Abstract

As propriedades mecânicas das células têm sido reconhecidos como um biomarcador para celular organização do citoesqueleto. Como tratamentos químicos levar a rearranjos do citoesqueleto da célula, assim, as modificações das propriedades mecânicas celulares, investigando variações de propriedade mecânica celulares fornece conhecimento perspicaz para efeitos de tratamentos químicos em células cancerosas. Neste estudo, os efeitos de oito diferentes fármacos anti-cancerígenos nas propriedades mecânicas de células de cancro da próstata humana (PC-3) são investigadas utilizando um protocolo recentemente desenvolvido nanoindentação medição baseado em controlo (FCC) em microscópio de força atómica (AFM). O protocolo CNM ultrapassa os limites de outros métodos existentes no líquido de medição nanoindentação de células vivas em AFM, em particular para a medição das propriedades mecânicas de células vivas. módulo de células PC-3 tratadas pelas drogas oito de Young foi medido por diferentes taxas de carregamento da força ao longo de três ordens de magnitude, e em comparação com os valores do controlo. Os resultados mostraram que o módulo das células PC-3 de Young aumentou substancialmente pelos oito drogas testadas, e tornou-se muito mais pronunciada à medida que a taxa de carga de força aumentada. Além disso, duas tendências distintas foram claramente expressas, onde, sob o tratamento de Disulfiram, paclitaxel, e MK-2206, o coeficiente exponencial da função módulo por frequência permaneceu quase inalterada, enquanto que com Celebrex, BAY, Totamine, TPA, e ácido Vaproic, a taxa exponencial foi significativamente aumentada

Citation:. Ren J, Huang H, Liu Y, Zheng X, Zou Q (2015) Um microscópio de força atômica estudo revelou dois mecanismos no efeito da Anticancer Drugs on Rate-Dependent Módulo de young de células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 10 (5): e0126107. doi: 10.1371 /journal.pone.0126107

Editor do Academic: Etienne Dague, LAAS-CNRS, França |

Recebido: 03 de outubro de 2014; Aceito: 30 de março de 2015; Publicado em: 01 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ren et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela NSF concessão concessão de CARREIRA CMMI-1066055 (https://www.nsf.gov/awardsearch/showAward?AWD_ID=1066055) e Grant IDBR (DBI- 1353890) (https://www.nsf.gov/awards/award_visualization_noscript.jsp?org=CMMI®ion=US-NJ instId=0026294000).

Competing interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As propriedades mecânicas de células vivas são conhecidos por estar estreitamente relacionado com estágio de crescimento das células e funcionalidade.. As alterações nas propriedades mecânicas têm sido reconhecidos como um indicador de modificações patológicas de células [1-3] e, assim, podem servir como um biomarcador para eventos fenotípicas celulares, por exemplo, as associadas com a adesão celular e organização do citoesqueleto [4-6]. Em particular, como uma resposta ao ambiente e /ou variações estado mecânico, citoesqueleto da célula sofre rearranjos dinâmicos, que, em troca, induz ainda alterações às propriedades mecânicas celulares [7]. Por isso, estudos de propriedades mecânicas das células contribui para uma melhor compreensão das respostas das células de tratamentos químicos, incluindo tratamentos com drogas de células de cancro. Tem sido relatado que as doenças tais como cancros alterar as propriedades mecânicas das células [1, 8, 9], e inversamente, as variações das propriedades mecânicas de células de cancro causados ​​por fármacos anti-cancerígenos possam ser empregues para avaliar a eficácia destas substâncias químicas [10 , 11]. Investigações das propriedades mecânicas das células cancerosas podem ainda ajudar a desvendar os mecanismos físicos envolvidos no desenvolvimento do câncer, progressão e metástase. Portanto, o estudo das propriedades mecânicas celulares torna-se um componente indispensável e fundamental no desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e diagnóstico de câncer.

