Sumário

Mais de 90% da mortalidade de câncer são devidos ao câncer que tem metástase. Portanto, é crucial para intensificar a investigação sobre a formação de metástases e terapia. Aqui, nós descrevemos pela primeira vez a capacidade metástase do C33A linha celular de cancro cervical humano em ratinhos nus atímicos após a implantação subcutânea de células tumorais. Neste modelo, demonstrou uma progressão constante de lombares e metástases de nódulos linfáticos renal durante o desenvolvimento do tumor. Além de ocorrer predominantemente metástases linfáticas, visualizamos a formação de metástases hematogênicas utilizando proteína fluorescente vermelha (RFP) expressando células C33A-RFP. células cancerosas positivas foram encontradas RFP migrar em vasos sanguíneos e formando micrometástases em pulmões de ratos portadores de tumor. Em seguida, partimos para analisar a influência da virotherapy oncolytic no modelo C33A-RFP e demonstrou uma redução mediada por vírus eficiente do tamanho do tumor e carga metastático. Estes resultados sugerem que o modelo de cancro cervical C33A-RFP como uma nova plataforma para analisar as metástases do câncer, bem como para testar novas opções de tratamento para combater metástases

Citation:. Donat U, Rother J, Schäfer S, Hess M, Härtl B, Kober C, et ai. (2014) Caracterização da formação de metástases e virotherapy no Modelo de cancro do colo do C33A Humano. PLoS ONE 9 (6): e98533. doi: 10.1371 /journal.pone.0098533

editor: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de setembro de 2013; Aceito: 05 de maio de 2014; Publicação: 02 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Donat et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa e Desenvolvimento de Genelux Corporation, San Diego, EUA, e uma subvenção de serviço para a Universidade de Wuerzburg, Alemanha financiado pelo Genelux Corp. UD e SW recebeu bolsa de pós-doutorado. JR, CK, SS, e MH recebeu uma bolsa de pós-graduação a partir Genelux Corporação concedido à Universidade de Wuerzburg. AAS, JS, NGC, e RJA são empregados assalariados de Genelux Corporation e tem interesses financeiros em Genelux Corporation. BH é um trabalhador assalariado de Genelux GmbH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa e Desenvolvimento de Genelux Corporation, San Diego, EUA, e uma subvenção de serviço para a Universidade de Wuerzburg, Alemanha financiado pelo Genelux Corp. UD e SW recebeu bolsa de pós-doutorado. JR, CK, SS e MH recebeu uma bolsa de pós-graduação a partir Genelux Corporação concedido à Universidade de Wuerzburg. AAS, JS, NGC e RJA são empregados assalariados de Genelux Corporation e tem interesses financeiros em Genelux Corporation. BH é um trabalhador assalariado de Genelux GmbH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Além disso a todos os interesses conflitantes declarados perante os autores acrescentam que aqueles não alteram a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

propagação metastática de tumores é um processo de múltiplos estágios durante o qual as células malignas difundir a partir do tumor primário para órgãos distantes [1]. As células tumorais migrar através de duas vias principais: O sistema linfático e circulação de sangue. Durante a metástase linfática, uma característica comum para a maioria dos carcinomas, as células tumorais deixam o local do tumor original e migrar após a liquidação nos linfonodos regionais para os distantes [2]. O diagnóstico de metástases linfáticas é de grande importância. Mesmo que, metástases linfáticas em si são raramente fatais que indicam o estado de progressão tumoral [3]. A maioria das mortes por câncer são devidos ao desenvolvimento de metástases. Portanto, uma compreensão mais ampla da biologia de metástases é necessária. Três principais plataformas são usados ​​atualmente para desenvolver

In vivo

modelos de metástase. Estes incluem a indução química, segundo o qual cancerígenos são administrados para induzir a tumorigénese e metástase, modelos singeneicos e transplante de xenoenxerto envolvendo a transplantação de células de tumor /tecido em hospedeiros murinos e modelos de ratos geneticamente modificados [4] – [5]. Aqui, estamos trabalhando com um modelo de transplante espontânea xenog�ico de metástase. Um certo número de modelos de metástase xenogénicas foram gerados durante os últimos anos, por exemplo, para próstata [6] – [8], colo-rectal [9] – [10], da mama [11] – [12], gástrica [13] – [14] ou de células renais [15] carcinomas. Além disso, há também alguns modelos de papilomavírus humanos (HPV) cancro cervical positivo descritos [16] – [18]

