Abstract

Fundo

Cerca de 60-80% dos pacientes com avançado de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) morrem dentro de cinco anos após o diagnóstico. quimioterapia com cisplatina é o tratamento paliativo mais vulgarmente utilizado para esses pacientes. Para avaliar o valor prognóstico de inibidor ligada ao X de nível de apoptose (XIAP) como um potencial biomarcador nestes pacientes, foi investigada a relação entre a expressão de XIAP e resposta cisplatina desses pacientes e seu prognóstico.

Metodologia /Principais achados

Sessenta pacientes com CECP avançado foram recrutados neste estudo. A expressão de XIAP foi examinada tanto antes como após quimioterapia e foi correlacionado com a resposta à quimioterapia, clinicopathology parâmetros e resultados clínicos dos pacientes. Descobrimos que XIAP foi expressa em 17 (20,83%) das 60 amostras CECP avançados e a expressão foi significativamente associada com a resistência à cisplatina (P = 0,036) e prognóstico clínico (P = 0,025). induzida por quimioterapia expressão de XIAP baseada em cisplatina nas amostras pós-quimioterapia (P = 0,011), foi ainda associado com o resultado clínico mais pobre (P = 0,029). A análise multivariada demonstrou que apenas o consumo de álcool, metástases linfonodais e nível de XIAP foram independentemente associados com o prognóstico de pacientes com CECP avançados. Inibição da expressão de XIAP com siRNA em células de CECP overexpressed XIAP notavelmente aumentado sua sensibilidade ao tratamento com cisplatina para quase uma diferença de 3 vezes.

Conclusões /Significado

Nossos resultados demonstram que XIAP superexpressão desempenha um papel importante na o curso da doença e cisplatina-resistência do CECP avançado. XIAP é um preditor útil de cisplatina-resposta e prognóstico para pacientes com avançado de cabeça e pescoço. A sub-regulação de XIAP pode ser uma terapia adjuvante promissor para aqueles pacientes de carcinoma epidermóide avançado

citação:. Yang X-H, Feng Z-E, Yan H, Hanada S, Zuo H, Yang C-Z, et al. (2012) XIAP é um preditor de Cisplatina baseados em quimioterapia Resposta e prognóstico para pacientes com avançado de cabeça e pescoço do cancro. PLoS ONE 7 (3): e31601. doi: 10.1371 /journal.pone.0031601

editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 01 de setembro de 2011; Aceito: 10 de janeiro de 2012; Publicação: 05 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Projeto de National Natural Science Foundation da China (Grant No. 30772433), o Projeto de Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (Grant No. 07QA14038) e Shanghai Leading Academic Disciplina Projeto (Project No. S30206). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (CECP) é o quinto câncer mais comum em todo o mundo e é a neoplasia mais comum na Ásia Central [1]. Embora em estágio inicial HNSCC têm altas taxas de cura, até 50% dos pacientes apresentam doença avançada [2]. Entre estes pacientes CECP fase avançada, 60-80% morrem dentro de 5 anos após o diagnóstico [3]. Actualmente, a quimioterapia com cisplatina é o tratamento paliativo mais vulgarmente utilizado para esses pacientes. No entanto, na clínica apenas um número limitado de pacientes beneficiam de quimioterapia com cisplatina; outros doentes são resistentes à terapia e alguns morrerão devido a toxicidade relacionada com o tratamento [4]. Portanto, é essencial procurar preditores ou potenciais biomarcadores que podem ajudar a identificar os pacientes que podem se beneficiar de quimioterapia baseada em cisplatina.

Os inibidores de proteínas de apoptose (IAPs) representam um conjunto de moduladores endógenos potentes de apoptose em células de mamíferos, que consistem em oito membros: XIAP, cIAP1, cIAP2, survivinas, NIAP, Bruce, ML-IAP e ILP-2 [5]. Estas proteínas mediar várias funções biológicas, que incluem a ligação e inibição de caspases, que regula a progressão do ciclo celular, e modular a transdução de sinal mediada por receptor [6]. Entre eles, ligados ao X inibidor de apoptose (XIAP) é um dos mais potente inibidor de caspases e apoptose. XIAP pode ligar-se directamente a e inibem tanto o iniciador e as caspases efectoras e inibem tanto mitocondrial dependente e independente de vias apoptóticas [7], [8], [9]. Descobertas recentes demonstraram

In vitro

, XIAP pode causar resistência entre as células tumorais, quando expostos a uma variedade de estímulos apoptóticos, incluindo quimioterapia [10], [11]. No entanto, não se sabe se o nível de expressão de XIAP poderia ser utilizada para prever a resposta de cisplatina HNSCC avançada. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar a expressão de XIAP em HNSCC avançada e sua relação com a resposta cisplatina e prognóstico desses pacientes.

Resultados

nível de expressão de XIAP é associada a um mau evolução clínica dos pacientes com CECP avançada

XIAP foi localizada principalmente no citoplasma das células tumorais (Figura 1), com uma taxa positiva altamente variável entre 1% -85%. Núcleo de coloração foi ocasionalmente observada em algumas amostras de pós-quimioterapia. Os pacientes cujos tumores expressaram níveis elevados de XIAP geralmente tinham um prognóstico pior do que os pacientes cujos tumores expressaram baixos níveis de XIAP em tecido de cancro da pré-quimioterapia (sobrevida global

P

= 0,025, Log Rank teste, Figura 2). taxa de expressão de XIAP não se correlacionou com o estágio TNM, grau patológico, tabagismo e história de álcool destes pacientes com CECP avançado (Tabela 1). Na análise multivariada, metástases em linfonodos, consumo de álcool e de expressão XIAP (pré-quimioterapia) foram fatores de risco independentes para o prognóstico dos pacientes (Tabela 2)