Microscópio de Força Atômica (AFM) tornou-se uma ferramenta poderosa para estudar as propriedades mecânicas de células vivas única devido à sua capacidade única na aplicação de estímulos de força e, em seguida, medir a resposta em locais específicos em um ambiente fisiologicamente amigável com força piconewton e nanômetros resoluções espaciais [8, 12]. Especificamente, a AFM tem sido utilizada para investigar a evolução das propriedades mecânicas celulares provocadas por anormalidades celulares (e.g., cancros) e os tratamentos químicos em células cancerosas [7, 8]. Por exemplo, verificou-se que o módulo de células epiteliais humanas cancerosas da jovens tendem a ser substancialmente menor do que os normais [3], o módulo de Young de células de cancro da mama aumenta monotonicamente com o aumento da taxa de carga de força [8], e após tratamento medicamentoso F-interrompendo-actina, o módulo elástico médio de células de fibroblastos diminuiu nitidamente [10]. No entanto, esses estudos [3, 8, 10] têm sido limitados a medir o comportamento mecânico celular estática em regiões de baixa frequência (com taxa de carga de força abaixo de 5 Hz) e amplitudes da força pequenos (abaixo de 2 nn). Os comportamentos dinâmicos mecânicas de células cancerosas em regiões de frequência mais elevada, e os efeitos de tratamentos químicos sobre o comportamento viscoelástico dependente da frequência de células cancerosas são em grande parte desconhecido. Como tratamentos químicos levar a rearranjos dinâmicas do citoesqueleto da célula e, desse modo, a evolução dinâmica das propriedades mecânicas de células [7, 10], a evolução de comportamentos mecânicos dinâmicos de células cancerosas fornecem informações detalhadas para anticâncer desenvolvimento de medicamentos.

Estudos das propriedades biomecânicas dependente da frequência de células vivas têm sido limitados pela capacidade de técnicas atuais de medição mecânico AFM. Especificamente, o limite surge em grande parte devido ao método de medição de corrente à indentação na AFM, subtraindo a deflexão cantilever a partir da base cantilever deslocamento [8, 13]. erros significativos e incertezas são induzidos no cavado medida como a aceleração da sonda (em relação à ponta fixa do braço de suporte ligado ao scanner piezoeléctrico) é ignorado e o ponto de contacto inicial é, em grande medida incerta [8, 13-15]. Em particular, o efeito de aceleração da sonda é pronunciado e aumenta substancialmente quando a frequência de medição aumenta. Embora o método de força-modulação tem sido utilizada para medir a viscoelasticidade de células vivas [16, 17] em função da frequência, aumentando a oscilação sinusoidal para a carga /descarga perfil da força de taxa constante, o efeito de aceleração da sonda é completamente ignorado, e existem grandes incertezas no recuo medidos na região de frequência relativamente elevada [14, 18]. Além disso, tal abordagem é ainda limitada pela bastante pequena amplitude da força dinâmica aplicada (dezenas de Newtons PECO) aplicadas-que, para interrogar uma variedade de respostas biológicas da célula, a força de excitação de muito maior amplitude tem de ser aplicada como o propriedades mecânicas de células vivas são amplitude dependentes [19, 20]. Finalmente, o método de força modulação requer a força oscilatória para ser repetitivamente aplicada no mesmo local a cada taxa de medição seleccionada na gama de frequência medido. No entanto, para as células vivas tal procedimento seja prejudicial como o repetitivo, força do mesmo local de esforço tende a deformar e até mesmo danificar a membrana celular. Também foi proposto estudar as características mecânicas de células vivas pela quantificação da rigidez efetiva, utilizando uma técnica de modulação força magnética na AFM [15]. Um tal método, contudo, não só requer uma preparação de amostra /equipamento adicional (por exemplo, o uso de um suporte de alumínio em casa construída com graxa de vácuo para montar a amostra), mas também não se quantificar a rigidez da célula (isto é, o módulo de Young) directamente [15] -Quantification de módulo de Young requer uma medição precisa do recuo. Uma vez que os estímulos força aplicada e a reentrância correspondente gerado ato como, respectivamente, a entrada e saída para o modelo de interacção cantilever sonda-amostra, o erro na medição de recuo conduz directamente para que na propriedade mecânica quantificados, independentemente do modelo de interacção sonda-amostra empregue . Assim, é essencial para medir com precisão o recuo em estudos mecânicos de células vivas.