No decurso de um estudo de rastreio do cancro cervical (HPV positivo e linhas celulares HPV negativo) para. viroterapia oncolítico foram analisados ​​os efeitos do vírus vaccinia oncolítico GLV-1h68 nestas linhas celulares. Os resultados indicam que as presenças e o número de cópias de ADN de HPV em células de cancro do colo do útero não têm um impacto sobre a eficácia terapêutica de VGL-1h68 (Tabela S1). Além disso, descobrimos a formação de metástases linfáticas após a implantação subcutânea de células cancerosas C33A HPV-negativos humanos cervical em ratos imunocomprometidos. Portanto, no presente estudo, foi focado sobre a caracterização da capacidade de metastização desta linha celular, que não foi descrito na literatura até agora. Analisamos a linfático e a disseminação hematogênica de células C33A-RFP em ratinhos nus após implantação subcutânea de células tumorais, sendo que a circulação linfática representavam a principal via de metástase células tumorais. Além disso, uma constante progressão de metástases linfáticas em correlação com o crescimento do tumor foi demonstrada.

Além disso, analisamos virotherapy oncolytic de tumores e metástases C33A como uma nova opção de tratamento. Oncolíticos vírus são capazes de se replicar selectivamente em células de cancro, resultando na destruição de tecido tumoral, mas deixando incólumes tecidos saudáveis ​​[19]. Aqui, nós focada em estudar o efeito de a, vírus da vacina recombinante-GLV 1h68 anteriormente descrito atenuada [20] – [21]. O efeito terapêutico deste vírus em tumores primários foi demonstrado para muitos carcinomas, tais como cancro da mama, do pâncreas ou o cancro da próstata [21] – [23]. Além disso, recentemente, mostrou um potencial terapêutico de VGL-1h68 no tratamento linfático e metástases hematog�icas provenientes da linha humano da próstata de células de carcinoma PC-3 [22], indicando que GLV-1h68 pode ser capaz de erradicar a metástases no C33A-modelo como bem. Na verdade, aqui nós demonstramos uma redução mediada por vírus drástica dos tumores C33A-RFP e sua carga metastático.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

O cervical humano HPV-negativo a linha celular de cancro C33A foi cultivada em DMEM de alto teor de glicose (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha) suplementado com FCS a 10% (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha) e solução 1% de gentamicina (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha). A linha de células C33A foi gentilmente cedido por Frank Stubenrauch, PhD (UKT, Universidade de Tübingen; [24]). Autenticidade de células C33A foi verificada pelo DSMZ GmbH (Leibniz Coleção Instituto DSMZ-Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares, Braunschweig, Alemanha). Células C33A-RFP foram cultivadas nas mesmas condições, excepto para a adição de 5 ug /mL de blasticidina. células renais epiteliais humanas (293FT) foram obtidos da Invitrogen GmbH (Karlsruhe, Alemanha) e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% FCS e 2 mM de L-glutamina (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha).

Geração de células C33A-RFP

a sequência de cDNA da proteína fluorescente vermelha (

mRFP1

) foi inserido no genoma da célula C33A usando Vira Poder Lentivirus Kit Expression System (Invitrogen GmbH, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O

mRFP1

-encoding plasmídeo pCR-TK-SEL-MRFP foi fornecida por Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) e usado para gerar o

mRFP1-

contendo vectores lentivirais, tal como descrito anteriormente [25]. Replicação incompetente

mRFP1

-encoding lentivírus foram produzidos em células 293FT por co-transfecção dos plasmídeos pLP1, PLP2, PLP /VSVG que fornecem proteínas estruturais e de replicação de lentivírus e o plasmídeo de expressão pLENTI6 /V5-DEST-MRFP usando Lipofectamine ™ 2000. Depois de transdução de células C33A com lentivírus MRFP de codificação e blasticidina (/mL 5 mg) a seleção, uma RFP estável clone expressando C33A foi selecionado.

estirpe do vírus

A estirpe do vírus vaccinia atenuada GLV- 1h68 foi previamente descrito por Zhang

et al

. [21]. Três cassetes de expressão que codificam para

Renilla

proteína de fusão luciferase-GFP, β-galactosidase ou β-glucuronidase foram recombinadas no

F14.5L

,

J2R Comprar e

A56R

loci, respectivamente, do genoma do vírus LIVP parental.

