Sumário

Objectivo

Os níveis elevados de esteróis regulamentar proteína 1 de ligação ao elemento (SREBP-1) foram encontrados no câncer de endométrio (CE), sugerindo que é essencial para a desenvolvimento da CE. Obesidade e diabetes foram estabelecidos como factores de risco conhecidos de CE, enquanto polimorfismos SREBF-1 gene também foram encontrados para ser associada com a obesidade e diabetes tipo II. Portanto, a hipótese de que o polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em SREBF-1 gene pode estar associado com um risco aumentado de CE.

Método

Foi analisada a sequência de SREBF-1 em amostras de tecido de 30 casos da CE e 6 controlos benignos usando método de alto rendimento. Com base nos resultados preliminares, foi selecionado um SNP (rs2297508) como um marcador genético para realizar um estudo de caso-controle de base hospitalar com 139 casos da CE e 129 controles benignas. As amostras foram examinadas ao microscópio para determinar a sua histopatologia antes da análise de SNP utilizando RT-PCR.

Resultados

Através da análise de sequência, encontramos 10 SNPs de SREBF-1 associado com CE, incluindo 3 novos SNPs. Catorze por cento de CE mostrou o SNP rs2297508, com C alelo, enquanto que apenas 7% tinha o alelo C estava presente em controlos benignas (p = 0,027, OR = 1,983). Além disso, o alelo C foi associado com diferenciação câncer (p 0,05) e a profundidade da invasão do miométrio (p 0,05).

Conclusão

Nosso estudo indica que SNP (rs2297508) de SREBF -1 pode servir como um fator de predisposição genética para o desenvolvimento da CE e rastreio de tais marcador genético pode ser útil para a sua detecção precoce

Citation:. Qiu CP, Lv QT, Dongol S, Wang C, Jiang J (2014) Single Nucleotide Polymorphism de SREBF-1 gene associado com um risco aumentado de cancro do endométrio em mulheres chinesas. PLoS ONE 9 (3): e90491. doi: 10.1371 /journal.pone.0090491

editor: Kwang-Hyun Baek, Universidade CHA, República da Coreia

Recebido: 24 de agosto de 2013; Aceito: 31 de janeiro de 2014; Publicação: 10 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Qiu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi realizado no laboratório cardiovascular de Qi Lu Hospital da Universidade de Shandong e foi apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation da China (81072121, 81372808 [JJ] e 81173614 [QTL]), bem como o planejamento de Ciência e Tecnologia de Desenvolvimento de Shandong (2011GSF12122 [XZ] e 2012G0021823 [JJ]). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial (CE) é a neoplasia maligna ginecológica mais comum no mundo ocidental e o quarto câncer mais comum em mulheres. A incidência da CE aumentou 21% desde 2008, ea taxa de mortalidade aumentou significativamente ao longo das últimas duas décadas [1]. A American Cancer Society estima 49.500 novos casos e 8.200 mortalidades em 2013 [2]. A etiologia da CE é multifatorial e envolve o aumento da exposição ao estrogênio [3] e factores de risco genéticos. Até agora, tem sido provado que vários SNPs estão associados com um risco aumentado de CE, tal como nucleósido-difosfato-cinase 1 (nm23-H1; rs16949649 e rs2302254), inibidor da serpina peptidase, clado E (PAI-1; rs1799889) e progesterona receptor (PGR; rs11224561) [4] – [6]. Para entender os fatores de risco genéticos abrangente e encontrar alvos eficazes, é necessário identificar os SNPs relacionados.