Neste estudo, o efeito de compostos anti-cancerígenos químicos sobre as propriedades mecânicas dinâmicas de células de cancro da próstata humana (PC-3) é investigada utilizando um protocolo desenvolvido recentemente nanoindentação medição baseado em controlo (FCC) [14]. Oito medicamentos distintos, incluindo dissulfiram (DSF), o paclitaxel (Taxol) tomatina,, BAY 11-7082 (BAY), ácido vaproic (APV), 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), celecoxib, e MK-2206 (MK) são testados. Embora os estudos mostraram que os efeitos anti-cancerígenos destes fármacos, por exemplo, a inibição do proteassoma e processo de apoptose de células cancerosas da mama induzidos por DSF-um fármaco bem conhecido para o tratamento de alcoolismo [21], exames experimentais destes compostos químicos, como medicamentos anticancerígenos estão em curso e muitas questões permanecem sem resposta. Portanto, estudar as dinâmicas alterações de propriedade mecânicas de PC-3 células tratadas por estes oito medicamentos podem fornecer respostas interessantes para as atividades anticancerígenas destes compostos químicos.

O protocolo CNM [14] supera os limites de métodos existentes para medição de recuo em-líquido de amostras macias no AFM. Pelo protocolo CNM, o recuo na célula viva é medida seguindo o

mesmo perfil força de excitação (ou seja, a mesma deflexão cantilever) em ambas as células vivas e um disco de referência, e depois quantificado pela deslocação diferença da extremidade fixa cantilever sobre estas duas amostras. A principal vantagem do protocolo CNM é que usando uma referência duro e mais criticamente, rastreando com precisão o mesmo perfil de força em ambas as amostras, o efeito adverso dominante da aceleração cantilever é completamente removido sem a necessidade de calibração parâmetro [14, 18 ]. Além disso, o efeito de força hidrodinâmica é substancialmente reduzida, particularmente às taxas de carga de alta força (por exemplo, reduzida em mais de 50% quando a taxa de carga de força é maior do que 100 Hz). Neste estudo, o módulo de células PC-3 a taxa dependente de Young foi quantificado utilizando o protocolo CNM variando a carga /descarga taxa da força de excitação ao longo de três ordens de grandeza de 0,2 Hz a 100 Hz, com a amplitude recuo medido ao longo de dois pedidos maiores do que a amplitude de oscilação em [16].

Materiais e Métodos

cultura celular e tratamento

PC-3 células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC , Rockville, MD, EUA), e cultivadas em meio de cultura RPMI-1640 contendo FBS a 10% que foi suplementado com penicilina (100 unidades /ml) -streptomycin (100

μ

g /ml) e L-glutamina (300

μ

g /ml). As células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora e passadas duas vezes por semana. Para acomodar as medidas de AFM, as células PC-3 foram inoculadas a uma densidade de 2,0 x 10

4 células /ml em placas de cultura de tecidos de 60 mm (5 ml /placa) e incubadas durante 24 hpurs. Em seguida, as células em cada prato foram então tratadas com DMSO solvente (2

μ

l /ml) ou com cada um dos oito drogas dissolvidas em DMSO, durante 24 horas antes das medições de AFM.

