Abstract

Fundo

A evidência recente de

in vitro Comprar e

in vivo

estudos tem demonstrado que a reativação aberrante de sonic Hedgehog (SHH) via de sinalização regula os genes que promovem a proliferação celular em várias células-tronco cancerosas humanas (CSCs). Portanto, os agentes quimioterapêuticos que inibem a ativação de fatores de transcrição Gli surgiram novos medicamentos terapêuticos promissores para o câncer de pâncreas. GDC-0449 (Vismodegib), molécula administrável por via oral que pertence à classe 2-arylpyridine, inibe a via de sinalização de SHH, bloqueando a actividade de Smoothened. Os objetivos deste estudo foram analisar os mecanismos moleculares pelos quais GDC-0449 regula características CSC pancreáticos humanos

in vitro

.

Metodologia /Principais Achados

GDC-0499 inibiu a viabilidade celular e a apoptose induzida em três linhas de células de cancro do pâncreas e CSCs pancreáticas. Este inibidor também suprimiu a viabilidade celular, a ligação Gli-DNA e actividades de transcrição, e induziu a apoptose através da activação de caspase-3 e PARP de clivagem em CSCs pancreáticas. apoptose em CSCs GDC-induzida-0449 mostraram um aumento da expressão de Fas e diminuição da expressão de PDGFRα. Além disso, a Bcl-2 foi regulada para baixo enquanto que TRAIL-R1 /DR4 e expressão de TRAIL-R2 /DR5 foi aumentada após o tratamento de CSCs com GDC-0449. Supressão de ambos Gli1 mais Gli2 por shRNA imitou as mudanças na viabilidade celular, a formação esferóide, apoptose e expressão gênica observado em CSCs pancreáticas tratados com GDC-0449. Assim, os genes Gli ativados reprimir expressões DRs e Fas, up-regular as expressões de Bcl-2 e PDGFRα e facilitar a sobrevivência da célula.

Conclusões /Significado

Estes dados sugerem que GDC-0499 pode ser utilizados para a gestão do câncer de pâncreas, visando CSCs pancreáticas

Citation:. Singh BN, Fu J, Srivastava RK, Shankar S (2011) Hedgehog sinalização Antagonista GDC-0449 (Vismodegib) inibe o cancro do pâncreas Stem características celulares : Mecanismos moleculares. PLoS ONE 6 (11): e27306. doi: 10.1371 /journal.pone.0027306

editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de setembro de 2011; Aceito: 13 de outubro de 2011; Publicação: 08 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Singh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas (PC) é um tumor maligno altamente letal. caracterizada por diagnóstico tardio e resistência ao tratamento. PC é a quarta principal causa de câncer nos Estados Unidos com uma sobrevida de 5 anos menos de 5%. A ressecção cirúrgica é a opção terapêutica apenas potencialmente curativa para PC; No entanto, devido à falta de sintomas precoces, a grande maioria dos pacientes apresentam doença metastática, tornando a sua malignidade inoperável [1], [2]. O atual terapia padrão de atendimento, gemcitabina, estende-se a sobrevida do paciente por apenas algumas semanas [3]. A identificação de novos alvos moleculares para o PC para superar o mau prognóstico é, portanto, necessário. alterações genéticas recorrentes em genes definidos em associação com perturbações das vias de sinalização celular de desenvolvimento têm sido associados com o desenvolvimento e progressão de PC. Recentes evidências de

in vitro Comprar e

In vivo

estudos sugere que a do Sonic Hedgehog (SHH) via [4] é aberrante reativado e reconhecido como um dos mediadores na maioria dos PCs de sinalização; por conseguinte, o bloqueio SHH tem o potencial para prevenir a progressão da doença e disseminação metastática [5].