Ética declaração

Todos os animais foram cuidadas e tratadas em estrita conformidade com as boas práticas de animais, conforme definido pelo nacional e corpos de bem-estar animal local (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório publicado pelo National Institutes of Health e do alemão animal Welfare Act “TierSchG”). protocolos experimentais foram aprovados pelo governo de Unterfranken, Alemanha (números de protocolo 55.2-2531.01-17 /08 e 55.2-2531.01-25 /12) e /ou comitê Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Explora BioLabs, localizados em San Diego Science Center (San Diego, EUA) (números de protocolo: EB08-003; EB11-025).

implantação do tumor e vírus da administração

Os tumores foram gerados através da implantação de 5 × 10

6 células C33A-RFP em 100 mL PBS subcutaneamente no flanco abdominal direito de 6-8 semanas de idade do sexo feminino atímicos nu

Foxn1

nu

ratos (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Alemanha). Tumor e nó de linfa de volume foi monitorizada em duas dimensões utilizando um compasso digital e calculada como [(comprimento) x (largura)

2 × 0,52]. O volume do tumor foi medido em ratos vivos, enquanto que o volume dos linfonodos foi medido

post mortem

, depois de abrir o abdômen. Um nó de linfa foi definida para ser ampliada quando o diâmetro máximo superior a 3 mm. Para estudar o efeito de viroterapia oncolítico uma dose única de 5 × 10

6 unidades formadoras de placas (pfu) de VGL-1h68 em 100 ul de PBS foi injectada intravenosamente (iv) em ratos portadores de tumor C33A-RFP, após o tumor volume atingiu 200-250 mm

3. Os ratos foram sacrificados de acordo com as Diretrizes para a eutanásia de roedores usando dióxido de carbono.

imagens de fluorescência

Imagens de ratos portadores de tumor C33A-RFP foram tomadas com o EX Imaging System Maestro (Caliper, Hopkinton , MA, EUA). imagiologia de fluorescência de tumores, rins, pulmões e nódulos linfáticos de ratinhos portadores de tumor C33A-RFP foi realizada com um MZ16 FA estéreo-microscópio de fluorescência (Leica, Wetzlar, Alemanha). Para geração de imagens de camundongos com o Sistema de Imagem Maestro EX, os animais foram anestesiados com 2-3% de isoflurano. As imagens digitais foram processadas com o Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, EUA).

A medição da intensidade de fluorescência

A medição da intensidade de fluorescência do sinal RFP nos linfonodos e rins de C33A- ratinhos portadores de tumor RFP foi realizada utilizando o ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij). RGB-imagens do sinal de RFP dos rins e dos gânglios linfáticos foram convertidos em escala de cinza de 8 bits com uma faixa de intensidade 0-255. A intensidade de fluorescência representa o brilho média de todos os pixels relacionados RFP.

Imunohistoquímica

Para histologia, tumores, linfonodos e rins foram excisadas e fixadas durante 16 horas em 4% paraformaldeído /PBS, pH 7.4. Preparação de secções de 100 um e procedimentos de marcação foram realizados como descrito anteriormente [26] utilizando o Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Suíça). Após marcação, as secções de tecido foram montadas em Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha). Para a preparação de amostras de tecido 10 uM secções foram seccionados com o criostato Frigocut 2800 (Leica, Wetzlar, Alemanha). Após a desidratação em 10% e 30% de sacarose (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) amostras foram embebidos em Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek Europe BV, Alphen aan den Rijn, Holanda). Crio-secções foram armazenadas a -80 ° C e incubadas com anticorpos primários durante 1 h. Após lavagem com PBS, as secções foram coradas durante 1 h com anticorpos secundários e, finalmente, montado em Mowiol 4-88.

