Abstract

Objectivos

Transdutor e ativador de transcrição-3 (STAT3) desempenha um papel importante na invasão de células de tumores e metástases. O objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos da STAT3 knockdown em xenoenxertos rato nuas de células de cancro do pâncreas e expressão do gene subjacente.

Métodos

A lentiviral vector STAT3 shRNA foi construído e infectados em células SW1990. qRT-PCR e Western blot foram realizados para detectar a expressão do gene. Os ensaios de xenoenxerto de ratinho nus foram utilizados para avaliar as alterações em fenótipos destas células estáveis ​​in vivo. Coloração HE foi utilizada para avaliar a invasão das células tumorais e imuno-histoquímica foi realizada para analisar a expressão do gene.

Resultados

STAT3 shRNA expressão silenciado com sucesso de mRNA STAT3 e proteína em células SW1990 em comparação com células de controlo. A taxa de crescimento das células tumorais silenciados-STAT3 em ratinhos nus foi significativamente reduzido em comparação com os tumores no vector de controlo e os tumores gerados células parentais. A invasão tumoral para dentro do recipiente e no músculo também foram suprimidos nos tumores silenciados-STAT3 em comparação com os controlos. expressão de colágeno IV foi completa e contínua em torno dos tumores de células SW1990 silenciou-STAT3, enquanto a expressão de colágeno IV foi incompleta e descontínua em torno dos tumores de controlo. Além disso, a densidade microvascular foi significativamente menor nos tumores silenciou-STAT3 do que os tumores dos pais ou de controlo de células SW1990. Além disso, a MMP-7 de expressão foi reduzido em tumores silenciados-STAT3 comparação com xenoenxertos SW1990 parentais e controlos. Em contraste, a expressão de IL-1β e IgT7α não foi alterada.

Conclusão

Estes dados demonstram claramente que a STAT3 desempenha um papel importante na regulação do crescimento do tumor, invasão, angiogénese e, o que poderia ser ato, reduzindo a expressão de MMP-7 em células de câncer de pâncreas

Citation:. Li Hd, Huang C, Huang Kj, Wu Wd, Jiang T, Cao J, et al. (2011) STAT3 Knockdown Reduz o cancro do pâncreas Invasividade celular e Matriz Metaloproteinase-7 Expressão em ratinhos nus. PLoS ONE 6 (10): e25941. doi: 10.1371 /journal.pone.0025941

editor: Marcelo G. Bonini, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de maio de 2011; Aceito: 13 de setembro de 2011; Publicação: 03 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (No. 09QA1404600) concedido pelo fundo para a investigação científica da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma doença letal e é a quarta causa mais comum de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais [1]. Os dados mais recentes estima que 43.140 novos casos foram diagnosticados em 2010, com cerca de 36.800 mortes associadas nos Estados Unidos [2]. Embora a ressecção cirúrgica fornece uma potencial cura, cancro do pâncreas é muitas vezes diagnosticada em estágios avançados devido à falta de sintomas ou sintomas inespecíficos, tornando a cirurgia impossível. quimioterapia paliativa pode melhorar a qualidade de vida e, potencialmente, afetar a sobrevivência. Estas levaram a um prognóstico muito decepcionantes para os pacientes com cancro pancreático, i.e., a média de sobrevivência é de cerca de 3 a 6 meses e 5 anos de sobrevivência é 5%. Fatores de risco para o câncer de pâncreas incluem tabagismo, consumo de álcool, as dietas ricas em carne vermelha, mas pobre em vegetais e frutas, pancreatite crônica e história familiar. No entanto, os mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo desenvolvimento do câncer de pâncreas não foram elucidados e não há diretrizes estabelecidas para a prevenção do câncer de pâncreas. Por conseguinte, novas abordagens para diagnosticar cancro pancreático precoce para assegurar uma terapêutica eficaz são drasticamente necessário.

