Abstract

A evidência recente mostra que alterada microRNA-9 (miR-9) expressão é implicada na progressão do câncer gástrico. No entanto, os papéis e mecanismos exactos subjacentes de miR-9 na proliferação, invasão e metástases de cancro gástrico ainda permanecem desconhecidos. Neste estudo, o miR-9 verificou-se ser regulada para baixo e inversamente correlacionada com a expressão de ciclina D1 e v-ets vírus eritroblastose E26 oncogene homólogo 1 (ETS1) em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares. análise bioinformática revelou os sítios de ligação putativos de miR-9 nas regiões 3 ‘não traduzida (3′-UTR) de ciclina D1 mRNA e ETS1. A expressão ectópica ou knockdown de miR-9 resultou na expressão em resposta alterada da ciclina D1, ETS1 e seus alvos a jusante retinoblastoma fosforilada e metaloproteinases de matriz 9 em linhas celulares de cancro gástrico cultivadas SGC-7901 e AGS. No sistema repórter de luciferase, o miR-9-alvo directamente o 3’-UTR de ciclina D1 e ETS1, e estes efeitos foram suprimidas por mutação dos locais de ligação de miR-9. Sobre-expressão de miR-9 suprimiu a proliferação, invasão e metástase de SGC-7901 e as células AGS

in vitro

e

in vivo

. Restauração do miR-9-mediada sub-regulação da ciclina D1 e ETS1 por transfecção transiente, salvado as células cancerosas de diminuição na proliferação, migração e invasão. Além disso, anti-miR-9 inibidor promoveu a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico, enquanto que derrubar de ciclina D1 ou ETS1 phenocopied parcialmente os efeitos de miR-9 sobre-expressão. Estes dados indicam que o miR-9 suprime a expressão de ciclina D1 e ETS1 através dos locais de ligação no seu 3′-UTR, inibindo assim a proliferação, invasão e metástases de cancro gástrico

citação:. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi H, Li D, X Xiang, et al. (2013) microRNA-9 Suprime a proliferação, invasão e metástase das células cancerosas gástrica através de segmentação de ciclina D1 e ETS1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10.1371 /journal.pone.0055719

editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

Recebido: 14 de setembro de 2012; Aceito: 29 de dezembro de 2012; Publicação: 31 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por a National Science Foundation Natural da China (No. 30.600.278, No. 30.772.359, No. 81.071.997, No. 81.072.073, No. 81.272.779), Programa de New Century excelentes talentos na University (NCET-06-0641), Fundação de Pesquisa científica para o retornou ultramarinos estudiosos chineses (2008-889) e fundos de pesquisa fundamental para a Universidades Central (2012QN224). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum no mundo [1]. Apesar da melhoria na terapia cirúrgica e multimodal, o prognóstico do cancro gástrico avançado continua a ser pobre devido à recorrência, invasão e metástase, com uma taxa de sobrevida de 5 anos abaixo de 30% [1]. Um melhor conhecimento dos mecanismos subjacentes a progressão do tumor é garantido para descobrir novos paradigmas para o diagnóstico e tratamento do cancro gástrico [2]. MicroRNAs (miARNs), uma categoria recentemente identificados das pequenas e altamente conservadas RNAs não codificadoras, pode participar na regulação pós-transcricional da expressão génica através de complementaridade parcial de ligação com as regiões não traduzidas a 3 ‘(3’-UTRs) de ARNm alvo, resultando em translacional repressão ou degradação de ARNm [3]. Emergindo evidência mostra que miARNs estão envolvidas em processos biológicos relacionados com apoptose, proliferação, diferenciação, invasão e metástases, enquanto que a desregulação de que é crucial para a iniciação e progressão do cancro [3]. É actualmente urgente para investigar o papel dos miARNs e seus genes alvo em progressão tumoral em modelos experimentais.