MTT ensaio

células PC-3 foram inoculadas a uma densidade de 2,0 x 10

4 células /ml de meio em placas de 96 poços (0,2 ml /poço) e incubou-se durante 24 h. As células foram então tratadas com os diversos agentes anti-cancro durante 72 h. Após o tratamento, 200

μ l

3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazoliumbromide (5 mg /ml em PBS) foi adicionado a cada poço da placa e incubada durante 2 h. Após remoção cuidadosa do meio, 0,1 mL de DMSO foi adicionado a cada poço. A absorvância foi registada num leitor de microplacas a 540 nm. O efeito de diferentes agentes anticancerígenos sobre a viabilidade celular foi avaliada como percentagem de viabilidade, em comparação com as células tratadas com DMSO

Imunofluorescência

imunofluorescência foi usada para determinar

β

. – actina em células PC-3. Resumidamente, as células PC-3 foram inoculadas a uma densidade de 2,0 x 10

4 células /ml de meio em placas de cultura de 60 mm e incubou-se durante 24 h. As células foram então tratadas com MK ou Celebrex durante 24 h. Em seguida, as células foram fixadas em acetona /metanol (1: 1) durante 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com

-actina β

anticorpo (SC-47778, Santa Cruz Biotech Inc., Dallas, TX) durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo de ratinho de cabra conjugado com vermelho do Texas anti (115-075-003, Jackson ImmunoRsearch Lab Inc, West Grove, PA) durante 60 min à temperatura ambiente. imunofluorescência foi examinada usando um microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse TE200, Nikon Inc.).

Chemicals

A-1640 RPMI meio de cultura de tecidos, penicilina-estreptomicina, L-glutamina e soro fetal de bovino (FBS) foram adquiridos de Gibco (Grand Island, NY). Entre as oito diferentes drogas testadas neste estudo, dissulfiram (DSF), o paclitaxel (Taxol), tomatina, BAY 11-7082 (BAY), ácido vaproic (VPA), e 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) eram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), e celecoxib e MK-2206 (MK) foram fornecidos pelo repositório do National Cancer Institute.

baseada em Controle Medidas Elasticidade

o recentemente -desenvolvida protocolo CNM [14, 18, 22] foi utilizado para medir o módulo e frequência dependente módulo complexo de Young dependente da taxa de células EA.hy926. A questão central é medir o recuo na célula viva com precisão, especialmente durante a alta velocidade e /ou medições nanomechanical de banda larga. Com base na análise da dinâmica cantilever durante a medição nanoindentação, o protocolo CNM obtém o recuo na célula viva, Δ

Z

(

t

), como a diferença de a deslocamento da base de cantilever (isto é, a extremidade fixa do braço de suporte) na célula,

Z

BS

(

t

), e que num disco amostra de referência (por exemplo, uma amostra de silício),

z

bh

(

t

) [14], (1)

A acima recuo quantificação requer que o

mesmo perfil força de excitação (ou seja, o mesmo braço de suporte de deflexão trajectória) é controlado com precisão em ambas as amostras. Os leitores são referidos Ref. [16] para mais informações sobre o protocolo CNM.

Para garantir o acompanhamento precisão do mesmo perfil de força de excitação tanto na célula viva ea referência duro, o protocolo CNM utiliza técnicas de controle de aprendizagem interativos, por exemplo, a modelagem controle de aprendizagem interactivo baseado em inversão (MIIC) -livre técnica [23]. Especificamente, a entrada de controle aplicado para conduzir o AFM

z

-axis atuador piezo é obtido através de iteração da seguinte forma: (2) onde “

jco

‘denota transformada de Fourier.

d

d

(⋅) é a deflexão cantilever desejado,

α

é uma constante, e

u

k

(⋅) e

d

k

(⋅) é a tensão de entrada atual para o atuador AFM piezo ea deformação cantilever no

k

th

iteração, respectivamente. A entrada de controle

u

k

(

t

) é obtida tomando transformada de Fourier da entrada e os sinais de saída e aplicando o MIIC algoritmo Eq 2, e, em seguida, a transformada de Fourier inversa transformar depois. O algoritmo de MIIC também tem sido utilizado para obter uma medição rápida nanomecânico banda larga de polímeros em ar recentemente [24, 25].