O transdutor de sinal e activador da transcrição de genes (STAT3) é um membro da família de proteínas factores de transcrição STAT de. Em resposta a citoquinas e factores de crescimento, os membros da família STAT são fosforiladas por cinases associadas ao receptor, formando homo- ou heterodímeros e translocação no núcleo de células para se ligar a ADN e regulam a expressão dos genes alvo. STAT3 é activada através de fosforilação de tirosina-serina 705 e 727 em resposta a diversas citocinas e factores de crescimento (tais como interferão, EGF, e interleucinas). STAT3 desempenha um papel importante na mediação de vários processos celulares (por exemplo, crescimento celular, apoptose, e diferenciação) [3]. Estudos anteriores demonstraram que a proteína oncogénica STAT-3 foi activada constitutivamente em muitos cancros humanos [4] – [6]. Em contraste, a inibição da via de sinalização de STAT-3 suprimida invasão de células de cancro em vários tipos de cancro [7] – [9]. No cancro do pâncreas, a activação de STAT-3 promoveu o crescimento celular tumoral, invasão e metástase, levando a baixa sobrevivência do paciente. Molecularmente, STAT3 pode regular a expressão de VEGF e de MMP-2 genes [10] – [11]. Estes dois genes, em conjunto com MMP-7, MMP-9, bFGF, IL-1β e IgT7αα estão intimamente relacionados com a progressão do tumor (angiogénese, invasão e metástase) [12] – [14]. No presente estudo, utilizamos o lentivírus STAT3 shRNA para silenciar a expressão STAT3. Dados anteriores do nosso grupo sugere que knockdown da STAT3 inibiu a invasão de células SW1990 do cancro do pâncreas

in vitro Comprar e diminuiu acentuadamente VEGF e expressão de MMP-2 [7]. No presente estudo, investigamos se o silenciamento da STAT3 em células de câncer de pâncreas modula o crescimento de células tumorais e invasão em xenoenxertos nus rato e determinou os mecanismos de sinalização subjacentes envolvidos usando um cDNA microarray.

Materiais e Métodos

cultura celular e infecção por lentivírus

A linha celular de cancro pancreático humano SW1990 foi obtido a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e cultivadas com meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de fetal de bovino soro (FBS) e penicilina /estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO

2 e 95% incubadora de ar. Para silenciar a expressão de STAT3, nós construímos um vector lentiviral transportando STAT3 shRNA como descrito anteriormente [7]. células SW1990 (1 × 10

5) foram semeadas em cada poço e cultivadas em placas de 6 poços e, em seguida, infectadas com um vector lentiviral de controlo negativo (Genechem, Xangai, China) ou o vector lentiviral transportando STAT3 shRNA a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 40. Após três dias, as células foram sujeitas a

vivo

ensaio de invasão.

quantitativo em tempo real inverter reacção em cadeia de polimerase (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado a partir de células SW1990 parental e SW1990 vector de controlo negativo ou STAT3 infectados por vectores utilizando o reagente Trizol de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). O RNA foi então purificado usando um kit RNeasy Mini de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Após quantificação, 1 ug de ARN total de cada amostra foi sujeito a síntese do ADNc da primeira cadeia, utilizando um kit PrimeScript RT Reagente (Takara Bio Inc., Shiga, Japão) a 37 ° C durante 15 min e 85 ° C durante 5 s.