No cancro gástrico humano, um número de miARNs têm sido referidos como sendo sobre-expresso de forma aberrante ou sub-regulada durante a progressão do cancro gástrico, incluindo o miR-21 [4], o miR-15b [5], o miR-16 [5], e miR-101 [6]. Estes miRNAs desempenham papéis oncogênicos ou tumor-supressor na regulação do crescimento celular, migração e invasão reprimindo seus genes-alvo. Por exemplo, oncogénico miR-21 é aberrante sobre-expressos em câncer gástrico e aumenta a proliferação e invasão das células cancerosas gástricas, visando a proteína rica em cisteína de indução de reversão com motivos Kazal [4]. Enquanto isso, o miR-15b e miR-16 são regulados negativamente no câncer gástrico, e contribuir para a resistência a múltiplas drogas de células cancerosas gástricas pela modulação da apoptose através de segmentação de células B leucemia /linfoma 2 [5]. miR-101 é regulada para baixo em gástrica tecidos de cancro e linhas de células, enquanto que a expressão ectópica de miR-101 inibe significativamente a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico por segmentação intensificador de homólogo de zeste 2, citocromo c oxidase subunidade II, e mielóide sequência de uma leucemia de células [6]. Por isso, tem sido um foco de explorar ainda mais a expressão e função de miARN na biologia do tumor do cancro gástrico.

MicroRNA-9 (miR-9) é identificado pela primeira vez como um dos reguladores cruciais para o desenvolvimento , fisiologia e patologia do sistema nervoso em vários organismos, incluindo

Drosophila

, peixe-zebra, e mamíferos [7] – [9]. Uma série de estudos posteriores demonstraram que alterou o miR-9 de expressão está associado com o desenvolvimento e progressão de cancros [10] – [14]. Estudos anteriores indicam que o miR-9 é significativamente regulada negativamente em cancro gástrico, o que implica o seu papel potencial na progressão tumoral [15] – [18]. É também indicado que o miR-9 pode modular a proliferação de células de cancro gástrico através do direccionamento do tipo homeobox caudal 2 (CDX2) [19] e NF-kappa B (NF-kB) [16]. No entanto, a função exata e os mecanismos subjacentes de miR-9 na progressão do câncer gástrico ainda justificar uma investigação mais aprofundada. Neste estudo, que demonstram, pela primeira vez, que o miR-9 como alvo directamente ciclina D1 e v-ets eritroblastose vírus E26 homólogo oncogene 1 (ETS1), e suprime a proliferação, invasão e metástase de células de cancro gástrico

in vitro

e

in vivo

.

Resultados

miR-9 foi regulada para baixo e inversamente correlacionada com a expressão de ciclina D1 e ETS1 em tecidos com câncer gástrico e linhas celulares

Para investigar a expressão de miR-9 em câncer gástrico, tecidos de câncer gástrico e mucosa não-neoplásica adjacente foram coletados de 86 casos primários. Real-time PCR quantitativa de transcrição reversa (RT-PCR) revelou que o miR-9 foi regulada para baixo em tecidos gástricas cancerosas do que na mucosa não-neoplásica adjacente (

P

= 0,001, Fig. 1a). A expressão de miR-9 foi significativamente menor nos casos de câncer gástrico com mais profunda invasão da parede gástrica (

P Art 0,001), metástases em linfonodos (

P Art 0,001), metástases à distância (

P

= 0,022), e estágio avançado TNM (

P

= 0,01) (Tabela S1). Em contraste, maior ciclina D1 e níveis de transcrição ETS1 foram detectados em tecidos de câncer gástrico (

P Art 0,0001 e

P Art .. 0,0001, respectivamente, Fig 1B e Fig 1C). Houve uma correlação inversa entre miR-9 expressão e ciclina D1 níveis de transcrição em tecidos com câncer gástrico (

P

. 0,001, Fig 1D). Além disso, uma correlação inversa entre a expressão de miR-9 e níveis de transcrição ETS1 também foi observado nestes tecidos de cancro (

P

. 0,001, Figura 1E). Baixa miR-9 de expressão e os níveis de transcrição elevados de ciclina D1 e ETS1 foram observados em linhas de células de cancro gástrico do que aqueles em GES-1 epiteliais gástricas normais células [20] (Fig. 1F). coloração imuno-histoquímica foi realizada para observar a expressão de ciclina D1 e ETS1 nestas amostras de cancro (Fig. S1). ciclina D1 nuclear foi observada em 26/86 (30,2%) casos, enquanto foi observada coloração nuclear e citoplasma de ETS1 em 58/86 (67,4%) casos (Tabela S1). A imunorreatividade da ciclina D1 e ETS1 foi significativamente maior nos casos de câncer gástrico com mais profunda invasão gástrica parede (