Anticorpos e reagentes

vasos sanguíneos endoteliais foram coradas com um anticorpo monoclonal anti-hamster CD31 anticorpo (Chemicon International, Temecula, EUA; MAB1398Z) e vasos linfáticos endoteliais com um anticorpo policlonal de coelho anti-LYVE-1 (Abcam, Cambridge, UK; ab14917). Os núcleos foram Hoechst 33342 marcado (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanha). Os anticorpos secundários conjugados com DyLight488 (burro) foram obtidos de Jackson ImmunoResearch (Pensilvânia, EUA). Os anticorpos primários e secundários foram diluídas 1:100 em PBS /0,3% Triton-X-100

A microscopia de fluorescência

Imagens de tumor, seções de nódulos linfáticos e renais foram capturados com os seguintes microscópios.: um microscópio estéreo de fluorescência MZ16 FA (Leica) equipado com uma câmera CCD digital eo software Leica IM1000 4.0 (1300 × 1030 pixels imagens RGB-cor), a TCS SP2 AOBS microscópio confocal laser (Leica) equipado com o software LCS 2,16 ( 1024 × 1024 imagens de pixel RGB-cor) e um Axiovert 200 M microscópio (Zeiss) com Axiovision 4,5 software (1388 × 1040 imagens em escala de cinza pixel), respectivamente. As imagens digitais foram processadas com o Photoshop 7.0 (Adobe Systems, EUA) e fundiram-se para produzir pseudo-colored imagens. Imagens de células semeadas em placas de 24 poços foram capturados, quer com o microscópio de fluorescência estéreo-MZ16 FA (Leica) ou com o Axiovert 200 M microscópio (Zeiss).

Preparação de suspensões de células individuais e análise por FACS

Para a preparação de suspensões de células únicas de tumores, lombar e gânglios linfáticos renais, pulmões e rins de C33A-RFP tecidos ratos portadores de tumores foram pesados, picadas e incubados individualmente em meio DMEM de alto teor de glucose suplementado com% de FCS 2, 10.000 U /I mL de colagenase (Sigma, Steinheim, Alemanha) e 5 mU /ml de DNase I (Calbiochem, Darmstadt, Alemanha) a 37 ° C. Os tecidos tumorais foram incubadas durante 35 min tecidos, LN e RN durante 30 min, rins durante 20 min e pulmões durante 15 min. Subsequentemente, os tecidos foram passados ​​através de 70 um filtro de malha de nylon (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) e transferido para meio DMEM de alto teor de glucose suplementado com 2% de FCS. Após centrifugação (1000 g, 10 min) sedimentos foram ressuspensos no volume de 2x PBS /FCS a 2%, em relação ao peso do tecido. Posteriormente, 100 ul das suspensões de células individuais foram analisados ​​usando Accuri C6 Citómetro e software de análise de FACS cflow Versão 1.0.227.4 (Accuri Citómetros, Inc. Ann Arbor, MI, EUA). As células foram fechado acordo com seu tamanho (FSC) e granularidade (SSC). Além disso, 100 ul das suspensões de células únicas foram semeadas em placas de 24 poços em 1 × 10

-1 para 1 × 10

-4 diluições. As diluições foram preparadas em meio DMEM de alto teor de glucose suplementado com 10% de FCS. Três dias após a semeadura meios de suspensão de células foi suplementada com 5 ug /mL de blasticidina, para seleccionar células C33A-RFP. lavar celular e renovação da mídia foram realizadas duas vezes por semana. Após uma semana de selecção blasticidina células C33A-RFP nas placas de 24 poços foram corados com violeta de cristal durante 3 h, lavou-se e secou-se. Depois, colônias de células foram contadas.

A análise estatística

t

um teste de Student bicaudal foi utilizado para análise estatística.

foram considerados estatisticamente significativos valores de p

de ≤0.05. Os asteriscos indicam uma diferença significativa entre os grupos experimentais. (* Indica p ≤ 0,05; ** indica p≤0.01; *** indica p≤0.001)

Resultados

A cinética do crescimento de C33A- subcutânea tumores RFP e linfonodo metastático

Um observado alargamento da lombar e linfáticos renal gânglios em ratinhos portadores de tumor C33A indicaram a presença de células tumorais metástase. Para permitir a visualização de disseminação metastática de células C33A, a sequência de cDNA da proteína fluorescente vermelha (

mRFP1

) foi inserido no genoma da célula C33A. Expressão de RFP em células C33A foi confirmada por microscopia de fluorescência (Fig. 1a). Subsequentemente, 5 × 10