qPCR foi então realizada para detectar expressões de genes com estes cDNA recém-sintetizado. Os iniciadores específicos para a reacção de PCR foram os seguintes: MMP-9, 5′-CGGAGTGAGTTGAACCAG-3 ‘(directo) e 5′-GTCCCAGTGGGGATTTAC-3′ (inverso) com um tamanho de produto de 118 pb; MMP-7, 5’-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3 ‘(directo) e 5′-AAATGCAGGGGGATCTCTTT-3′ (inverso) com um tamanho de produto de 169 pb; IL1-β, 5’-CTGAGCTCGCCAGTGAA-3 ‘(directo) e 5′-GGTCTGTGGGCAGGGAA-3′ (inverso) com um tamanho de produto de 239 pb; bFGF, 5’-AGAGCGACCCTCACATCAAG-3 ‘(directo) e 5′-TCGTTTCAGTGCCACATACC-3′ (inverso) com um tamanho de produto de 224 pb; IgTα7, 5’-GCGGCCACTCGGTCTGTGTGGAC-3 ‘(directo) e 5′-GGAGACTGTAGGACAAGGTCAC-3′ (inverso) com um tamanho de produto de 303 pb; p-actina, 5’- TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3 ‘(directo) e 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’ (inverso) com um tamanho de produto de 294 pb. qPCR amplificações foram realizadas utilizando o motor Opticon Sistema de DNA (Bio-Rad, cidade Foster, CA, EUA) com SYBR Premix Ex Taq (Takara). Especificamente, 1 ul de mistura de reacção de transcrição reversa foi utilizado para uma reacção de PCR quantitativa num volume total de 20 ul. ciclos de PCR foram 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 s. Estes dados foram então analisados ​​de acordo com o método Ct comparativo e os níveis de expressão normalizado para p-actina em cada amostra. níveis de expressão relativa de genes alvo, após a normalização com uma sequência endógena, foram dadas por 2

-ΔΔ

Ct

.

Nós também realizou experimentos matriz de PCR em um RT

2 Profiler Tumores Humanos Metástase PCR array (HAP-028A) de SuperArray Bioscience (Frederick, MD, EUA). Esta matriz contém 89 genes e cinco genes “housekeeping”, em uma placa de 96 poços. Utilizamos esta matriz para detectar knockdown da expressão do gene mediada por STAT3 de acordo com o protocolo do fabricante. Cada reacção incluídos 40 ng de ARN total e os controlos negativos apropriados (sem transcrição reversa e sem molde). As amostras foram analisadas em triplicado, e os dados foram normalizados para níveis de GAPDH utilizando o método ΔΔCt.

Extracção de proteínas e Western immunoblot

As células foram lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (Beyotime, Haimen, Jiangsu, China) contendo 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetano-sulfonilo em gelo durante 15 min. A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime). Os lisados ​​foram então misturadas com tampão SDS-PAGE de carregamento de amostra e fervida durante 5 min. 30 ^ g de proteína celular total foi, em seguida, resolvido em 8% ou 10% de géis de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram depois coradas com 0,5% de Ponceau S a contendo 1% de ácido acético, a fim de avaliar a igualdade de carga e eficiência de transferência. As membranas foram então bloqueadas em 5% de leite desnatado durante a noite bovino e com o anticorpo primário durante 4 h à temperatura ambiente. Após lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS), as membranas foram ainda incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase durante 1 h à temperatura ambiente. Para detectar as bandas de proteína positivas, utilizou-se o reagente de quimioluminescência aumentada da Millipore (Billerica, MA, EUA). Os anticorpos primários foram os seguintes: MMP-7 a partir de R D Systems (Minneapolis, MN, EUA) a uma concentração de 2 ug /ml, MMP-9 a partir de Epitomics (Burlingame, CA, EUA) a uma diluição de 1:2000 , bFGF, IL1-β e IgTα7 da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA) a uma diluição de 1:200, STAT-3 a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) a uma diluição de 1:1000; e β-actina de Biomart (Xangai, China), a uma diluição de 1:1000. anticorpos secundários incluíram conjugado com peroxidase AffiniPure de cabra anti-rato ou IgG anti-coelho de Jackson ImmunoResearch (West Baltimore Pike West Grove, PA, EUA).

experimentos nua de rato

de seis semanas de idade SPF grau do sexo masculino ratinhos nus BALB /c foram adquiridos a partir do Instituto de Zoologia da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Estes ratos foram alimentados com uma dieta padrão para roedores e água

ad libitum

em uma sala de fluxo laminar asséptica com 60% a 70% de umidade a 25 ° C. Duas semanas após a chegada, 50 ul de soluções celulares (contendo 2 x 10

6 células tumorais fase logarítmica de crescimento) foram injectados na almofada da unha dos murganhos por via subcutânea. Os ratinhos foram então observados diariamente para o consumo da dieta, fezes e estado mental, e o tamanho do tumor e peso corporal foram medidos a cada cinco dias. O comprimento e a largura do tumor foram medidos com compassos de Vernier e calculado utilizando uma fórmula do volume do tumor = comprimento x largura

2 × 0,5. O uso de animais neste estudo compila com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (licença # SYXK2009-0086).