P Art 0.001 e

P

= 0,001), metástases em linfonodos (

P Art 0.001 e

P Art 0,001), metástases à distância (

P Art 0.001 e

P Art 0,001), e estágio TNM avançado (

P Art 0.001 e

P

= 0,004) (Tabela S1). Lower miR-9 expressão foi observada em tecidos de câncer gástrico com maior imunomarcação da ciclina D1 (

P Art 0,0001, Fig 1G.) Ou ETS1 (

P

. 0,0001, Fig 1H ). Estes resultados indicaram que o miR-9 foi regulada para baixo e inversamente correlacionada com a expressão de ciclina D1 e ETS1 em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares.

A, B e C, em tempo real quantitativa de RT-PCR indicaram que quando comparado com a mucosa, não neoplásico adjacente (n = 86), a sub-regulação dos níveis de transcrição elevados de ciclina D1 e ETS1 miR-9 e foram detectados em tecidos de cancro gástrico (n = 86). D e E, houve uma correlação inversa entre miR-9 expressão e níveis de transcrição de ciclina D1 ou ETS1 em tecidos com câncer gástrico. F, menor expressão de miR-9 e superior ciclina D1 e ETS1 níveis de transcrição foram observados em linhas de células de cancro gástrico (MKN-74, SGC-7901 e AGS), quando comparadas com as células gástricas GES-1 epiteliais normais. G e H, inferior miR-9 expressão foi observada em tecidos de cancro gástrico com maior imunocoloração de ciclina D1 ou ETS1. Os símbolos (* e #) indicam uma diminuição significativa e um aumento significativo de GES-1, respectivamente.

miR-9-regulada a expressão da ciclina D1 e ETS1 através da repressão pós-transcricional

Para investigar a hipótese de que o miR-9 podem influenciar a expressão de ciclina D1 e ETS1 no cancro gástrico, a previsão computacional foi realizada por bancos de dados de miARN. Potenciais locais de ligação de miR-9 com elevada complementaridade foram notadas nas bases 2974-2995 da ciclina D1 3′-UTR e 2648-2670 do ETS1 3′-UTR (Fig. 2A). Para investigar os efeitos diretos de miR-9 sobre a expressão da ciclina D1 e ETS1 em células de câncer gástrico, realizamos os miRNA sobre-expressão experimentos. Transfecção estável de miR-9 precursoras em SGC-7901 e células AGS resultou em aumento de níveis de miR-9 (Fig. S2). Western blot, RT-PCR e em tempo real quantitativa de RT-PCR demonstrou que a sobre-expressão de miR-9 resultou numa diminuição da proteína e os níveis de transcrição de ciclina D1 e ETS1 em células de cancro gástrico do que aquelas transfectadas com vector de controlo negativo (simulado) ( A Fig. 2B, Fig. 2C e Fig. 2D). Além disso, os níveis de retinoblastoma fosforilado (pRb, um efector a jusante da ciclina D1) [21] e da metaloproteinase 9 da matriz (MMP-9, um gene a jusante do ETS1) [22] foram diminuídas com o miR-9 células cancerosas que sobre-expressam (Fig. 2B, Fig. 2C e Fig. 2D). Para examinar ainda mais o papel supressor de miR-9 na expressão de ciclina D1 e ETS1, foram realizados os miR-9 experiências de knockdown por transfecção de inibidores de controlo negativo (anti-NC) anti-miR-9 ou em GES-1, SCG -7901 e AGS células. A transfecção de anti-miR-9 inibidor obviamente diminuiu a endógeno miR-9 de expressão (Fig. S3A), e regulada positivamente os níveis de proteína de ciclina D1, pRB, ETS1 e MMP-9, que aquelas transfectadas com anti-NF (Fig. 2E e Fig. S4A). As análises em tempo real quantitativa de RT-PCR mostrou os níveis de transcrição reforçada de ciclina D1, ETS1 e MMP-9 em células cultivadas transfectadas com anti-miR-9 inibidor, quando comparada com as transfectadas com anti-NF (Fig. 2F e Fig. S4B). No geral, estes resultados demonstraram que o miR-9 inibiu consideravelmente a expressão de ciclina D1 e ETS1 através da repressão pós-transcricional.