sinalização SHH é iniciada pela ligação de curto-agindo polipéptido ligando ou seja Shh (sonic hedgehog, Indiana hedgehog ou Desert Hedgehog) para seu receptor, que Patched assim, diminui os efeitos inibidores de patched no Smoothened [6]. Smoothened é então traduzido para o cílio primária da célula, uma organela que joga um papel crucial na sinalização SHH [7]. Há, Smoothened ativa uma cascata intracelular que resulta na activação e na translocação nuclear do factor de transcrição da família Gli Gli2 [8]. Gli2 transloca-se para o núcleo e induz a transcrição de genes alvo, tais como SHH Gli1, um marcador fiável de SHH de sinalização [8], [9]. Gli2 é um componente crítico da sinalização de SHH e a sua inactivação conduz a uma inibição da sinalização do SHH. Estes factores de transcrição Gli ligar genes no núcleo que promovem a proliferação celular, sobrevivência celular, stemness, e determinação do destino da célula em uma variedade de órgãos [5], [10]. via SHH é uma morphogen necessário para a formação padrão adequado durante a embriogênese; no entanto, a desregulamentação desta via é responsável por vários cancros humanos [8], [10], [11]. Evidências recentes indicam que SHH via de sinalização ao nível dos genes Gli tem um papel crítico no desenvolvimento de pâncreas normal e não há evidências de que desregulado de sinalização SHH desempenha algum papel no câncer de pâncreas [12]. Além disso, vários relatórios indicam que os cancros pancreáticos humanos mais genes Gli expresso [13], [14].

Os fatores de transcrição da família Gli tem dupla função, como ativador e repressor que são definidos apenas parcialmente e pode responder a atividade Gli combinatória e cooperativo. A família Gli desempenha um papel crítico na mediação e interpretação de sinais SHH [15]. cancros SHH-driven surgir a partir de uma variedade de mutações que afectam diferentes componentes, incluindo as principais proteínas Gli efectoras transcricional, leva a uma variedade de doenças malignas humanas, incluindo meduloblastoma, rabdomiossarcoma, melanoma, carcinoma de células basais, e da mama, pulmão, fígado, estômago, próstata, cancros pancreáticos e [16], [17], [18], [19], [20]. Constitutivamente, a sinalização SHH-Gli é ativo em basocelulares carcinomas, meduloblastomas e câncer de esôfago, devido a uma mutação no patch ou Smoothened [21], [22]. Melanomas e carcinomas da próstata demonstraram ainda um eixo de SHH-Gli sinalização [23]. Nos cancros gastrointestinais, ativação sinalização SHH ocorre por meio de regulação da transcrição-se do ligando SHH [24]. Foi recentemente sugerido que a sinalização de SHH progride durante a carcinogénese do cólon [25], [26] e na doença metastática [27] enquanto que em tecido de cólon normal, a sinalização SHH está envolvida na diferenciação [28]. Recentemente, os genes foram perfilado que são regulados a jusante de Gli1 Gli2 e que estão envolvidos na proliferação de células e ciclo celular [29], [30], e a sobrevivência das células (PDGFRα e Bcl-2) [22]. Gli2 também é expressa em muitos carcinomas de células basais [31], sugerindo que estes genes também pode estar envolvido no desenvolvimento de PC, que poderia ser consistente com a sua acção parcial como mediador de sinais de SHH [32]. No entanto, o papel dos genes Gli (GLI1 e Gli2) em respostas de sobrevivência e morte celular celulares impulsionado-SHH permanecem mal definido, e, especificamente, o seu papel na proliferação celular e sobrevivência das CSCs pancreática é desconhecido e os genes alvo a jusante envolvidos na determinação do destino celular.

Muita atenção tem sido recentemente focada no papel das células-tronco cancerosas (CSCs) /câncer iniciando células (CICs) na iniciação e progressão de tumores sólidos. CSCs pode ser responsável pelo aparecimento de tumor, auto-renovação /manutenção, a acumulação de mutação, e metástase devido à sua capacidade para expressar proteínas resistentes anti-apoptóticas e de drogas, mantendo assim o crescimento do tumor [33], [34]. A via de sinalização de SHH é um regulador chave de processos celulares fisiológicos que incluem a proliferação, a diferenciação e a apoptose [35]. Estudos recentes indicam que o sistema de sinalização de SHH desempenha um papel fundamental também na CSC biologia inclusive na regulação dos CSCs auto-renovação, diferenciação; e potencial tumorigénico, sugerindo sinalização de SHH poderia ser um alvo terapêutico promissor em PCs [14]. A activação de sinalização SHH pode anular a resistência de CSCs à quimioterapia e pode levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de PCs.