microscópio de força atómica

módulo das células PC-3 de Young foi medido em o meio de cultura de células utilizando um Dimensão Ícone AFM (Bruker, Santa Barbara, CA) equipado com uma célula de fluido. Um braço de suporte macio (MLCT-C, Bruker, EUA) com mola nominal constante de 0,01 N /m foi escolhida para as medições. O raio da sonda de 28 nm e a mola cantilever constante de 0,012 N /m foram calibradas, respectivamente, por imagiologia de uma amostra de calibração da ponta de raio (PA-01, Mikromasch, NanoAndMore EUA Corp.) e o processo de ajuste térmico. Uma amostra de silício foi escolhido como a amostra de referência duro. Ambas as células e as consolas foram termicamente equilibrada a ~ 37 ° C durante 40-60 minutos antes de todas as medidas para minimizar os desvios em cantilever. Todos os sinais de controle e sensores de /e para o sistema de AFM foram adquiridos através de um sistema de aquisição de dados (PCI-6259, a National Instruments Corporation, Austin, TX NI) sob o Matlab xPC-alvo (The MathWorks, Natick, MA) ambiente .

a tensão da unidade triângulo com uma carga constante e descarregar taxa (que utilizado na habitual medição de curva força-distância) foi aplicada ao

z

-axis atuador piezo do sistema AFM, e as seguintes nove taxas de carga mais de três ordens de grandeza foram aplicadas: 0,2 Hz, 0,5 Hz, 1 Hz, 5 Hz, 10 Hz, 20 Hz, 50 Hz e 100 Hz. A amplitude da tensão da unidade foi mantida a mesma para todas as taxas de carga acima, resultando no mesmo deslocamento base de cantilever a 250 nm (como para as taxas de carregamento acima, a dinâmica de nem o

Z

-axis piezoeléctrico mecanismo de accionamento nem a fixação cantilever estava animado [18]). Para minimizar os danos da membrana celular, a unidade de triângulo foi aplicada por apenas um período em que a taxa de carga de força era inferior a 50 Hz e em dois períodos de taxas de carga superior. As entradas de acionamento foram aplicadas sucessivamente de baixo para as taxas de carga elevados, separados por um tempo de permanência de 3 min entre cada taxa para permitir que a célula para se recuperar totalmente a partir dos estímulos força precedentes. Para cada velocidade de carga, a força de excitação exercida (isto é, a deformação cantilever) a células vivas foi medida e considerada como o perfil de força de excitação desejada, e o algoritmo de MIIC foi aplicado na medição da curva da força-distância sobre a amostra de referência para garantir precisão de rastreamento do perfil da força desejada (RMS rastreamento de erro foi mantida abaixo de 1,5%).

Para estudar o efeito de cada droga no módulo de células PC-3 de Young, as medidas foram realizadas no controle correspondente primeiro , em seguida, sobre as células tratadas. Para cada droga, estas medidas foram repetidas em cinco diferentes células, tanto para o controle e os tratados com o fármaco.

dependente da Taxa módulo de elasticidade Quantificação

Em cada taxa de carga de força, módulo de Young celular foi quantificada utilizando o modelo contato hertziana esférica, juntamente com a força de interação sonda amostra medida e recuo [12], (3) onde

R

é o raio da sonda, e

e

e

ν Quais são o módulo de Young e coeficiente de Poisson da célula viva (

ν

= 0,5 [7, 12]), respectivamente. A força de interação da sonda com a amostra é quantificada como

F

z

=

k

c

d

s

(com constante de mola cantilever (

k

c

)) [12]. Notamos que outro modelo contato recuo Hertizan como o modelo cônico [12] pode ser usado. O modelo de contacto esférica é escolhido como neste trabalho as profundezas de recuo gerados não foram substancialmente maior (mais de 10 vezes) do que, mas tendem a ser comparável ao raio da sonda [26, 27].