Um esquema dos potenciais locais de ligação de miR-9 na 3′-UTR de ciclina D1 e ETS1, localizando em bases 2974-2995 e 2648-2670, respectivamente. B, a transfecção estável de miR-9 precursor resultou na diminuição dos níveis de proteína de ciclina D1, ETS1 e seus alvos a jusante pRB e MMP-9 no câncer gástrico SGC-7901 e as células AGS do que aqueles transfectadas com vector de controlo negativo (simulada). C e D, os níveis de transcrição de ciclina D1, ETS1 e MMP-9 foram diminuídas com o miR-9 transfectadas com percursor SGC-7901 e células AGS, quando comparadas com as células pseudo. E, transfecção de anti miR-9-inibidor (100 nmol /L) resultou em aumento dos níveis de proteína de ciclina D1, ETS1 e seus alvos a jusante pRB e MMP-9 em SGC-7901 e células AGS do que aquelas transfectadas com inibidor de controlo negativo ( anti-NC, com 100 nmol /L). F, os níveis de transcrição de ciclina D1, ETS1, e MMP-9 foram aumentadas em SGC-7901 e células AGS transfectadas com anti-miR-9 inibidor (100 nmol /l), quando comparada com as transfectadas com anti-NC (100 nmol /L). Os símbolos (* e #) indicam uma diminuição significativa e um aumento significativo da simulação ou anti-NC, respectivamente.

miR-9 ciclina D1 directamente visados ​​e ETS1 em células cancerosas gástricas

Para determinar se o miR-9 pode reprimir a expressão de ciclina D1 e ETS1, visando os seus sítios de ligação na 3′-UTR, os produtos de PCR contendo os locais alvo intactas ou mutação de miR-9 sequências de reconhecimento de semente (Fig. 3A) foram inseridos no vector repórter de luciferase. Os plasmídeos foram transfectados em células cancerosas gástricas estavelmente transfectadas com vector de controlo negativo (simulada) ou miR-9 precursor. O

Renilla

actividades de luciferase normalizada para aqueles de pirilampo foram significativamente reduzidos em células SGC-7901 e AGS estavelmente transfectadas com o miR-9 precursor (Fig. 3B), e estes efeitos foram suprimidas por mutação do putativo miR-9 sites dentro do 3′-UTR de ciclina D1 e ETS1 (Fig. 3B) vinculativo. Além disso, knockdown de miR-9 com anti miR-9-inibidor aumentou as actividades de luciferase em GES-1, células AGS SGC-7901 e (Fig. 3C e Fig. S4C), enquanto que a mutação de miR-9 local de reconhecimento abolida estes efeitos (Fig. 3C e Fig. S4C). Estes resultados indicaram que o miR-9 directa e especificamente interagiu com os sítios-alvo no 3′-UTR de ciclina D1 e ETS1.

A, esquema e a sequência do sítio de ligação intacta de miR-9 (Wt) e sua mutação (Mut) dentro dos vectores repórter de luciferase. B, a transfecção estável de miR-9 precursoras em células SGC-7901 e AGS resultou numa diminuição de actividades de luciferase repórter 3′-UTR de ciclina D1 e ETS1 do que as transfectadas com vector de controlo negativo (simulado), que foram abolidos por mutação no putativo miR-9 sítios de ligação. C, transfecção de anti miR-9-inibidor (100 nmol /L) em SGC-7901 e células AGS aumentou as actividades de luciferase do que as transfectadas com anti-NC (100 nmol /L), enquanto que a mutação de miR-9 local de reconhecimento abolida estes efeitos. Os símbolos (* e #) indicam uma diminuição significativa e um aumento significativo da simulação ou anti-NC, respectivamente.