Para identificar alvos a jusante dos genes Gli que regulam a proliferação celular e sobrevivência no cancro pancreático células estaminais (CSCs), que empregue um inibidor de sinalização de SHH, GDC-0449 (inibidor da Smoothened), que foi identificado em uma tela de pequena molécula à base de células para os inibidores de Gli transcrição mediada por uma família [36]. GDC-0449 actua como um potente inibidor da Smoothened e mostra um elevado grau de selectividade para SHH-Gli sinalização [36]. Em CSCs pancreáticos humanos, mostrou que a inibição da via de sinalização de SHH, visando os factores de transcrição Gli. GDC-0449 induziu a morte celular significativa em três linhas de células de cancro pancreático (ASPC-1, PANC-1 e MIA PaCa-2) e CSCs pancreáticas. Em análises mais detalhadas dos CSCs pancreáticas, GDC-0449 diminuiu componentes de sinalização SHH (Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, SHH e Smoothened) expressão, ligação Gli-DNA e atividades repórter Gli-luciferase. Além disso, knockdown de ambas as expressões GLI1 e Gli2 usando shRNA conferiu resistência a citotoxicidade induzida por GDC-0499. Além disso, GDC-0449 diminuiu a expressão de PDGFRα concomitante com níveis elevados de Fas, aumentou a expressão de TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R2 /DR5, diminuição da expressão de Bcl-2, e induziu a actividade da caspase-3 e PARP de clivagem. alterações induzidas por GDC-0449 na expressão dos genes e apoptose foram bloqueadas por Gli1 mais Gli2 shRNA, sugerindo assim um papel de Gli para a proliferação celular e sobrevivência no CSCs pancreáticos humanos. Estes dados sugerem que GDC-0449 suprime a proliferação de pâncreas CSCs e sobrevivência por inibição da via de sinalização de SHH ao nível dos genes Gli.

Resultados

via SHH componentes de sinalização são expressos em linhas de células de cancro pancreático humano e CSCs pancreáticas

o primeiro medido pela expressão de vários componentes da via de SHH no cancro pancreático humano AsPC-1, PANC-1, e linhas de células MIA PaCa-2-CSCs e pancreáticas por RT-PCR (Fig. 1). Os dados demonstram que os componentes da via de sinalização de SHH, incluindo o ligando (Shh), as moléculas de sinalização (Patched-1, patched-2 e Smoothened) e efectores (Gli1, e Gli2) são expressos em linhas de células de cancro pancreático humano e pâncreas CSCs. Estes dados sugerem que SHH via está intacta em linhas celulares de cancro do pâncreas e CSCs, e suporta o conceito de que a ligação do ligando de Shh para o receptor de Patched diminui os seus efeitos inibitórios sobre a Smoothened, permitindo que a transdução do sinal que resultam na activação e a translocação nuclear de factores de transcrição da família Gli [13], [37].

células cancerosas do pâncreas (AsPC-1, PANC-1 e MIA PaCa-2) e CSCs pancreáticas foram cultivadas durante 48 h. O ARN total foi isolado e expressão de Shh, Patched-1, Patched-2, Smoothened, Gli-Gli-1 e 2 foi medida por qRT-PCR. HK-GAPD foi utilizado como controlo normalização endógena. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na ΔΔ

C t

método. A mudança de n-vezes na expressão de ARNm foi determinada de acordo com o método do 2

-ΔΔCT com GAPDH empregado como controlo endógeno.

GDC-0449 reduz a viabilidade celular e induz apoptose em pancreático humano linhas celulares de cancro e CSCs pancreáticas

estudos clínicos anteriores sugeriram que GDC-0449 é uma pequena molécula inibidora de Smoothened. Em primeiro lugar, procurou examinar os efeitos de GDC-0499 sobre a viabilidade celular e apoptose no painel de três linhas celulares de cancro pancreático humano e CSCs pancreáticas. A inibição da sobrevivência das células e indução de apoptose foi observada dentro de 24 h após a exposição a esta droga (dados não mostrados), mas foi notado no máximo às 72 horas (Figs. 2 e 3). Em todas as linhas celulares, GDC-0449 induziu a apoptose é uma forma dependente da dose, atingindo até 65%. Por comparação, GDC-0449 foi menos eficaz na indução de apoptose em CSCs (Fig. 3). Para outros estudos mecanicistas temos utilizado CSCs pancreáticas.