6 Células C33A-RFP foram subcutaneamente (s.c.) implantado no flanco direito de ratinhos nus. Todas as semanas até 49 dias de implantação pós seis a sete C33A-RFP foram examinados ratos portadores de tumores. Como parte dessas análises volumes de tumores, lombar (LN1, LN2) e renal (RN1, RN2) gânglios linfáticos foram medidos (Fig. 1b + c) e fluorescência de imagem de tumores e metástases linfonodais foi realizada (Fig. 1d) . Nós mostrou um aumento constante do volume do tumor de semana para semana após o implante de células C33A-RFP. Ao mesmo tempo, os volumes de lombar e gânglios linfáticos renais foram aumentando, assim, indicando um possível processo de colonização de células de tumor, resultando na expansão do volume do nódulo linfático. imagens de fluorescência confirmaram sinais RFP nos gânglios linfáticos aumentados, demonstrando metástases C33A-RFP. Notavelmente, o volume de LN1, o linfonodo lombar localizado mais próximo ao tumor C33A-RFP primário, foi aumentando a primeira e maior, como seria de esperar para metástases em linfonodos regionais.

tumores e gânglios linfáticos de seis a sete ratinhos por ponto de tempo foram analisados ​​(7 e 21 dpti: N = 7; 14, 28, 35 e 49 dpti: n = 6). um campo brilhante (BF), RFP e sobreposição de imagens de células C33A-RFP, barra de escala representa 100 m. curva b Tempo do crescimento do tumor C33A-RFP. c Volume de lombares e linfáticos renal nós ao longo do tempo. d Imagens representativas de tumores (linha superior) e nódulos linfáticos correspondente (linha inferior) de ratinhos portadores de tumor C33A-RFP em dias indicados após a implantação de células de tumor. Imagens de tumores (T) foram tiradas de ratos vivos usando o EX Imaging System Maestro. Imagem da lombar (LN1, LN2) e renal (RN1, RN2) metástases em linfonodos no abdome de ratos portadores de tumor foi realizada

post mortem

, após a abertura do abdómen e remoção de órgãos. barras de escala representam 2 mm. e percentagem de todos os linfonodos positivos para RFP ao longo do tempo. f Percentagem de LN1, LN2, RN1 e RN2, respectivamente, positivo para RFP por ponto de tempo.

Além disso, imagens de fluorescência durante o curso de tempo de 49 dias revelou um aumento constante da quantidade de linfonodos positivo para RFP após implantação de células de tumor, começando com 21% nódulos linfáticos positivos RFP no dia 7. a quantidade aumentada para 88% nódulos linfáticos positivos para a expressão de RFP no final da experiência (Fig. 1E). Além disso, a percentagem de RFP positivo LN1, LN2, RN1 e RN2 foi analisada por ponto de tempo. No dia 7 pós-implantação de 86% de todos os LN1s detectados foram positivos para RFP, enquanto nenhum sinal RFP foi detectado em LN2, RN1 ou RN2 levando à hipótese de que a colonização metastática com células C33A-RFP ocorre pela primeira vez no LN1 linfonodo regional. Catorze dias implante de células pós tumoral (dpti) todas LN1s detectados (100%) e 50% de RN1s foram positivos para RFP, indicando que após metástase para LN1 as células C33A-RFP, distribuídos para o próximo nó linfático local (linfáticos renais nó RN1) . Metástase células C33A-RFP em LN2 e RN2 foram detectados pela primeira vez no dia 28 pós-implantação (Fig. 1F). Tomados em conjunto, que mostrou uma progressão contínua de metástase de lombar e gânglios linfáticos renais coincidindo com o crescimento do tumor C33A-RFP de semana para semana após s.c. implantação de células tumorais.

células tumorais C33A-RFP metástase via tanto a linfático e as rotas hematog�icas