miR-9 suprimiu a

proliferação in vitro

de câncer gástrico células por meio de segmentação ciclina D1

uma vez que a evidência de cima mostraram que o miR-9 inibiu a expressão da ciclina D1, e combinando os factos de que a ciclina D1 desempenha um papel fundamental na progressão do ciclo celular e a proliferação de células cancerosas [21], além disso, investigamos os efeitos de miR-9 sobre-expressão e recuperação do gene alvo em células de cancro gástrico em cultura. Western blot e em tempo real quantitativa de RT-PCR indicaram que a transfecção de ciclina D1, mas não da ETS1, salvado o miR-9 induzida por sub-regulação da ciclina D1 (Fig. 4A e Fig. 4B). No ensaio de formação de colónia, o miR-9 sobre-expressão atenuou o crescimento de SGC-7901 e células AGS, quando comparado com as transfectadas com vector de controlo negativo (simulado) (Fig. 4C). Citometria de fluxo indicou que miR-9 sobre-expressão induzida paragem do ciclo celular em G

0 /G

1 fase em células AGS (Fig. 4D) SGC-7901 e. Além disso, a transfecção de ciclina D1, mas não da ETS1, em SGC-7901 e células AGS restaurou a inibição da proliferação e do ciclo celular induzida por captura sobre-expressão de miR-9 (Fig. 4C e a Fig. 4D). Por outro lado, nós examinamos os efeitos de miR-9 knockdown no GES-1, SGC-7901 e células AGS. Introdução de anti-miR-9 inibidor para estas células resultou em habilidades aprimoradas em proliferação (Fig. S3B) e progressão do ciclo celular (Fig. S3C). Estes resultados indicaram que miR-9 notavelmente suprimiu a

in vitro

proliferação e progressão do ciclo celular das células cancerosas gástricas por meio de segmentação ciclina D1.

A e B, western blot e em tempo real RT quantitativa -PCR indicaram que a transfecção de ciclina D1, mas não da ETS1, restaurou a infra-regulação da ciclina D1 induzida por miR-9 sobre-expressão em cancro gástrico SGC-7901 e células AGS, quando comparado com as transfectadas com vector de controlo negativo ( simulada). C, no ensaio de formação de colónia, o miR-9 sobre-expressão atenuou o crescimento de células AGS SGC-7901 e do que a de células de simulação, que foi resgatado por transfecção de ciclina D1, mas não do ETS1. D, citometria de fluxo indicou que miR-9 sobre-expressão induzida a paragem do ciclo celular em G

0 /G

1 fase da SGC-7901 e as células AGS do que em células de simulação, que foi resgatado por transfecção de ciclina D1 , mas não do ETS1. O símbolo (*) indica uma diminuição significativa da simulação.

miR-9 atenuou a

in vitro

migração e invasão das células cancerosas gástricas orientando ETS1

Uma vez que estudos anteriores indicam o importante papel dos ETS1 na invasão e metástases de células cancerosas [23], [24], foi investigada mais profundamente os efeitos de miR-9 sobre-expressão e recuperação do gene alvo na migração e invasão da SGC cancro gástrico -7901 e AGS células. Western blot e em tempo real quantitativa de RT-PCR indicaram que a transfecção de ETS1, mas não da ciclina D1, salvado o miR-9 induzida por sub-regulação de ETS1 (Fig. 5A e Fig. 5B). No Transwell ensaio de migração, as células de cancro gástrico, estavelmente transfectadas com o miR-9 precursor apresentada uma capacidade diminuída migração do que as transfectadas com vector de controlo negativo (simulado) (Fig. 5C). No ensaio de invasão de matrigel, miR-9 sobre-expressão atenuou a capacidade de invasão de células AGS (Fig. 5D) SGC-7901 e. Além disso, a transfecção de ETS1, mas não da ciclina D1, em SGC-7901 e linhas celulares AGS restaurou a inibição de miR-9-meditaed na migração e invasão (Fig. 5C e a Fig. 5D). Além disso, examinou os efeitos de miR-9 knockdown no GES-1, SGC-7901 e células AGS. A transfecção de anti-miR-9 inibidor resultou na migração e invasão aumentada destas células (Fig. S3D e a Fig. S3E). Estes resultados indicaram que miR-9 notavelmente atenuou a

in vitro

migração e invasão das células cancerosas gástricas orientando ETS1.