Resultados e Discussão

A força (isto é, cantilever deflexão) perfil de tempo, às taxas de carga de 0,2 Hz e 50 Hz em TPA tratada células PC-3 em doses elevadas (20

μ

M) é mostrado na Figura 1 , como um exemplo-as parcelas no tempo das forças de baixa dosagem e /ou outras drogas mostrou tendência semelhante. As curvas força-recuo medidos a partir do mesmo tratamento em todas as taxas de carga nove são mostrados na Figura 2 para todas as taxas de carga de nove (curvas força-recuo para outras medições não são mostrados para salvar sapce). módulo de controlo (ou seja, sem tratamento) e as células de PC-3 tratadas com droga de Young são comparados nas Figuras 3-5 para os fármacos testados oito, respectivamente, em que o módulo de Young versus a taxa de carga de força é representada em escala logarítmica, ea curva de ajuste dos dados para a seguinte lei de potência também é mostrado, (4) onde

e

0 é o da constante fator de escala elasticidade lei de potência de células, e

α

é o expoente da lei de potência, que capta a viscosidade da membrana celular [13, 28]. Além disso,

E

0 e

α

do cabido módulo de Young vs. curva de freqüência também são comparados na Figura 6 para os oito drogas testadas para o controle e o PC-3 tratadas células sob dosagens tanto a baixa ea alta.

os resultados da experiência mostraram que os comportamentos viscoelásticos das células PC-3 foram bem capturados neste trabalho. Como mostrado na Figura 1 (b), o efeito de aceleração da sonda sobre a trajetória força de recuo foi pronunciado e precisava ser contabilizado na quantificação recuo, e para a mesma amplitude conduzido, o recuo gerado diminuiu monotonamente com o aumento da força as taxas de carga (ver Figura 2), o que reflecte a natureza visco-elasticidade da membrana celular [8, 12]. O recuo gerado nas células PC-3, foi de 80 nm a 230 nm, entre todos os fármacos testados oito (para todas as doses testadas). Como o

z

-axis impulsionado amplitude impulsionado foi mantido o mesmo a 250 nm, tal variação do recuo refletiu exatamente a viscoelasticidade das células e os efeitos da droga sobre ela, respectivamente.

o módulo de medição de Young vs. relação frequência seguido, muito bem, a lei, o poder comportamento viscoelástico universal amplamente observado de células humanas ao vivo [13, 28, 29]. As variações do fator de escala elasticidade

E

0 e o expoente da lei de potência

α

eram pequenos entre todos os controles-com o desvio padrão de 5,8% e 4,2%, respectivamente ( ver Figura 6), respectivamente. Tal uma pequena variação de

E

0 e

α

, por conseguinte, pode ser servido como linha de base para examinar os efeitos dos fármacos testados nove sobre as propriedades mecânicas do PC- 3 células. Além disso, a gama do expoente lei de potência

α

concorda bem com o intervalo descrito (0,1-0,3) para as células vivas na literatura [29].

Tal como mostrado nas Figs 3-5, todas as células tratadas com droga apresentaram uma muito maior módulo de Young, e quanto maior a dose de droga foi, quanto maior for o aumento do módulo de Young foi. Como a mudança o módulo de Young em células está directamente relacionada com a remodelação da estrutura do citoesqueleto [4, 5, 10], uma explicação possível para o aumento do módulo pode ser a agregação de filamentos de actina sob os efeitos de drogas, uma vez que foi mostrado que a agregação de . filamentos de actina resulta em um aumento distinto do módulo de células a média de Young [10]

uma rápida comparação das Figuras 3-5 revelaram duas grandes tendências podem existir nas oito drogas efeitos de teste no módulo de Young: sob o efeito de DSF, MK, e o taxol, o módulo de células PC-3 de Young foi aumentada sem alterações significativas na frequência-dependência, ou seja, o factor de escala elasticidade

e

0 aumentaram substancialmente (por 55% a 78%), enquanto o expoente da lei de potência

α

permaneceu quase inalterada (ver Eq 4) -para esses medicamentos a variação do

α

foi apenas cerca de 6% para 14%. Considerando que, sob o efeito de Celebrex, BAY, Totamine, TPA, e VPA, a frequência dependência do elevado módulo de Young mudou significativamente, ou seja,

E

0 aumentado em 78% para 260%, enquanto

α

também aumentou de 22% para 75% (ver Figura 6)