Imunocitoqu�ica e imunohistoquímica

As células tumorais cultivadas em lamelas de vidro foram lavadas com PBS, em triplicado, e fixada com 4% de formaldeído. A actividade da peroxidase endógena das células foi bloqueado com peróxido de hidrogénio a 3%. As lamelas foram então incubadas com 1% de albumina de soro bovino em PBS durante 1 h à temperatura ambiente e com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com um anticorpo secundário durante 30 min. As lamelas foram depois contrastadas com hematoxilina solução.

Para coloração imuno-histoquímica, 4 uM secções foram cortadas a partir de blocos de tecido embebidos em parafina fixados com formalina e em seguida, desparafinados em xileno e re-hidratadas em lavagens sucessivas de etanol. As secções foram, em seguida, aquecida num forno de microondas a potência média durante 8 minutos em tampão citrato, pH 6,0 para a recuperação de epítopo induzida pelo calor. As secções foram submetidas ao bloqueio da actividade da peroxidase endógena e de ligação não específica do anticorpo primário e, em seguida, segmentados localização de proteínas com o primeiro anticorpo e a visualização com o anticorpo e a cor da reacção secundária, tal como descrito acima.

os anticorpos primários

incluiu: MMP-7 a partir de R D Systems, a uma concentração de 10 ug /ml; colagénio IV ou PECAM-1 de Bioworld Tecnologia (Louis Park, MN, EUA) a uma diluição de 1:100. Os anticorpos secundários foram de cabra anti-rato ou IgG anti-coelho conjugado com peroxidase de DAKO EnVision (Dako Corp., Carpinteria, CA).

células tumorais coradas e secções de parafina foram revistos e registados com um microscópio de luz por um patologista cegos ao grupo de tratamento. A positividade de células de tumor coradas em lamelas e secções de parafina foram definidos pela intensidade de coloração e a% de células de tumor: a intensidade de coloração da MMP-7 de expressão foi classificada em semiquantitativamente negativa e fraca, moderada, e fortemente positiva (0, +, ++ e +++, respectivamente). No nosso estudo, a expressão do gene foi considerada positiva se a intensidade da coloração foi moderada ou forte e a percentagem de células coradas positivas eram 20%. No entanto, a densidade de microvasos coloração positiva para PECAM-1 foi definida como positiva em 400 o poder de um campo de microscópio como descrito anteriormente [15].

Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 12,0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). Os dados foram resumidos como média ± DP, quando possível, e analisadas usando um teste de Student-Newman-Keuls para determinar a significância estatística. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Knockdown de expressão STAT3 usando STAT3 shRNA

Para demonstrar o papel da STAT3 em câncer pancreático, realizamos experimentos gene knockdown usando. STAT3 shRNA em células SW1990. Nós determinamos que STAT3 shRNA bateu com sucesso para baixo expressão STAT3 em células SW1990, ou seja, os dados qRT-PCR mostrou que STAT3 shRNA vector inibiu a expressão do mRNA STAT3 em comparação com vetores de controle (

P

= 0,004), enquanto os dados inmunotransferência mostrou a proteína STAT3 foi marcadamente inibida em células SW1990 STAT3 shRNA-transfectadas (

P

= 0,003) (Figura 1).

a, qRT-PCR. células SW1990 estáveis ​​STAT3 shRNA e de controlo transfectadas com vector e células SW1990 parentais foram cultivadas e o ARN foi isolado para análise de qRT-PCR da expressão de ARNm de STAT3 *

P

0,01 comparado com as células transfectadas com vector de controlo ou SW1990. B, Western immunoblot. Estas células foram cultivadas para a extração de proteína total celular e immunoblot ocidental análises da expressão da proteína STAT3.