Proteínas de ligação elemento regulador

esteróis (SREBPs) são fatores de transcrição do zipper-hélice-alça-hélice leucina ( HLH-LZ) família. Três isoformas de SREBP foram identificados em células de mamíferos: SREBP-1a, SREBP-1c e SREBP-2 [7]. Dois genes (SREBF-1 e SREBF-2), são responsáveis ​​por expressar estas proteínas dos quais SREBF-1 gene está localizado no cromossoma 17 p11.2. Há uma sobreposição nas vias e funções entre os SREBPs individuais, mas a maioria dos estudos sugerem que SREBP-1 regula principalmente o metabolismo de ácido gordo e de SREBP-2 é o principal regulador do metabolismo do colesterol [8]. SREBP-1 regula a homeostase de lípidos através do controlo da expressão dos enzimas limitantes da velocidade chave necessários para a síntese de colesterol e ácidos gordos de ácido [9]. lipogénese aberrante é uma função metabólica importante envolvida na proliferação rápida das células de tumores malignos. Vários estudos têm demonstrado que as células tumorais são capazes de reactivar a síntese lipídica de novo e que expressam níveis elevados de síntese de ácidos gordos (FASN) [10], que é regulada por SREBP-1 [11]. Consistente com estes resultados, SREBP-1 foi demonstrada para ter uma associação com diversos outros tumores malignos, tais como o cancro da mama, cancro da próstata e cancro colo-rectal, bem [12] – [15]

Através do mecanismo de. a biossíntese de lípidos, SREBP-1 foi proposto para ser um factor causal da obesidade [16]. A obesidade, por outro lado é considerado responsável por vários mecanismos que precipitam em carcinogénese [7]. Através de um mecanismo de resistência à insulina, obesidade induz a secreção de insulina a partir das células pancreáticas. A insulina por sua vez tem um efeito estimulador sobre SREBP1 [17]. Recentemente, mais elevado nível de SREBP-1 tem sido detectada em células de CE em comparação com o endométrio normal, e que foi mais proeminente no grau mais elevado CE. Além disso, knockdown de SREBP1 foi encontrado para reprimir eficazmente a capacidade de proliferação de células da CE e o crescimento do tumor in vitro, indicando ainda que SREBP-1 desempenha um papel importante na progressão da CE [18].

Para nosso conhecimento , nenhum estudo até à data tem relatado a associação potencial da SREBF-1 polimorfismo genético com o risco de CE. Nossa hipótese é que SNPs em SREBF-1 pode estar associado a um risco aumentado de CE, juntamente com vários critérios clínicos como grau patológico, estadiamento clínico, tipo patológico etc. O SNPs de SREBF-1 pode servir factores predisponentes como genéticos para o desenvolvimento da CE e rastreio de tais marcadores genéticos poderiam ser de grande valor para uma detecção precoce desta doença.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Os consentimentos informados por escrito endossado foram adquiridos a partir de todos os participantes e as amostras foram coletadas com a aprovação do Comitê de Ética da Qilu Hospital da Universidade de Shandong.

Em nosso estudo, foi realizada uma análise de caso-controle com um total de 139 casos e 129 controles. Nós primeiramente rastreados todo o gene de SREBF-1 em 30 pacientes e 6 independentes CE controlos para identificar SNPs associado. Com base nos resultados obtidos, optamos por um SNP (rs2297508) que foi encontrado em oito dos trinta pacientes e nenhum dos seis controles e realizou um estudo de caso-controle, a fim de verificar sua associação com a CE.

Estudo

Um total de 268 candidatos imparciais foram recrutados estocasticamente. As amostras de 139 amostras CE e 129 controles benignos foram coletados com base em seus relatórios patológicos. As amostras endometriais de 139 pacientes com câncer foram obtidos através de ressecção cirúrgica após histerectomia realizada na Qilu Hospital Departamento de ginecologia. As amostras de tecido para controles foram coletadas de pacientes com problemas de fertilidade e com patologias benignas como leiyomyomas, adenomiose etc. As amostras individuais foram examinadas sob o microscópio para o diagnóstico patológico para ambos os grupos. Os pacientes da CE foram divididos em dois grupos, 91 sem diabetes e obesidade e 48 com diabetes e /ou obesidade e esta informação foi got a partir dos registros hospitalares. Os controles normais com diabetes ou obesidade (IMC ≧ 28 Kg /m