A e B, western blot e quantitativa em tempo real RT-PCR indicaram que a transfecção de ETS1, mas não da ciclina D1, restaurou a sub-regulação de ETS1 induzida por miR-9 sobre-expressão em cancro gástrico SGC-7901 e células AGS, quando comparado com as transfectadas com vector de controlo negativo (simulado). C, em Transwell ensaio de migração, as células gástricas cancerosas estavelmente transfectadas com o miR-9 precursor apresentada uma capacidade diminuída migração do que em células falsamente, que foi resgatado por transfecção de ETS1, mas não de ciclina D1. D, no ensaio de invasão de matrigel, miR-9 sobre-expressão atenuada as capacidades invasão do SGC-7901 e células AGS do que aqueles de células simuladas, que foi resgatado por transfecção de ETS1, mas não da ciclina D1. O símbolo (*) indica uma diminuição significativa da simulação.

miR-9 atenuado o crescimento e metástase das células cancerosas gástricas

in vivo

A seguir, investigou a eficácia de miR-9 contra o crescimento de tumores e metástases

in vivo

. Transfecção estável de miR-9 precursoras em células SGC-7901 ou AGS resultou na diminuição do crescimento e o peso de tumores de xenoenxertos subcutâneos em ratinhos nude atímicos, quando comparados com aqueles estavelmente transfectadas com negativo vector de controlo (simulado) (Fig. 6A e Fig. 6B ). Além disso, a expressão de ciclina D1, ETS1 e a jusante de MMP-9 foi reduzida pela transfecção estável de miR-9 precursor (Fig. 6C). A densidade de vasos significativo CD31-positivas foi reduzida dentro de tumores formados por injecção de células cancerosas estavelmente transfectadas com o miR-9 precursor (Fig. 6D). Nos estudos metástases experimentais, SGC-7901 ou células AGS estavelmente transfectadas com miR-9 precursoras estabelecidas estatisticamente menos pulmonares colónias metastáticas do que o grupo de simulação (Fig. 6E). Estes resultados sugerem que miR-9 inibiu o crescimento e metástase das células cancerosas gástricas

in vivo

.

A e B, injeção hipodérmica de células SGC-7901 ou AGS estavelmente transfectadas com miR-9 precursor em ratinhos nus atímicos (n = 5) resultou numa diminuição de tamanho e peso dos tumores de xenoenxertos subcutâneos do que aquelas transfectadas com vector de controlo negativo (simulado, n = 5). C, hematoxilina e eosina (H E) e coloração imuno-histoquímica revelou que a transfecção estável de miR-9 precursor resultou numa diminuição da expressão de ciclina D1, ETS1, e MMP-9 no interior dos tumores. Barras de escala: 100 mm. D, a densidade de vasos significativo CD31-positivas foi reduzida dentro de tumores formados por células cancerosas transfectadas estavelmente por miR-9 precursor. Barras de escala: 100 mm. E, no ensaio de metástases experimentais, as células cancerosas, estavelmente transfectadas com o miR-9 precursor estabelecidos significativamente menos colónias metastáticas do pulmão (setas) em ratinhos nus atímicos (n = 6). Barras de escala: 100 mm. O símbolo (*) indica uma diminuição significativa da simulação.

Knockdown da ciclina D1 e ETS1 phenocopied miR-9 over-mediada expressão de inibição sobre a proliferação, migração e invasão das células cancerosas gástricas

in vitro

Uma vez que resultados acima indicaram a regulação negativa da ciclina D1 e expressão ETS1 por miR-9, a hipótese de que knockdown da ciclina D1 e ETS1 podem exercer efeitos semelhantes em células cancerosas gástricas cultivadas. Os pequenos RNAs de interferência (siRNAs) destinados à região de codificação da ciclina D1 e ETS1, si-CCND1 e si-ETS1, foram projetados e transfectado em SGC-7901 e as células AGS. A transfecção de Si-CCND1 e Si-ETS1 resultou numa diminuição da expressão de ciclina D1, pRB, ETS1 e MMP-9 em células de cancro gástrico, respectivamente, quando comparado com as transfectadas com precipitação siRNA (Si-Scb) (Fig. 7A, Fig . 7D e a Fig. S5). Knockdown da ciclina D1 suprimiu a proliferação e interrupção do ciclo celular induzida pelo G

0 /G

1 fase em células AGS (Fig. 7B e Fig. 7C) SGC-7901 e. Além disso, o knockdown de ETS1 em células SGC-7901 e AGS resultou numa diminuição da capacidade de migração e invasão (Fig. 7E e a Fig. 7F). Estes resultados sugerem que knockdown da ciclina D1 e ETS1 phenocopied (possuía os fenótipos semelhantes a) miR-9 sobre-expressão na inibição da proliferação, migração e invasão das células cancerosas gástricas

in vitro

.