DSF, MK e Taxol:. Elevated Young Modulus sem significativa Mudança de Frequência-dependência

para DSF, MK, e Taxol, os rácios de módulo de Young entre os PC-3 células tratadas e de controlo foram quase a mesma cruz todos os nove frequências medidos em cada dose de tratamento (mostrado como o aumento de

e

0, ver figura 3). Isto implica que a viscosidade das células tratadas não foi alterado substancialmente em comparação com os de controlo como o valor de

α

não se alterou significativamente. Pode concluir-se que no âmbito do tratamento de DSF, MK e o taxol, a reconstrução de rede do citoesqueleto celular pode levar a um endurecimento total da estrutura de proteína de membrana (por exemplo, o encurtamento de filamentos e espessamento), mas não pode provocar muita alteração do grau de polimerização de actina filamentos no interior das células-a causa geral da alteração da viscosidade [30, 31].

Apesar de MK, Taxol e DSF pode ter alvos moleculares distintos e mecanismos de ação, a tendência semelhante de mudança módulo de célula de Young pode explicar a semelhança dos efeitos dessas três drogas ‘em comportamento mecânico celular. MK pode inactivar Ezrin, que serve como elementos de ligação entre a membrana do plasma e citoesqueleto [32]. Taxol interfere com repartição normal dos microtúbulos [33], e DSF inibe a polimerização da tubulina [34]. É razoável postular que interferindo com ligantes entre a membrana do plasma e do citoesqueleto, interferindo com desagregação dos microtúbulos e inibição da polimerização da tubulina poderia levar ao endurecimento da pilha sem alteração da viscosidade.

No entanto, o aumento o módulo de Young em MK e Taxol tratada células foi mais significativa (mesmo para uma dose baixa de 2

μ

M) do que para as células tratadas DSF (com a mesma dose). Uma possível explicação pode ser o efeito quelante de ferro da DSF. estudo anterior mostrou que DSF facilitou a absorção de Cu intracelular [35]. Verificou-se que o Taxol e MK inibiu fortemente a activação de Akt [36, 37] enquanto DSF não teve qualquer efeito inibitório sobre a activação desta proteína [38]. Inactivação de Akt pode contribuir para o efeito mais forte do MK e o taxol, em comparação com DSF. A influência da DSF na homeostase do ferro pode ser outra possível explicação para o efeito mais fraco da DSF (sobre o aumento do módulo de Young) do que MK e Taxol.

Módulo de Cima Jovem Acompanhado por Dramatic Frequency-dependência Mudança

Surpreendentemente diferente dos acima de três drogas, os outros cinco medicamentos (Celebrex, Baía, Totamine, TPA, e VPA) tendem a afetar não só o elástico, mas também o comportamento viscoso das células PC-3 como tanto a escala elasticidade fator,

e

0 e o expoente da lei de potência,

α

, foram significativamente aumentados. Este fenómeno indica que a alteração do citoesqueleto celular devido ao tratamento destas cinco drogas consiste não só citoesqueleto de reforço mas também mudar de grau de polimerização, o que pode envolver um aumento da concentração de monómeros de actina e uma reorganização dos filamentos de actina. Além disso, é de notar que o desvio padrão do módulo das células PC-3 tratadas por estes cinco fármacos de Young são maiores do que daqueles tratados pelos outros três drogas (DSF, o taxol e MK). Uma vez que o desvio padrão do módulo de Young para todo o controle permanece muito menores para todos os oito drogas, uma possível explicação para a diferença maior é que o comportamento mecânico dinâmico das células tratadas pelos cinco drogas (Celebrex, BAY, Totamine, TPA, e VPA) foi mais ativo.

era conhecido que o celebrex, TPA e diferenciação celular induzida ácido valpróico [39-41]. Como os estudos demonstraram que a diferenciação celular conduz a um aumento da rigidez de células [26], em aumentar a rigidez e a viscosidade de células PC-3 tratadas com Celebrex, TPA e ácido valpróico pode ser relacionada com a diferenciação das células. Embora BAY11-7082 e Tomatina não foram mostrados para induzir a diferenciação nas células epiteliais, estes fármacos inibem a activação de NF-kB

κ

B [42], e a inibição do NF

κ B em

algumas células resultou num fenótipo mais diferenciado [43]. Assim, os efeitos de BAY11-7082 e Tomatina sobre a rigidez e a viscosidade de células PC-3 pode estar relacionada com o seu efeito inibidor na activação de NF-

κ

B.