As células foram tratadas com GDC-0449 (0, 1, 5 e 10 uM), durante 48 e 72 h. No final do período de incubação, a viabilidade celular foi medida por ensaio de XTT em (A) AsPC-1, (B) MIA PaCa-2, (C) PANC-1, e (D) CSCs pancreáticas. Os dados representam SD ± média. @ # Ou significativamente diferente do controle (P 0,05)

As células foram tratadas com GDC-0449 (0, 1, 5 e 10 uM), durante 48 e 72 h.. No final do período de incubação, as células foram recolhidas e a apoptose foi medida. Os dados representam SD ± média. @ # Ou significativamente diferente do controle (P 0,05).

GDC-0449 regula alvos a jusante da via de SHH, inibe a interação Gli-ADN, a actividade de transcrição Gli e diminui a translocação nuclear de Gli em CSCs pancreáticas

próxima examinou o efeito de GDC-0449 sobre a expressão de Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP, Bcl-2, caspase-3, e PDGFRα pela análise western blot (Fig. 4). GDC-0449 induziu a expressão da FAS, DR4, DR5 e e inibiu a expressão de Bcl-2 e PDGFRα em CSCs pancreáticas. Além disso, GDC-0449 induziu a clivagem de caspase-3 e PARP em CSCs pancreáticas, correlacionando-se com o grau de sobrevivência celular e apoptose.

CSCs pancreático foram tratados com GDC-0449 (0, 1, 5 e 10 uM) durante 48 h. A expressão da FAS, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, a clivagem de PARP, Bcl-2, caspase-3 e por análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

próxima procurado para examinar os efeitos de GDC-0449 sobre a via SHH através da medição da expressão dos receptores de SHH (Patched-1, patched-2 e Smoothened ) e efectores (GLI1 e Gli2) por qRT-PCR (Fig. 5A). GDC-0449 inibiu a expressão de smoothened, Patched-1, e Patched-2. Da mesma forma, GDC-0449 inibiu a expressão do factor de transcrição e Gli1 Gli2. Estes dados sugerem que GDC-0449 pode regular características CSC por inibição vários componentes da via de SHH.

. (A), do pâncreas CSCs foram tratados com GDC-0449 (10 fiM) durante 36 h. No final do período de incubação, o ARN foi extraído e a expressão de Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, Smoothened e Shh foi medida por qRT-PCR. Os dados representam a média ± DP. @ Significativamente diferente do controle (P 0,05). (B), Pancreatic CSCs foram tratadas com e GDC-0449 (0, 1, 5 e 10 uM) durante 48 h. Os extractos nucleares foram preparados e a experiência foi realizada gelshift. Sonda única, controlo (sem GDC-0449), e GDC-0449 amostras tratadas (1, 5 e 10 uM, respectivamente). Os dados são representativos de três experiências. (C), a actividade da luciferase Gli-dependente é reduzida por GDC-0499. CSCs pancreáticos foram transduzidas com o construto lentiviral expressando a luciferase repórter Gli-dependente, e tratou-se com GDC-0449 (0, 5 e 10 uM) durante 48 h. Os lisados ​​foram preparados, e a actividade da luciferase foi medida. actividade de luciferase normalizada é apresentados como média ± DP. @ # Ou significativamente diferente do controle (P 0,05). (D), GDC-0449 inibe a expressão de Gli1 Gli2 e em CSCs pancreáticos humanos. As células foram semeadas em lamelas revestidas com fibronectina e tratou-se com GDC-0449 (10 fiM) durante 48 h. Subsequentemente, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4%, bloqueadas em soro de cabra normal a 10% e coradas com GLI1 Gli2 e anticorpos primários (1:100) durante 16 h a 4 ° C e lavadas com PBS. Em seguida, as células foram incubadas com o anticorpo secundário marcado por fluorescência (1:200) juntamente com DAPI (1 mg /ml) durante 1 h à temperatura ambiente e as células foram montados e visualizados sob um microscópio fluorescente. Para melhor visualidade, a cor de DAPI foi mudada de azul para vermelho.