Supressão do crescimento e invasão das células SW1990 STAT3 shRNA-transfectadas em ratinhos nus

Nós injetamos knockdown STAT3 ou de controlo células estáveis ​​para o pad prego de ratos nus. 10 dias após a inoculação do tumor, verificou-se que a taxa de crescimento das células tumorais silenciados-STAT3 foi reduzida significativamente (Figura 2). Também descobriram que a expressão de proteína de colágeno IV em torno das células tumorais em tumores de controle estava incompleta e descontínua, ao passo que era completa e contínua em tumores de células SW1990 silenciou-STAT3 seguintes coloração imuno-histoquímica (Figura 3A B). capacidade de invasão das células do tumor foi detectado em xenoenxertos de tecido em HE por microscópio de luz. Além disso, a invasão do tumor para dentro do vaso e músculo foi mais frequente nos tumores de controle do que tumores silenciou-STAT3 (Figura 4). A percentagem de vasos e músculo invasão por tumores silenciados-STAT3 foi de 22,22% (09/02) e 33,33% (09/03) contra 60% (10/06), 80% (10/07) e 70% (7 /10), 80% (8/10) de tumores em SW1990 e tumor de controlo negativo, respectivamente. densidade de microvasos foi significativamente menor nos tumores silenciou-STAT3 do que os tumores dos pais ou de controlo de células SW1990 (

P

= 0,007 e

P

= 0,021, respectivamente; Figura 5). Estes dados indicam que a STAT3 desempenha um papel crucial na regulação do crescimento do tumor, invasão, angiogénese e.

vector parental ou de controlo e células SW1990 STAT3 shRNA-transfectadas foram cultivadas em cultura de células e injectado nas almofadas de unhas ratinho nu . O volume do tumor foi medido cada cinco dias até 30 dias após a inoculação de células tumorais .. *

P

. 0,05 comparado com o vector de controlo ou tumores parentais

Os xenoenxertos de tumor a partir de vetor de controle e as células STAT3 shRNA-transfectadas foram submetidos a coloração imuno-histoquímica de proteína de colágeno IV. Estes dados sugerem que a expressão de colagénio IV (seta vermelha) é completa e contínua no tumor STAT-3-silenciados (A), no entanto a integridade de colagénio IV foi destruído evidenciado por (seta vermelha) incompleta e descontínua coloração (B). × 400 ampliação.

Estas xenotransplantes nua de rato foram retirados de tecidos processados ​​para coloração HE. A e B, 400 x de ampliação, C e D, 100 x de ampliação. invasão de células tumorais no microvasos é frequente em tumores Controle de Vetores (marcado a seta vermelha na A), mas não é óbvio em tumores silenciou-STAT3 (B). O músculo foi invadida e destruída (seta preta) pelas células tumorais (seta vermelha) de células SW1990 em C, mas a fronteira é clara entre muscular (seta preta) e tumor (seta vermelha) em D.

as secções de tecido de xeno-enxertos de ratinho nu foram corados para imuno-histoquímica com o anticorpo anti-PECAM-1. microvasos em tumores positivos foram contadas sob um microscópio e resumidos 1-PECAM. O número de microvasos foi 13,00 ± 2,36 por campo de alta potência (N = 9) em tumores silenciou-STAT3 em comparação com 16,30 ± 2,45 (N = 10) nos tumores SW1990 parentais e 15,80 ± 2,57 (N = 10) em tumores de controlo do vector . Essas diferenças foram estatisticamente significativas. * P 0,01 vs. tumores SW1990 parentais, ** P . 0,05 vs. os tumores vetor de controle