Durante os nossos estudos microscópicos que detectou a presença de células C33A-RFP em vasos linfáticos que conectam lombar e renal as metástases linfonodais em C33A-RFP ratos, demonstrando assim os vasos linfáticos como via de metástase secundário neste modelo portadores de tumor (Fig. 2a, b) .Além disso, circulam células C33A-RFP também foram detectados nos vasos sanguíneos eritrocitários contendo localizados ao lado a-LN-RN ligar vasos linfáticos, reflectindo o percurso hemática da migração de células de tumor metastático (Fig. 2c). Notavelmente, imagens de fluorescência revelou sinais de RFP em pulmões de ratos portadores de tumores C33A-RFP que geralmente é o primeiro órgão a se metástase em caso de propagação metastática por via hematogênica. Até o implante de células tumorais 28 após dia sem pulmão foi encontrado para ser positivo para a RFP, ao passo que no dia 35 três de seis e, no dia 49 cinco dos seis pulmões foram testou positivo para pontos de RFP (Fig. 2d).

a migração de células C33A-RFP em um LN1 vaso linfático conectar e RN1 42 dpti. barras de escala representam 2 mm. b LYVE-1 coloração de 100 mm secções transversais da parte entre LN1 e RN1. As barras de escala representam 200 um. c migração de células C33A-RFP em um linfa (ponta de seta cheia) e em um eritrócito contendo vasos sanguíneos (seta aberta) 32 dpti. barras de escala representam 2 mm (esquerda) e 500 mm (à direita). sinais d RFP em pulmões de ratos portadores de tumor C33A-RFP. Acima: imagem representativa de um pulmão 42 dpti. A barra de escala representa 2 mm. Abaixo: percentagem de pulmões testou positivo para manchas RFP ao longo do tempo. Pulmões de seis a sete ratinhos por ponto de tempo foram examinados (7 e 21 dpti: n = 7; 14, 28, 35 e 49 dpti: n = 6)

Em resumo, nós claramente demonstrada. que as células C33A-RFP estão usando o sistema linfático, bem como as vias hematog�icas para a propagação metastática em SC implantados ratinhos nus portadores de tumor.

Além disso, observou-se uma acumulação do sinal RFP em rins destes ratinhos por imagiologia de fluorescência durante o curso de tempo de 49 dias (Fig. 3). A análise histológica dos tumores, linfonodos e RNs de ratos portadores de tumor 31 dpti revelou uma estrutura organizada de RFP expressando células C33A em tumores e metástases linfáticas, que não era verdade para RFP em rins (Fig. 4a). Além disso, mostrámos que os sinais renais RFP estavam localizados principalmente no córtex e CD31 marcado vasos sanguíneos na medula e pelve dos rins (Fig. 4b). Imagens do córtex renal com maior ampliação revelou acumulação RFP em nefrónios, pelo qual RFP parecia estar localizada de células-independente em padrões de manchas semelhante (Fig. 4C). Não foram observadas em micrometástases rins. Portanto, vamos supor que o sinal forte RFP em rins de ratos portadores de tumor C33A-RFP pode ser causada pela deposição de RFP no córtex renal, após a filtragem do sangue no néfrons. Em contraste com o que foi observado nos rins, micrometástases foram detectados nos pulmões de ratinhos portadores de tumor C33A-RFP 42 dpti (Fig. 4d) esquerdo. Além disso, as células C33A-RFP individuais foram encontrados em vasos sanguíneos dos pulmões, bem como fragmentos de RFP semelhantes aos observados no córtex renal dos rins (Fig. 4d direita).

seis a sete ratinhos foram analisados ​​por ponto de tempo (7 e 21 dpti: n = 7; 14, 28 e 35 dpti: n = 6). um Imagens representativas de sinal de RFP em rins. linha superior: sobreposição de campo brilhante e imagens RFP. Lower consecutivas: imagens do sinal de RFP. barras de escala representam 2 mm. b média de fluorescência de intensidade do sinal de RFP em rins de ratos portadores de tumor C33A-RFP ao longo do tempo.

Núcleos em a, b e c foram coradas com corante Hoechst. um Sobreposições de campo claro, RFP e imagens Hoechst de 10 mm seções de um tumor, LN, RN e rim 31 dpti. As barras de escala representam 50 mm. b Imagens de 100 uM secções de uma dpti rim 31, coradas com anticorpo anti-CD31 e corante Hoechst. A barra de escala representa 2 mm. c 10 m secção de rim coradas com Hoechst corante. Direita: imagem confocal. As barras de escala representam 100 um (esquerda) e 10