Desde Gli medeia os efeitos da Shh, o próximo examinaram a interação Gli-DNA por ensaio de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA) em humanos CSCs pancreáticas. Tratamento de CSCs com GDC-0449 resultou numa diminuição da actividade de ligação Gli-ADN de um modo dependente da dose (Fig. 5B).

próxima examinou o efeito de GDC-0449 na actividade de transcrição Gli (fig. 5C ). A exposição das CSCs com GDC-0449 durante 36 horas, resultou na inibição da actividade de luciferase repórter Gli-dependente de uma forma dependente da dose. GDC-0449 inibiu a expressão de patched-1 e Patched-2 porque são alvos a jusante de Gli. Nós próxima empregada técnica de imunofluorescência para examinar os efeitos de GDC-0449 sobre a expressão nuclear de Gli (Fig. 5D). CSCs pancreático foram tratados com GDC-0449, e a expressão nuclear de Gli1 e Gli2 foi observada. GDC-0449 inibiu a expressão nuclear de Gli1 e Gli2. No geral, estes dados sugerem que GDC-0449 pode inibir DNA Gli atividade transcricional ligação e.

CSCs pancreáticos humanos exigem função de Gli ativa para a expressão sustentada de genes envolvidos na sobrevivência e proliferação celular

a fim de examinar os efeitos da Gli1 e Gli2 sobre a proliferação celular, apoptose e a jusante metas, que inibiu a expressão de fatores de transcrição GLI1 e Gli2 por shRNA. Como mostrado na Fig. 6A, a expressão lentiviral mediada de Gli1 e Gli2 shRNA inibiu a expressão de proteínas e GLI1 Gli2 em CSCs pancreáticas. Se GDC-0449 inibe a viabilidade celular e induz a apoptose através da inibição factores de transcrição Gli, a inibição da Gli1 Gli2 e deve bloquear os efeitos anti-proliferativas e pro-apoptóticos de GDC-0449. Para confirmar os efeitos Gli-dependentes anti-proliferativa e pró-apoptóticas GDC-0449, foi utilizado CSCs pancreáticos expressam Gli1 + Gli2 shRNA (Fig. 6B). GDC-0449 inibiu a viabilidade celular e a apoptose induzida em células CSCs /mexidos. A inibição da Gli1 e Gli2 sozinho por shRNA foi incapaz de inibir completamente os efeitos da GDC-0449 sobre a viabilidade de CSC (dados não mostrados). Por comparação, a inibição da Gli1 mais Gli2 em conjunto por shRNA suprimidos os efeitos de GDC-0449 sobre a viabilidade celular e a apoptose em CSCs. Estes dados sugerem que os genes tanto GLI1 Gli2 e são necessários para efeitos anti-proliferativas e pro-apoptóticos de GDC-0449.

(A), knockout de Gli1 shRNA e Gli2 shRNA em CSCs pancreáticos humanos. CSCs pancreáticas foram transduzidas com as partículas lentivirais expressando mexidos, Gli1 shRNA, Gli2 shRNA ou Gli1 mais Gli2 shRNA (KO). (B), Pancreatic CSCs foram tratados com GDC-0449 (0, 1, 5 e 10 uM) durante 72 h, e a viabilidade celular e a apoptose foi medida em mexidos e Gli1 mais Gli2 shRNA CSCs. Os dados representam a média ± DP, n = 4. @ # ou significativamente diferente do controle (P 0,05). (C), mexidos e GLI1 mais Gli2 shRNA CSCs pancreáticos foram tratados com GDC-0449 (0 e 10 uM) durante 48 h, e os lisados ​​foram extraídos para determinação da expressão de DR4, DR5, PDGFRα, Fas e Bcl-2 por Western análise de mancha. p-actina foi utilizado como controlo de carga. (D), Inibição de esferóides primárias e secundárias de GDC-0449. CSCs pancreático (mexidos, e Gli1 + Gli2 shRNA) foram semeadas em suspensão e tratou-se com GDC-0449 (10 fiM) durante 7 dias. No final do período de incubação, esferóides foram recolhidos, e dissociados com Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.). Para esferóides secundários, as células foram re-semeadas e tratadas com GDC-0449 (10 fiM) durante 7 dias adicionais. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de azul de tripano. Os dados representam SD ± média. @ Ou # significativamente diferentes dos respectivos controles, P . 0,05