2) foram excluídos devido a uma possível associação do SNP (rs2297508), com ambas as doenças metabólicas, como descrito no estudo de Liu JXet al. [20 ]. Além disso, os controles não tinha história conhecida de diabetes, obesidade ou quaisquer outras doenças malignas em sua família. A idade média dos 48 pacientes com obesidade e /ou diabetes foi de 53,09 ± 6,7 e que dos 91 pacientes sem diabetes ou obesidade foi de 54,36 ± 9,7 (P = 0,196). A idade média dos controlos normais (52,46 ± 7,7) era comparável à dos 91 pacientes (P = 0,215). Os pacientes da CE foram tratados cirurgicamente no Qilu Hospital entre 2008 e 2012. Eles foram classificados em endometrioid (tipo I) e não-endometrioid (tipo II), CE e os tumores foram encenadas de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia 2009 (FIGO ) classificação.

preparação de ADN

a amostra de tecido fresco coletados foram armazenadas a -80 ° C refrigeração. O ADN genómico foi extraído dos tecidos utilizando um QIAamp DNA Mini-kit (Qiagen, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. O DNA extraído foi dissolvido em tampão TE [10 mMTris (pH 7,8), EDTA 1 mM] e, em seguida, a concentração foi medida com referência a um valor de DO de 260 nm (Bio-Rad SmartSpec Plus). A preparação final foi armazenado a -20 ° C durante a amplificação por PCR. As amplificações foram realizadas utilizando uma desnaturação inicial de 5 min a 94 ° C, seguido de 30 ciclos cada uma com duração de 30 segundos a 94 ° C, 30 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C e uma extensão final de 10 min a 72 ° C. Os primers direto e reverso foram 5 ‘GACCTGAGGCTCCTGTGCTAC 3’ e 5 ‘AAGTCAGTCCATCCTCCCGT 3’, respectivamente.

Seleção de SREBF-1 pontos polimorfismo

Para acessar a informação adequada sobre o potencial associação de SNPs em SREBF-1 com cancro do endométrio, primeiro blindado todo o gene de SREBF-1 em 30 pacientes não relacionados e 6 controles por técnica de sequenciamento de alto rendimento usando PSTAR-II mais (IDN01-M-P2). Os 36 pacientes foram aleatoriamente escolhidos e combinados a partir das suas idades. Fomos capazes de identificar 10 SNPs, incluindo três os recém-detectados. Todos os resultados foram analisados ​​por PSTAR-II 6.0.4 software build3. Para o estudo de associação, foram selecionados apenas um SNP (rs2297508) com base na sua frequência de alelos que exibiu uma relação evidente e significativa a CE.

SREBF-1 genotipagem

Real-time polymerase chain reaction análise foi utilizado para genotipar o SNP (rs2297508) em SREBF-1. As sequências dos iniciadores para o SNP foram como se segue: GF 5 ‘CTCCCCCAGCACCTACGG 3’, CF 5 ‘CTCCCCCAGCACCTACGC 3’ como o iniciador para a frente e R 5 ‘CTCCCCACTCCTCCCACTAAC 3’ como o iniciador inverso. O sistema de reacção (20 ul) para RT-PCR incluíram 10 ul tudo-em-ona Mistura-qPCR, 0,4 ul iniciador directo F (2? M), 0,4 ul iniciador inverso R (2 uM), ADN genómico de 2 ul e 7,2 ul ddH2O . O procedimento da reacção foi conduzida num equipamento de PCR em tempo real (Passo Um Plus (ABI)) dividindo-se em três fases: fase de manutenção a 95 ° C durante 20 s, estágio de ciclagem de 40 ciclos cada uma das quais 3 s a 95 ° C e, em seguida, 30 s a 60 ° C, derretendo fase curva a 60 ° C durante 60 s, seguido por 95 ° C durante 15 s.

