNs contribuir para uma variedade de funções das células [41] e estão envolvidos no desenvolvimento de cancros humanos [19]. Por exemplo, o miR-32 controla a resistência das células a uma infecção retroviral [55]. Um conjunto de seis miARNs no cromossoma humano 13 é regulado por c-Myc, e o miR-17-5p c-Myc-regulada e miR-20a modular negativamente a expressão de E2F1, um factor de transcrição [56]. miARNs foram também recentemente caracterizada como potenciais oncogenes que promovem o desenvolvimento de linfoma de células B humanas (miR-17-92 cluster) [57] e a proliferação e a tumorigénese de células humanas primárias (miR-372 e miR-373) por neutralização inibição de CDK mediada por p53 [58]. Outro estudo sugere que a sobre-expressão de miR-17-5p, miR-20a, miR-21, o miR-92, o miR-106a, e miR-155 pode ser considerada uma assinatura de miARN de cancro sólido [59]. Neste relatório, 18 miRNAs foram regulada e 15 miRNAs foram reprimidos em tecidos de cancro cervical. O aumento da expressão de miR-15b, o miR-16, o miR-146a, o miR-155 e miR-223 que foi observado em tecidos de cancro do colo do útero, também tem sido implicado no desenvolvimento de outros cancros humanos: o miR-15 e miR-16 regular a apoptose por segmentação BCL2 [60] e a sua mutação tem sido associada com a leucemia linfocítica crónica [61]; miR-16 também está envolvida no controle de instabilidade de ARN de citocinas [62]; níveis de miR-146B altamente aumentada em carcinoma papilífero da tireóide [40]; miR-155 foi recentemente implicada no desenvolvimento de linfoma linfoblástico leucemia /de alto grau de [63] e o cancro do pulmão [24] e na regulação da angiotensina II fibroblasto humano tipo 1 expressão do receptor [64]; miR-223, juntamente com os factores de transcrição C /EBPa e IFN-A, participa na regulação da diferenciação granulocítica por suprimir a transcrição de ARNm de IFN-A [65].

Embora miARNs maduros derivados de seus transcritos primários através Drosha e Dicer digestão em duas reações de corte separadas contêm excesso de um 2-nt 3 ‘em cada mecha, Dicer digestão do pré-miRNA não é sempre executada com precisão. Isto reflectiu-se no miR-21 e miR-205 isolado neste estudo. Verificou-se que mais de 68% do miR-21 isolado a partir de células CaSki tinha uma C adicional na extremidade 3 ‘e 33% do miR-205 isolado continha um L extra na extremidade 3’, mas não de nucleótidos extra foi sempre identificada a partir das extremidades 5 ‘de ambos os miARN. Quando comparado com a sequência pré-miARN correspondente, o adicional de C no miR-21 e U na miR-205 foram encontrados para ser derivada directamente a partir do nucleótido 3 ‘do sítio de clivagem, sugerindo que Dicer digestão tem um mecanismo de oscilação . Esta observação por clonagem pequeno ARN pode ser adicionalmente verificada como faixas duplas para miR-21 (Fig. 5A e a Fig. 7A) e para miR-205 (Fig. 2A e 2B) em análises de Northern blot. Os nossos resultados são consistentes com outros relatórios obtidos a partir de análises bioquímicas que Dicer utiliza uma regra de contagem extremidade 3 ‘e mede uma distância de ± 22 nt do 3’-terminal para clivar ambas as vertentes de RNA, com turnos de 1 a 2 nt em a posição de clivagem preferido [18], [66].

Materiais e Métodos

células, tecidos e culturas de jangada

Oito linhas celulares de cancro do colo do útero foram utilizados para os ensaios : HPV16

+ CaSki e SiHa, HPV18

+ HeLa e C4II, HPV68

+ ME180 [67], e HPV31

+ CIN612 6E e 9E células. Dois HPV16

+ W12 subclones (20861 e 20863), originalmente isoladas a partir de uma lesão histológica cervical de baixo grau diagnosticado como CIN I [26] também foram usados ​​para comparação. Entre estas linhas de células, 20863 e 9E células contêm uma forma epissomal do genoma de HPV, e 20861 e 6E células têm um genoma de HPV integrado [68], [69].