A seguir, examinou os efeitos da inibição da expressão Gli no alvo a jusante do SHH percurso por análise de Western blot (Fig 6C.). GDC-0449 (10? M) induziu a expressão da FAS, DR4 e DR5, PARP clivada e inibiu a expressão de Bcl-2 e PDGFRα no CSC /células mexidos. É interessante notar que a expressão de PDGFRα foi diminuída seguinte GDC-0449 o tratamento com um aumento concomitante em Fas. Em comparação, GDC-0449 não teve efeitos significativos sobre a expressão destes alvos a jusante da via de sinalização SHH em células CSCs /Gli1 + Gli2 shRNA.

A seguir, examinou o efeito de GDC-0449 sobre a formação esferóide primária e secundária (Fig. 6D). GDC-0449 inibiu a formação de esferóides primárias e secundárias em células mexidos /CSC. Por comparação, a transdução de Gli1 mais Gli2 shRNA em CSCs suprimidos os efeitos inibidores de GDC-0449 sobre a formação de esferóides primária e secundária. Estes dados sugerem que GDC-0449 pode inibir características CSC pancreáticas.

Discussão

O nosso estudo demonstra, pela primeira vez, que agente terapêutico GDC-0449 Smoothened dependente regula a sobrevivência celular em pancreático humano CSCs. Especificamente, GDC-0449 inibiu a viabilidade celular e a apoptose induzida em três linhas de células de cancro do pâncreas e CSCs pancreáticas. Em CSCs pancreáticas, GDC-0449 também suprimiu a viabilidade das células, as actividades de transcrição Gli-Gli-ligação e DNA, a apoptose induzida por activação da caspase-3 e PARP de clivagem. Análise dos mecanismos moleculares da morte celular induzida por GDC-0449 em CSCs mostraram um aumento da expressão de Fas e a diminuição da expressão de PDGFRα, que também regula a Fas. Além disso, a Bcl-2 foi regulada para baixo enquanto que DR4 e DR5 foram expressões aumentada após o tratamento de GDC-0449. Supressão de ambos Gli1 mais Gli2 por shRNA imitou as mudanças na viabilidade celular, a formação esferóide, apoptose e expressão de genes relacionados com a morte observada em CSCs pancreáticas tratados com GDC-0449. Assim, os genes Gli ativados reprimir DRs e expressões Fas enquanto up-regulação da expressão de Bcl-2 e PDGFRα para inibir Fas. Nossos resultados destacam o papel crítico da sinalização de SHH em CSCs pancreáticos humanos ea possibilidade de segmentação GLI1 e Gli2 funções ativador usando GDC-0449 em células-tronco do câncer de pâncreas.

SHH eventos de sinalização têm sido implicados na proliferação de células tumorais e sobrevivência, assim como é a marca molecular de entidades diferentes de tumores humanos que incluem carcinoma do esófago de células escamosas, carcinoma de células basais [38], subconjuntos de meduloblastoma [39], o cancro da próstata [40], o cancro do cólon [41], tumores cerebrais [42 ], rabdomiossarcoma [43], e cancro da mama [44]. Várias linhas de evidência apoiam a ideia de que a sinalização SHH é um pré-requisito para o aumento da viabilidade das CSCs pancreáticas, tais que o bloqueio de sinalização SHH ativo com as moléculas inibidoras terapêuticas, tais como GANT-61 (visando efetores Gli1 e Gli2) e cyclopamine (visando receptor SHH smoothened) morte celular induzida por [45]. Nós mostramos que linhas celulares de cancro pancreático humano e CSCs consistentemente expressar vários componentes da via SHH incluindo efetores (GLI1 e Gli2) e receptores (Patched-1, Patched-2, e Smoothened), e mais importante do ligando: SHH, sugerindo , SHH via é uma via de sinalização do “núcleo” ou um modo autócrino de sinalização SHH nestas células. A activação da cascata de sinalização de SHH induz consistentemente factores de transcrição da família (Gli GLI1 e Gli2), daí ambos os genes Gli ARNm [46], expressa em linhas celulares de cancro do pâncreas e CSCs, indicando o envolvimento potencial da sinalização de SHH na carcinogénese pancreática humana.