Análise estatística

Hardy-Weinberg análises foram conduzidas para comparar as frequências dos genótipos usando χ

2 de teste entre os controles (χ

2 = 1,24, p = 0,26). Comparação de freqüências genotípicas entre pacientes e controles CE foram realizadas utilizando Pearson χ

2 de teste. Também foi avaliada a relação entre a distribuição de genótipos de SREBF 1-SNPs e os critérios clínicos de CE (divididos com base em presença ou ausência de diabetes e obesidade, idade, tipo histológico, classificação patológica e estágios clínicos). As análises foram realizadas utilizando o SPSS software (versão 17.0). P 0,05 foi considerado o nível de significância estatística

Resultados

identificação SNP e genotipagem

Nossa triagem identificou 10 polimorfismos (SNP1 para SNP10), incluindo 3 locais detectados recentemente (. Figura 1). O alelo C na SNP9 (rs2297508) foi detectada em oito de trinta pacientes (26,7%), mas em nenhum dos controles. Outros SNPs detectados mostrou pouca diferença entre pacientes e controles. (Tabela 1) Em seguida, foram selecionados SNP9 (rs2297508) para um estudo mais aprofundado e analisadas todas as amostras experimentais e controles usando reação em cadeia da polimerase em tempo real. Os resultados (GG, GC ou CC) foram analisados ​​por Step One V2.1 Software. A genotipagem foi realizada com base nas curvas de amplificação diferentes observados para diferentes genótipos (Fig. 2)

A:. SNPs em SREBF-1 gene. O conjunto SREBF-1gene inclui 22 exons. Dez SNPs (SNP1 para SNP10) foram identificados dentro do SREBF-1 em nosso estudo. FIG. 1 B: SNP ID. SNP1 para SNP10 são listados de 5′-3 ‘da SREBF-1. “CHR-ID” mostra ID cromossomo de dez SNPs em SREBF-1. Listados “RS ID” tem sido relatada em ucsc ou website NCBI, “-” expressa recém-detectado SNP. coluna “Função” listado alteração da função geneticamente codificada do SNPs. “Ref SNP” mostra formulário SNP na sequência de referência original. Em “ARNm de localização”, posições de ARNm correspondentes são apresentados na consistente com cada SNP. (Para mais informações: IDs de sequência incluída no CCDS 32.583,1). NCBI db está disponível a partir https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP.

Fig. 2 A, B e C mostram GG, CC e do genótipo GC, respectivamente, como mostrado pelos resultados obtidos por RT-PCR.

associação entre rs2297508 SNP e risco de CE

A distribuição dos alelos do SNP (rs2297508) sobre SREBF 1-genótipos em grupos de controle é consistente com Hardy-Weinberg como testado por χ

2 de teste (χ

2 = 2,27, P = 0,13). A variação na distribuição do alelo C entre pacientes e controlos normais CE foi claramente mostrado (P = 0,027). A χ

2 teste revelou que os genótipos GC /cc ou portadores do alelo C tiveram um risco aumentado de CE (OR = 1.966 e OR = 1.983, respectivamente) em comparação com GG ou portadores G respectivamente. intervalos de confiança da odds ratio (OR) foi usada para descrever as limitações dentro do qual os cálculos estimados deve ser válido. A comparação das freqüências genotípicas e alélicas do SNP entre os pacientes da CE e controles normais encontram-se na Tabela 2. Os resultados foram consistentes com a nossa experiência preliminar alto rendimento.

associação entre rs2297508 SNP e grau patológico e a profundidade da invasão do miométrio da CE