a, transfecção de si-CCND1 (100 nmol /L) em células de câncer gástrico SGC-7901 e AGS resultou na diminuição da expressão de ciclina D1 e um alvo a jusante pRB do que aqueles transfectadas com disputa siRNA (si-Scb, 100 nmol /L ). B, knockdown da ciclina D1 suprimiu a proliferação de SGC-7901 e as células AGS do que aquelas transfectadas com si-Scb. C, knockdown da ciclina D1 induzida paragem do ciclo celular em G

0 /G

1 fase do que aqueles transfectadas com si-Scb. D, transfecção de Si-ETS1 (100 nmol /L) em células de cancro gástrico resultou numa diminuição da expressão do ETS1 e do seu gene a jusante da MMP-9, que aquelas transfectadas com Si-Scb (100 nmol /L). E, os recursos de migração de SGC-7901 e as células AGS foram diminuídos por transfecção de si-ETS1 do que aqueles transfectadas com si-Scb. F, a capacidade de invasão de SGC-7901 e as células AGS foram reduzidos por transfecção de si-ETS1 do que aqueles transfectadas com si-Scb. O símbolo (*) indica uma diminuição significativa de si-Scb.

Discussão

Tem sido bem estabelecido que o miR-9 perfil de expressão no câncer baseia-se na distribuição do tecido. Em tumores cerebrais primários, miR-9 é elevada e funciona como um fator essencial na carcinogénese neural [10]. miR-9 também é sobre-expresso no cancro do colo do útero [11], o que sugere o seu papel de promotor de tumor em desenvolvimento e progressão do tumor. No entanto, miR-9 é regulada em vários cancros humanos, incluindo o cancro do pâncreas [12], câncer de ovário [13] e cancro colorectal [14], e está associada com a progressão maligna do cancro da mama [25] e câncer colorretal ( 14). Luo

et al.

Observou a regulação de miR-9 em 24 amostras de cancro gástrico [15], que foi posteriormente confirmado em 9 [16], 72 [17] e 13 [18] câncer gástrico casos. No entanto, Inoue

et ai.

Relataram a regulação positiva de miR-9 em 5 doentes com cancro gástrico por matrizes baseadas em PCR em tempo real de miARN [26], e esta descoberta diferente em miR-9 perfil de expressão pode ser devido para a heterogeneidade dos espécimes limitados. Neste estudo, demonstrámos que o miR-9 é significativamente regulada negativamente em 86 espécimes de cancro gástrico primária do que em tecidos não-neoplásicas adjacentes, o que é consistente com os resultados anteriores [15] – [18]. Importante, nós também confirmam que miR-9 expressão é inversamente associado com os estágios clínicos, invasão e metástase de câncer gástrico. Em humanos, a maturidade miR-9 é codificado por três genes independentes, miR-9-1, 9-2 e miR-miR-9-3, situando-se os cromossomas 1, 5 e 15, respectivamente [27]. Estudos anteriores indicam que o miR-9-expressão regulada para baixo em cancro gástrico é devido à hipermetilação aberrante da região promotora de miR-9 genes de codificação [17]. Da mesma forma, a hipermetilação aberrante de genes da família miR-9 também é relatado em alguns tumores primários com metástase ganglionar, tais como câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama e melanoma [14], [28]. É importante ressaltar que o presente estudo relataram a correlação inversa entre o miR-9 níveis e a expressão da ciclina D1 e ETS1 em tecidos com câncer gástrico, o que implica que a ciclina D1 e ETS1 pode ser regulada negativamente por miR-9.