activação aberrante de sinalização SHH está implicado em muitos cancros humanos. Para identificar novos alvos terapêuticos, a inibição da sinalização do SHH foi tentada em vários cancros humanos [11], [41], [45]. Recentemente, os antagonistas Gli Smo e têm sido utilizados para ab-rogar a sinalização SHH em cancros humanos (40). antagonistas naturais e sintéticas tais como Smoothened ciclopamina [24] e IPI-926 [11], proliferação, respectivamente, inibida, de sobrevivência e têm funções anti-tumorais, resultando em cancelamento da sinalização SHH. No entanto, durante os ensaios clínicos foram observados vários níveis de resistência. agentes farmacológicos incluindo cyclopamine (11), GDC-0499 e GANT-61 [41] têm funções de sobrevivência e antitumorais inibida em modelos pré-clínicos de cânceres humanos. Gli genes são potenciais membros da via de SHH, que actuam como mediadores a jusante de sinalização de SHH e têm efeitos reguladores no ciclo celular e apoptose. Assim, um alvo potencial druggable reside nos factores de transcrição da família Gli, que são os mediadores finais de regulação da transcrição na via de sinalização de SHH. No presente estudo, a exposição a GDC-0449 induz citotoxicidade significativa e apoptose em células de cancro pancreático humano e CSCs.

tratamento de GDC-0449 de forma eficaz diminuição da ligação Gli-DNA e da atividade Gli-transcricional em CSCs pancreáticos humanos. Estes resultados sugerem que GDC-0449 pode induzir alterações pós-transcricional do gene Gli, que pode, apontam para um aumento da fosforilação que ou impedir a ligação de ADN ou desestabilizar o complexo de ADN-Gli. Modificações pós-tradução do gene Gli é um mecanismo importante que regula a capacidade de factores de transcrição diferentes para inibir conjuntos de genes distintas, envolvida na regulação da inibição da morte de células [41], consistente com observações anteriores em células de cancro do pâncreas manipulada para expressar Gli1 [13 ]. tratamento de GDC-0449 de particular interesse, Smoothened dependente de CSCs pancreáticas marcadamente expressões inibidos de receptores SHH (Patched-1, Patched-2 e Smoothened) e atuadores (GLI1 e Gli2), demonstrando assim o potencial de aplicação terapêutica para o tratamento de câncer de pâncreas . Foi previamente relatado que a GDC-0449 foi identificado como inibidor da actividade transcricional Gli1, e também anulou a transcrição mediada por Gli2 [36]. Posteriormente, temos observado que a redução na expressão Gli2 precedeu o de Gli1 em CSCs pancreáticas. Além disso, estudos em ratos revelaram que Gli2 é mediadores principais de sinalização SHH e é conhecido por regular a expressão transcricionalmente Gli1 [25]. Uma vez que a via de sinalização de SHH já é activado em CSCs pancreáticos humanos, foram realizados estudos usando shRNA knockdown de Gli1 e Gli2 sozinho e simultaneamente. GDC-0449 significativamente a viabilidade celular e inibiu a apoptose induzida em shRNA Gli1 e Gli2 sozinho (dados não mostrados). Curiosamente, proteção significativa contra a citotoxicidade induzida pelo GDC-0449 e apoptose foi gravado em shRNA knockdown de ambos Gli1 e Gli2. Estes dados suportam ainda mais a ideia de que GDC-0449 pode ter Gli-dependente e independente de modo de ação (Fig. 7) e mostram ainda a importância de genes Gli funcionais na manutenção da sobrevivência celular em CSCs pancreáticos humanos.

activado Gli1 e Gli2, a jusante de SHH-Patched-Smoothened, regular alvos de sinalização de SHH incluindo Bcl-2, PDGFRα, Fas e DRs. GDC-0449 (visando smoothened) bloqueia as funções indiretas de ativadores Gli, resultando em morte celular.