Nós tentamos explicar o papel do rs2297508 loco polimórfico em condições co-existentes como diabetes, obesidade, bem como em diferentes faixas etárias, tipos patológicos e graus patológicas do câncer , estágios clínicos e invasão miometrial em pacientes da CE (Tabela 3). Desde diabetes e obesidade são dois grandes riscos conhecidos por estar intimamente ligada a CE, eo SNP sendo um marcador importante da predisposição genética de CE, pode-se supor que havia um potencial efeito desse polimorfismo particular sobre a condição. Os pacientes foram divididos em dois grupos CE (com diabetes ou obesidade e sem). No entanto, não houve diferença significativa na frequência de alelos era evidente entre os dois. Outros critérios para dividir os participantes em vários grupos foram determinados de acordo com relatórios anteriores, bem como significado clínico [4], [5]. Os resultados mostraram que os portadores da variante SNP C tiveram maior grau patológico e mais profunda invasão do miométrio (OR = 2.042 e OR = 2.233, respectivamente) em comparação com as transportadoras G. Além disso, o /genótipo CC GC eo alelo C foram significativamente associados com o grau patológico (χ

2 = 4,095, P = 0,043 e χ

2 = 3,893, P = 0,048, respectivamente) ea invasão do miométrio (χ

2 = 4,018, P = 0,045 e χ

2 = 4.170, P = 0,041, respectivamente). Outros critérios como a idade, o tipo patológico e estágio clínico não apresentou associação significativa com o SNP.

Discussão

biossíntese lipídica é essencial para a manutenção da homeostase celular, enquanto o aumento de síntese de lipídios novo é uma característica metabólica comum de carcinogênese [19]. O aumento da expressão de FASN e LDLR (lipoproteína de baixa densidade do receptor) nas células tumorais atestam esta afirmação [20]. SREBPs pode regular várias enzimas envolvidas em ácidos gordos e a biosíntese do colesterol. Para além de influenciar várias enzimas envolvidas na lipogénese, SREBP também participa na conversão de androgénio em estrogénio através da reacção de aromatização aumentando assim o nível de estrogénio em circulação. A obesidade também tem sido considerada responsável por redução dos níveis de progesterona, que tem um efeito antagonista forte sobre a função cancerígenas de estrogénio [21]. Além disso, SREBP1 também está associada com a modulação da transcrição da enzima 17β-hidroxiesteróides desidrogenase de tipo 12 (17 β -HSD12), que é responsável pela transformação da estrona (E1) de uma forma mais potente, o estradiol (E2) [22], [23]. Assim, pode-se deduzir que a actividade SREBP é necessário para o crescimento do tumor, o que implica que SREBP desempenha um papel significativo na oncogénese. Além disso, a aberrante expressão aumentada de SREBP-1 foi encontrado em vários tipos de câncer, incluindo CE [18].

Nesta pesquisa, postulou que SNPs em SREBF-1gene tem potencial papel na predisposição genética da CE. Um estudo anterior detectado 19 polimorfismos em SREBF-1 e demonstraram a associação entre SREBF-1 polimorfismos e obesidade, bem como diabetes tipo II [19]. Além disso, estudos epidemiológicos têm confirmado que a obesidade é um dos principais fatores de risco da CE enquanto polimorfismos SREBF-1 genes têm associações com doenças metabólicas (diabetes tipo 2 e obesidade) [24]. Outro estudo concluiu que os rs2297508 SNPs e rs11868035 no gene SREBP-1c têm relações com aumento do risco de DM2 e dislipidemia na população chinesa. O mesmo estudo também mostrou que o SNP (rs11868035) é significativamente associada com a resistência à insulina (IR) em pacientes diabéticos [25]. No entanto, os estudos, que demonstram a relação entre SREBF-1 polimorfismos genéticos e cânceres, são raros. Até agora, apenas a Daniele Campa e seus colegas de trabalho têm investigado a relação entre SNPs em SREBF-1 e oncogênese de câncer de mama, mas nenhuma associação estatisticamente significativa foi encontrada entre os SNPs detectados e o risco de câncer de mama [26]. Assim nós também avaliaram ainda mais a nossa hipótese de que os polimorfismos genéticos estão associados com diabetes e obesidade, juntamente com alguns outros parâmetros clínicos associados à CE.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que examina o papel da SREBF-1 polimorfismos do gene em CE. Em nosso estudo, descobrimos que a distribuição do SNP (rs2297508) teve uma demarcação clara entre os pacientes da CE e controles benignas. O alelo C na SNP foi associada a uma maior susceptibilidade a CE. Portanto, podemos prever a possibilidade elevada do alelo C na SNP ter uma relação fundamental com o risco de CE e acreditamos que uma maior exploração levaria pesquisadores para o desenvolvimento de um novo alvo terapêutico para o tratamento da CE.