A expressão de genes de invasão tumoral e metástase seguinte STAT3 knockdown

Nós determinado gene expressão nestes tumores para baixo-batendo STAT3 usando uma metástase de tumor humano matriz PCR (# HAP-028A) a partir SuperArray Bioscience. dados de matriz de PCR sugerem que três genes, isto é, MMP-7, IL-1β e IgT7α, foram regulados negativamente (por redução de 2,54 vezes, 23,90 vezes e 5,39 vezes, respectivamente) em tumores silenciados-STAT3 em comparação com o controlo e tumores SW1990 parentais. No entanto, oito genes foram regulados positivamente,: SYK (3,38 dobras), MYCL1 (4,85 dobras), MMP-11 (4,59 dobras), MMP-3 (10,88 dobras), MMP-10 (19.93 dobras), CST-7 (3,34 dobras ), CDH11 (2,01 dobras) e IL-8Rβ (7,06 dobras).

Redução de expressão de mRNA e proteína MMP7 em tumores silenciados-STAT3

Nós validado dados das experiências de matriz e executou adicional análises utilizando qRT-PCR (Fig 6A . S1) e imunotransferência western (Figura 6B) e descobriu que a MMP-7, MMP-9, a expressão de ARNm foi significativamente diminuída em tumores silenciados-STAT3 em comparação com tumores parentais e de controlo (

P = 0,033

e

P

= 0,002

vs.

SW1990, respectivamente, ou

P

= 0,0001 e

P

= 0,011

vs.

tumores de controlo, respectivamente). a expressão de ARNm de IL-1β também foi significativamente reduzida nos tumores silenciados-STAT3 em comparação com tumores parentais e de controlo (

P

= 0,01 e P = 0,0001

vs.

SW1990 e tumores de controlo, respectivamente). No entanto, não houve diferença significativa na expressão de ARNm de bFGF ou IgT7α entre os tumores silenciados-STAT3 ou controlos (Fig. 6A). MMP-7 de expressão ao nível da proteína foi marcadamente suprimida em tumores silenciados-STAT3, no entanto MMP-9 não foi significativamente afectada (Figura 6B).

A, qRT-PCR. O ARN foi isolado a partir de xenoenxertos de tumor e submetidos a análises qRT-PCR. B, Western blot. proteína celular total foi extraído a partir dos xenoenxertos nua de rato e submetidos a análises Western blot. **

P Art 0,01; *

P

. 0,05 em comparação com o vector de controlo ou tumores parentais, respectivamente

Redução da expressão de MMP-7 em células tumorais STAT3-silenciadas e xenotransplantes

para confirmar os dados acima, foi realizada sobre as células imunocitoquímica STAT3 knockdown e xenoenxertos de ratinho nu. Os nossos dados sugerem que as células SW1990 silenciados-STAT3 ou xenoenxertos expressaram níveis mais baixos de proteína MMP-7 no citoplasma em comparação com as células e xenoenxertos (Figura 7) parentais e de controlo, o que é consistente com o sistema de retenção invasão em xenoenxertos de ratinho nu. Estes dados indicam que a regulação STAT3 da capacidade de invasão das células de câncer de pâncreas é associado com a regulação negativa da MMP-7 de expressão.

As células tumorais de células SW1990 silenciou-STAT3 parental, controle de vetores e foram cultivadas em monocamada ou em nu ratos. As células em monocamada e xenoenxertos de tumor foram então submetidos a imuno-histoquímica e imunocitoquímica de coloração da proteína MMP-7. , células A parentais; B, células silenciou-STAT3; C, tumores parentais; D, os tumores silecnced-STAT3. X 400 de ampliação. seta vermelha, as células tumorais.