Para avaliar efeito antiproliferativa de GDC-0449 em mais detalhes, nós próxima correlacionada a expressão do ciclo celular e genes relacionados com a apoptose com SHH sinalização em CSCs pancreáticas. Em várias células estaminais e células cancerosas, a Shh actua como um factor de sobrevivência [9], [47]. SHH foi reportado para controlar a proliferação de vários tipos de células através de vários mecanismos moleculares, tais como aumento da PDGFRα e Bcl-2 expressões, diminuir em expressões DRs e Fas, e a inibição da clivagem de PARP e a caspase-3 de activação em linhas celulares de cancro do cólon superexpressando genes Gli [41] ou, uma superexpressão de dominante negativo FADD em células que expressam SHH ou Smoothened constitutivamente activa [41]. No nosso estudo, GDC-0449 induziram um aumento marcado na expressão de Fas e DRs (TRAIL-R1 /DR4 e TRAIL-R1 /DR5), sugerindo o envolvimento potencial destes RDs na apoptose induzida por drogas. Relatórios recentes indicaram a ausência de Gli sítios na região do promotor de DR4 e DR5 ligação. A regulação da expressão DR pelo Gli é actualmente desconhecido e pode ser por meio de um mecanismo indirecto. No entanto, GDC-0449 induzida a regulação de ambos os DRs em CSCs pancreáticas, sugerindo a regulação da transcrição de DRs por um mecanismo actualmente desconhecido. Também determinamos as contribuições das vias apoptóticas morte celular (intrínseca e morte receptor extrínsecos mediada por sinalização mediada por mitocôndrias), com base no regulamento conhecida de PDGFRα a montante do Fas [2], [48], e de Bcl-2, o que pode ser um alvo da transcrição directa de ambos Gli1 e Gli2, uma proteína anti-apoptótica fundamental na sobrevivência celular SHH-dependente [49]. Mostrámos que GDC-0449 reduz tratamento proteína pró-sobrevivência expressão de Bcl-2 em CSCs pancreáticas. Assim, os nossos dados demonstram que a activação da via de SHH pode regular os genes envolvidos em ambas as vias de células-extrínsecas e intrínsecas às células de apoptose.

Em conjunto, este estudo revela que a sinalização de SHH endógena controla a capacidade de auto-renovação de humano CSCs pancreáticas alvejando alvos a jusante de Gli. Em conclusão, GDC-0449 pode ser utilizado para o tratamento do cancro do pâncreas humano, porque podem alvejar CSCs com cancro pancreático.

Métodos

Anticorpos e reagentes

Anticorpos contra a SHH, alisado, Fas, TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, e β-actina foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Os anticorpos contra Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, PDGFRα e caspase-3 foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). quimiluminescência melhorada (ECL) reagentes de detecção de Western blot foram de Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). GDC-0449 (Vismodegib; C19H14Cl2N2O3S) foi adquirido a Tocris (Ellisville, MO). Todos os outros produtos químicos utilizados eram de grau analítico e foram adquiridos a partir de Fisher Scientific (Suwanee, GA) e da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

cultura celular

linhas celulares de cancro do pâncreas ( AsPC-1, PANC-1 e MIA PaCa-2) foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2. CSCs pancreáticas humanas (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) foram obtidas a partir Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Eles foram isolados a partir de tumores primários e foram descritos anteriormente [33]. Os CSCs foram cultivadas em DMEM suplementado com 1% de suplemento de N2 (Invitrogen), 2% B27 Suplemento (Invitrogen), 20 ng /ml de factor de crescimento de plaquetas humano (Sigma-Aldrich), 100 do factor de crescimento epidérmico ng /ml (Invitrogen) e 1 % de antibiótico-antimicótico (Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2. CSCs pancreáticas foram rotineiramente verificada por meio de morfologia e características de crescimento

produção de partículas de Lentivirus e Gli1 shRNA e Gli2 shRNA transdução

Gli1 shRNA (5′-GCCTGAATCTGTGTATGAA-3 ‘; 5’GTTTGAATCTGAATGCTAT-3. ‘; 5′-AGCTAGAGTCCAGAGGTTC-3′; 5′-CCGGAGTGCAGTCAAGTTG-3 (5’-CCGAGAAGCAAGAAGCCAA-3 ‘e 5′-GGCTGGACCAGCTACATCA-3’) e Gli2 shRNA ‘; 5′-CACAGCATGCTCTACTACT-3′; 5’-TCGCTAGTGGCCTACATCA