A função e genes alvo de miR-9 são específicos do tumor e dependentes do contexto celular. miR-9 é capaz de suprimir a expressão de E-caderina no cancro da mama [29], resultando na translocação nuclear de β-catenina e a sua ligação com os factores de transcrição do factor de células T /factor de intensificador linfóide 1, e subsequente transcrição regulada para cima de genes que facilitam a proliferação celular e angiogénese [29]. Forçado expressão de miR-9 em linhas celulares de cancro da mama também resulta em mudanças significativas de expressão de vários genes na via de apoptose relacionado com o p53 [30]. Através de objectivos directos NF-kB, expressão ectópica de miR-9 inibe a

in vitro

e

in vivo

crescimento das células do cancro do ovário [31] e o crescimento e metástase de melanoma [32] . Em neuroblatoma, a sobre-expressão de miR-9 inibe a invasão, metástase e angiogénese de células de tumor através da segmentação de metaloproteinase de matriz 14 [33]. Wan

et al.

Informou que a sobre-expressão de miR-9 inibiu a

in vitro

e

o crescimento in vivo

da linha de células de adenocarcinoma gástrico MGC803 através reprimindo NF-kB ao nível pós-transcricional [16]. No entanto, em um estudo recente, Rotkrua

et al.

Indicaram que miR-9 pode estar envolvido na carcinogênese gástrica através CDX2-regulação para baixo, e knockdown de miR-9 diminuiu o

in vitro

proliferação de câncer gástrico MKN-45 células [19], enquanto os seus resultados devem ser reforçadas com miR-9 sobre-expressão, resgate gene alvo, e

in vivo

estudos. Além disso, actualmente é controverso se CDX2 desempenha um papel supressor de tumores oncogénicos ou na carcinogénese gástrica [34], [35]. Além disso, os potenciais papéis do miR-9 na invasão e metástase do cancro gástrico não foram elucidados até agora. Assim, a função e diretas alvos de miR-9 em mandado de câncer de uma investigação mais aprofundada gástrico.

Neste estudo, demonstramos que a sobre-expressão de miR-9 atenuou a proliferação, migração e invasão das células cancerosas gástricas, que foi semelhante ao da ciclina D1 ou ETS1 knockdown, sugerindo a aplicação potencial de miR-9 como um alvo para a terapêutica de cancro gástrico. Além disso, nossos dados confirmam que o miR-9 directamente visados ​​ciclina D1 e ETS1 em células cancerosas gástricas através de ensaio de repórter luciferase 3′-UTR. Desde a evidência recente mostra que certos miRNAs podem, alternativamente, modulam a expressão do gene através da interação com promotores [36] – [38], os potenciais papéis de miR-9 na regulação da transcrição de ciclina D1 e ETS1 através da interação com promotores permanecem obscuros e garante a nossa mais investigação. A ciclina D1 é um proto-oncogene que pertence à família de G

1 ciclinas, e desempenha um papel importante no ciclo celular L

1 a transição S ligando os seus parceiros quinase ciclina dependente 4 e 6 para fosforilar e inactivar a proteína RB [21]. Sobre-expressão de ciclina D1 é um evento precoce na carcinogênese em colorretal, de esôfago e da vesícula biliar cancros humanos [39], e é um indicador de prognóstico associado com pior sobrevida no esôfago, mama e cancros urinário [39]. Ciclina D1 sobre-expressão em cancros humanos é elucidada por múltiplos mecanismos, incluindo alterações genômicas, regulação pós-transcricional e estabilização de proteínas pós-tradução [39]. Evidências recentes mostram que miR-16-1 reprime a expressão da ciclina D1 em nível pós-transcricional via ligação a 3′-UTR no linfoma de células do manto [40]. No estudo actual, os nossos resultados mostraram que a inibição de progressão e proliferação celular do ciclo celular miR-9-mediada foi resgatada pela restauração de expressão da ciclina D1 em células de cancro gástrico, o que sugere que a identificação de ciclina D1 como um gene alvo de miR-9, pode explicar, pelo menos em parte, porque a sobre-expressão de miR-9 suprimiu a proliferação de células de cancro gástrico.

ETS1, um membro da família de factores de transcrição ETS, liga-se a sequências de ADN específicas que contêm um GGAA núcleo motivo /T [22], e participa na invasão tumoral e metástases através de regulação da transcrição de vários genes responsáveis ​​para a remodelação da matriz extracelular, migração e invasão, tais como metaloproteinases de matriz e a urocinase do activador do plasminogénio [22]. Até à data, um número cada vez maior de estudos clínicos demonstraram o papel importante do ETS1 no desenvolvimento e progressão do tumor de vários tumores sólidos [23], [24].