analisou ainda a associação de diferentes características clínicas em pacientes da CE com o SNP. Primeiro, avaliamos associação entre diabetes e /ou obesidade e genotípica ou freqüências alélicas em pacientes da CE. Mas não houve significância estatística entre os dois grupos. Isto quer dizer, o SNP tem a mesma distribuição em pacientes CE, independentemente da presença ou a ausência de factores de risco, como diabetes e obesidade. Ele sugeriu que havia metabolismo de lípidos anormal associada com o SNP na CE, que é independente de diabetes e obesidade. Em seguida, em comparação critérios de idade, tipos patológicos e estágios clínicos, mas não foram obtidos associações significativas, fornecendo evidência de que não existe nenhuma associação entre o SNP e essas características clínicas. Coerência com o relatório apresentado por Li W. et al. [21], o alelo C na SNP apresentaram uma associação significativa com tumor de alto grau. Além disso, os pacientes com o alelo C apresentaram um maior risco de desenvolver uma invasão miometrial mais profundo em comparação com aqueles com alelo G no locus de SNP. Esta descoberta pode resultar de detecção tardia da doença no entanto, não podemos excluir a possibilidade de a influência do SNP. Pode haver uma potencial relação entre o grau patológico do tumor, bem como a profundidade da invasão do miométrio. No entanto é necessária mais investigação para esclarecer este conceito. Em resumo, o alelo C parece ser um marcador de um tumor de grau mais elevado e mais profunda invasão do miométrio em EC, e, portanto, pode atuar como um marcador indispensável para ser tidos em conta na avaliação e tratamento de CE no futuro próximo clínico.

em conclusão, nosso estudo investigou principalmente a associação entre o SNP (rs2297508) em SREBF-1 e o risco de CE e descobriu que C alelo do SNP é potencialmente um fator de risco para CE. Ao mesmo tempo, analisamos a associação do SNP com diferentes critérios clínicos da CE e os resultados mostraram que os pacientes com maior frequência de alelos C foram mais suscetíveis a desenvolver tumor de alto grau e invasão do miométrio profundo. Os resultados indicaram que o polimorfismo SREBF-1 pode desempenhar um papel essencial para o aumento da susceptibilidade genética à CE. Assim, assumimos que isso poderia auxiliar o médico no diagnóstico clínico da doença e também orientar no sentido de uma terapia clínica alvejado.

Em nosso estudo, foram empregados sequenciamento de alto rendimento, uma técnica confiável com grande exatidão e precisão, para detectar 10 SNPs associados à CE, incluindo três novos que podem ser de importância para outros estudos no futuro. Além disso, confirmou que o SNP (rs2297508) em SREBF-1 tem uma influência significativa na susceptibilidade CE e critérios clínicos. No entanto, nosso estudo tem algumas limitações. No nível assunto, não temos dados de estilo de vida, tais como a ingestão alimentar, atividade física, uso de anticoncepcional hormonal, etc., que são susceptíveis de influenciar a susceptibilidade dos SNPs ao risco CE. Além disso, desconhece-se se o SNP funciona em coordenação com outros SNPs no aumento do risco de CE. futuros estudos de maior tamanho da amostra será necessário estudar a influência desses fatores sobre a associação entre o SNP e risco de CE.

Informações de Apoio

Informação S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0090491.s001

(DOC)

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Judith A. Strong, Departamento de Anestesiologia, Univerisity de Cincinnati College of Medicine por seus comentários /sugestão na preparação do manuscrito.