Entre os resultados da medição, a alteração do módulo de Young foi mais significativo nas células tratadas Celebrex. Desde Celebrex provoca perda de filopodia e lamelip�ios nas células, e as alterações na rede de actina [44], estas actividades em adição aos seus efeitos indução de diferenciação pode resultar em um efeito mais forte sobre o aumento de rigidez e a viscosidade de PC-3, em comparação com os outros quatro drogas.

Nós ainda realizado o teste MTT para investigar a correlação entre as mudanças de propriedades mecânicas e a inibição do crescimento celular. Como mostrado pelos resultados do teste de viabilidade celular do ensaio de MTT na Figura 6, o tratamento de células PC-3 com as oito fármacos anticancerígenos diminuiu o número de células viáveis, particularmente em doses elevadas, isto é, o efeito foi dependente da dose. Tal efeito das drogas (em diminuir a viabilidade celular) correlacionou bem com o seu efeito sobre a alteração das propriedades mecânicas de células reveladas nos testes AFM acima, para todos os oito medicamentos diferentes examinados. Embora os estudos de AFM acima revelou claramente os dois padrões distintos entre as oito diferentes drogas na mudança de propriedades mecânicas de PC-3 de células (DSF, MK e o taxol como um grupo, e Celebrex, Bay tomatina,, TPA e ácido Vaproic como a outra grupo), o ensaio de MTT não demonstrou qualquer diferença evidente em mudanças viabilidade celular entre estes dois grupos. Este resultado sugere que os estudos de AFM pode propostos revelaram novos aspectos da resposta biológica das células cancerosas para anticancerígenos tratamentos com drogas, deste modo, proporcionando mais informações do que o ensaio de MTT convencional nas respostas de células PC-3 para tratamento anti-cancro de drogas. Uma possível explicação é que as alterações no citoesqueleto e a membrana celular pode estar correlacionada com a capacidade das células cancerosas para metastizar. Estudos futuros com modelo de metástase de células cancerígenas adequada pode ajudar a explorar a correlação entre as alterações nas propriedades mecânicas e capacidade metastático das células cancerosas.

Para investigar mais os mecanismos por trás dos dois padrões revelados pelos estudos AFM, imunofluorescência de

β

actina foi conduzido para buscar insights para as diferentes respostas em células PC-3 para os tratamentos com drogas. MK e Celebrex foram seleccionadas para representar o primeiro e o segundo grupo de oito drogas (como revelado pelos estudos de AFM), respectivamente. Os resultados de imagiologia de fluorescência obtidos são mostrados na FIG 7. A morfologia de

-actina β

imunofluorescência foi semelhante nas células tratadas com MK e aqueles tratados com Celebrex. Este resultado sugere que as respostas diferentes em células PC-3 para os dois grupos de drogas podem envolver mecanismos mais complexos em adição à modificação da actina celular. São necessários mais estudos sobre a modificação de outros componentes citoesqueleto para determinar os mecanismos por trás dos dois tipos distintos de resposta aos dois grupos de medicamentos testados.

A importância dos estudos acima é ressaltada pela importância de identificar novos alvos para a inibição do crescimento e indução de apoptose em células cancerosas, que se tornou um importante foco no desenvolvimento de nova geração de fármacos anti-cancerígenos. Propriedades físicas das células cancerosas, tais como a elasticidade e a viscosidade que associados com a modificação da membrana de plasma e citoesqueleto pode representar uma classe única de novo alvo para o desenvolvimento de drogas anti-cancro.