Discussão

STAT3 shRNA bateu com sucesso para baixo expressão de mRNA STAT3 e proteína em células SW1990 em comparação com células de controlo SW1990 transfectadas com vector. então nós injectados por via subcutânea o vetor de controle e células SW1990 STAT3 shRNA-transfectado em ratos nus. Os nossos dados sugerem que a taxa de crescimento das células tumorais silenciados-STAT3 em ratinhos nus foi significativamente reduzida em comparação com células de controlo de vector. A invasão tumoral para o recipiente e muscular foi menos frequente em tumores silenciados-STAT3 do que nos tumores de controlo. Expressão de proteína de colagénio IV em torno das células tumorais estava completa e contínua em tumores de células SW1990 silenciados-STAT3, enquanto a expressão de colagénio IV estava incompleta e descontínua no interior dos tumores de controlo. Além disso, a densidade de microvasos foi significativamente menor nos tumores silenciados-STAT3 do que os tumores parentais e de controlo de células SW1990. Ao nível molecular, a expressão de MMP-7 foi reduzida em tumores silenciados-STAT3 em comparação com o controlo e xenoenxertos SW1990 parentais. Os dados do estudo indicam claramente que STAT3 desempenha um papel crucial na regulação do crescimento do tumor, invasão e angiogênese.

No entanto, não encontramos alterações significativas na MMP-9 expressão da proteína, embora a expressão de MMP9 ARNm foi reduzida. A razão para esta discrepância pode ser devida à inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP-1) diminuiu quando STAT3 silenciamento levou a MMP-9 aumenta, o que a diminuição da expressão de ARNm de MMP9 através de feedback negativo [16], [17]. Além disso, nossos dados atual também sugere algumas discrepâncias entre matriz PCR e os dados qRT-PCR. Com efeito, uma matriz de PCR é uma técnica utilizada para investigar a expressão diferencial de genes alvo ao nível do ARNm, com elevado rendimento, a sensibilidade e especificidade. No entanto, estes dados sempre precisam de ser confirmados utilizando qRT-PCR, algumas das quais pode ser verificado (confirmado), utilizando qPCR. Esta razão pode ser devido ao desenho do iniciador e dificuldade em controlar a temperatura de recozimento levando a amplificações não específicas na matriz de PCR. Assim, os dados de qRT-PCR pode ser mais específico e fiável. Embora tenhamos mostrado alguns genes que foram upregulated após o silenciamento da expressão STAT3, nós gostaríamos de enfatizar os genes que foram reprimidos seguinte silêncio STAT3 no estudo atual.

STAT3 é um fator chave de transcrição que é oncogénico em humanos células [18], [19]. A cinase de Janus (JAK) /sinalização STAT3 desempenha um papel importante na regulação do crescimento e diferenciação celular e invasão de tumores e metástases em diversos cancros humanos [20] – [22]. No câncer de pâncreas, estudos recentes demonstraram ativação inapropriada e constitutiva da STAT3 [23], [24]. Em um estudo anterior pelo nosso grupo, nós informamos down-regulação da expressão STAT3 suprimida capacidade de invasão das células de câncer de pâncreas

in vitro

[7]. Neste estudo, verificou-se que o silenciamento da expressão STAT3 suprimiu o crescimento do tumor e invasão ea densidade microvascular em camundongos nus. Estes dados são consistentes com um anterior

ex vivo

estudo [25], onde os autores demonstraram que a expressão de STAT3 fosforilado no carcinoma gástrico humano significativamente correlacionada com a invasão tumoral e prognóstico

ex vivo

.

estudos anteriores por outros nós e demonstraram que a densidade de microvasos aumentou-STAT3 pode ser devido à indução da expressão de VEGF STAT3 [7], [26]. Outro estudo também forneceu evidências de que supressão de invasão e metástase por STAT3 knockdown dependia VEGF down-regulação das células cancerígenas do cólon [27]. Além disso, a diminuição da expressão da MMP-2 é uma das principais razões para a supressão de invasão de células tumorais e metástases seguinte silenciamento de expressão STAT-3 em melanoma humano [5]. As MMPs têm um papel importante na invasão de células de tumores e metástases por a degradação dos componentes da membrana basal e da matriz extracelular [28] – [30]. Um número cada vez maior de estudos indicam que certas proteínas de MMP são alvo de STAT3 [31], [32]. Xie et ai determinado que a activação da STAT3 promovido invasão de células de melanoma através da regulação da transcrição de genes MMP-2 [33]. Além disso, a MMP-1 e MMP-9 foram encontrados para ser regulada por STAT3, que desempenha um papel crucial na invasão tumoral e metástase [34], [35]. No presente estudo, mostramos que knockdown de expressão STAT3 diminuiu MMP-7 de expressão em células de cancro do pâncreas e xenotransplantes nu do rato. MMP-7 é a menor proteína da família MMP, mas possui a mais elevada de matriz extracelular (ECM) -degradative actividade contra uma variedade de componentes da matriz extracelular; Assim, é capaz de desencadear a activação de uma cascata de MMP e está relacionada de perto com a invasão tumoral e metástase [36] – [39]. No cancro do pâncreas, MMP-7 tem sido mostrado para ser envolvido na dissociação de células de tumor a partir do local de origem e, subsequentemente, aumentar a capacidade de invasão [40], [41]. Outros estudos têm sugerido que a MMP-7 poderia ser um alvo direto de STAT3 em células de câncer gástrico e da mama [42], [43], o que é consistente com a nossa conclusão em células de câncer de pâncreas.

No estudo atual , utilizamos o modelo de mouse pad prego nu em vez do modelo de rato flanco nu rotina de células tumorais. A vantagem do modelo do rato do prego é que este modelo de teste que não apenas a capacidade de invasão de células tumorais para o recipiente e do músculo, mas também um determinado método de linfa inguinal nodos metástases de células tumorais. No entanto, o modelo de tumor ortotópico é o melhor para detectar a invasão e metástase de células tumorais capacidade. Em câncer pancreático, enfrentamos várias dificuldades, incluindo a técnica de injetar células tumorais para o pâncreas, a cirurgia induzindo alta mortalidade, e a incerteza de invasão tumoral e metástases (diferentes dos tumores primários no pâncreas). Neste contexto, o modelo mouse pad prego nu é fácil e confiável. Estes dados atuais sugerem que STAT3 knockdown alterou significativamente a capacidade de invasão das células do câncer de pâncreas, sem quaisquer tumores metastáticos nos nódulos linfáticos de ambos os grupos experimental e controle. Isto pode ser devido ao período de tempo dos ensaios (30 dias). Este estudo também demonstrou os efeitos da STAT3 knockdown em células de câncer de pâncreas

in vivo

, que confirmou os nossos

in vitro

dados anteriores que STAT3 desempenha um papel importante na promoção do crescimento tumoral, invasão e angiogênese , enquanto a supressão da expressão da STAT3 inibiu pancreático crescimento de células cancerosas, angiogénese, invasão e. Estas funções de STAT3 pode actuar através da regulação dos seus genes a jusante, incluindo cyclinD1, Bcl-2, VEGF, e MMP-2, todos os quais foram mencionados em estudos anteriores [26], [44], [45]. No estudo nosso, nós achamos que a inibição STAT3 pode reduzir a expressão de MMP-7 em células de câncer de pâncreas. Estudos futuros deverão centrar-se sobre se o silenciamento da expressão STAT3 usando STAT3 shRNA ou seu inibidor, tal como tirosina quinase não receptora é útil como um romance terapia adjuvante à quimioterapia para pacientes com câncer pancreático.

Informações de Suporte

Figura S1 . análise

qRT-PCR de SYK, MYCL1, MMP-11, MMP-3, MMP-10, a CST-7, CDH11 expressão, e IL-8Rβ em xenoenxertos de ratinho nu. O ARN foi isolado a partir de xenoenxertos de tumor de rato e submetidos a análise de qRT-PCR. Os dados mostraram que a expressão de MYCL1, MMP-3, MMP-10 e IL-8Rβ foi regulado para cima, mas SYK foi regulada para baixo em tumor STAT3 silêncio em comparação com o vector de controlo ou tumores parentais. Em contraste, a expressão de CST-7, CDH11, MMP-11 ARNm houve diferença em cada amostra de tumor

doi:. 10.1371 /journal.pone.0025941.s001

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