A:. Controlo negativo com PBS em vez de primeiro anticorpo; B: Baixa expressão de XIAP (a percentagem da taxa positiva 25%); C:. Alta expressão de XIAP (a percentagem de taxa positiva 25%)

A: taxa de sobrevivência global por dezenas XIAP. Os pacientes cujos tumores expressaram níveis elevados de XIAP geralmente tinham um prognóstico pior do que os pacientes cujos tumores expressaram baixos níveis de XIAP em tecido de cancro pré-quimioterapia; B: taxa de sobrevivência global por chemoresponse. Os pacientes cujos tumores foram responsivo à quimioterapia geralmente tiveram um prognóstico melhor do que aqueles pacientes cujo tumor era resistente à quimioterapia; C: pontuações XIAP de amostras pós-quimioterapia. níveis de XIAP em amostras de pós-quimioterapia também foram significativamente relacionados com as taxas de sobrevida global dos pacientes.

nível de expressão de XIAP foi associada a resposta à quimioterapia de pacientes com CECP avançada

Todos esses pacientes com CECP avançadas tinha terminado um ciclo de quimioterapia. Entre eles, 34 casos eram de resposta completa (CR) e uma resposta parcial (PR) à quimioterapia e 26 casos eram doença progressiva (DP) e doença estável (SD). Os pacientes cujos tumores expressos níveis elevados de XIAP foram significativamente mais resistentes a quimioterapia com cisplatina e geralmente tinham respostas de quimioterapia mais pobres (

P

= 0,005, Tabela 1). níveis de expressão de XIAP foram grandemente aumentada nos tecidos CECP pós-quimioterapia, em comparação com as amostras de pré-quimioterapia (

P

= 0,011, Tabela 3). níveis de XIAP em amostras de pós-quimioterapia também foram significativamente relacionados com as taxas de sobrevida global desses pacientes (

P

= 0,029) (Figura 2), embora na análise multivariada, não foi um fator independente relacionado com os pacientes «resultados.

inibir a expressão de XIAP sensibilizados linhas celulares HNSCC para o tratamento com cisplatina

para investigar a relação casual de expressão de XIAP e resposta à droga de pacientes, foram utilizados siRNA para inibir a expressão de XIAP em linha de células de CECP CAL27 e WSU-HN13. Três siRNAs foram concebidos para inibir a expressão de XIAP em células CAL27 e WSU-HN13, e entre eles, o grupo de tratamento siRNA1 obtido redução near70% da expressão de ARNm de XIAP em células (Figura 3). Em comparação com o grupo de controlo negativo, valores de IC50 no grupo cisplatina siRNA1 diminuiu de 0,51 ug /ml a 0,20 ug /ml (

P

= 0,05, figura 4) em CAL27 e de 4,32 a 1,82 ug /ml em WSU -HN13.

eficácia Inibição de siRNA-1, 2-siRNA e siRNA-3 sobre a expressão de ARNm de XIAP em células foi examinada CAL27 (superior) e de células de WSU-HN13 (inferior) com PCR em tempo real . grupo de tratamento de XIAP siRNA1 obtido perto redução de 70% da expressão de ARNm de XIAP em ambas as células.

XIAP siRNA-1 inibiu eficazmente a expressão de proteína XIAP em células tanto CAL27 e WSU-HN13 (superior) e diminuiu o valor de IC50 de cisplatina de 0,51 ug /ml a 0,20 ug /ml em CAL27 e de 4,32 a 1,82 ug /ml em WSU-HN13 (mais baixa).

Discussão

cisplatina baseada neoadjuvante quimioterapia, cirurgia e terapia de radiação utilizada para ser considerado como padrão para pacientes regime CECP avançada em risco elevado; No entanto, os efeitos terapêuticos da terapia neoadjuvante permanecem inconclusivos devido a muitos ensaios randomizados ausência de mostrar uma vantagem de sobrevivência com o uso de quimioterapia neoadjuvante [12], [13]. Embora a administração indiscriminada de endereços quimioterapia neoadjuvante nenhum benefício para a evolução dos pacientes (taxa de sobrevivência de cinco anos foi de 38,33% em nosso estudo), encontramos aqueles pacientes que obtiveram uma resposta clínica tiveram um prognóstico mais favorável (p = 0,001, teste log-rank ), o que é consistente com alguns relatórios anteriores [12], [13]. Deste ponto de vista, avaliando como escolher seletivamente os pacientes que poderiam se beneficiar positivamente de quimioterapia neoadjuvante foi o fator decisivo para o sucesso do tratamento [4].

Neste estudo, verificou-se uma forte relação entre o nível de expressão XIAP e da resposta clínica e prognóstico dos pacientes com CECP avançado. baixa expressão de XIAP foi estreitamente relacionado com resposta à quimioterapia e prognóstico favorável, enquanto que a alta expressão de XIAP pode prever a falha quimioterapia e mau resultado. Os resultados são consistentes com relatos anteriores que mostram que a infra-regulação de XIAP sensibiliza células cancerosas para drogas terapêuticas no câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário e câncer pancreático [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19], [20]. Mais importante, verificou-se que a quimioterapia com cisplatina induziu significativamente a expressão de XIAP em HNSCC avançada. O nível de XIAP maior nas amostras de pós-quimioterapia também associada a um pior prognóstico dos pacientes. Os nossos resultados mostram que a expressão de XIAP é a principal causa de fracasso do tratamento e a expressão de XIAP induzida por quimioterapia levou a um mau prognóstico destes pacientes resistentes aos medicamentos. pacientes negativos XIAP pré-selecionados podem beneficiar do tratamento neoadjuvante baseada em cisplatina. Nossos

in vitro

dados propôs ainda um valor potencial de inibir a expressão de XIAP para aumentar a eficácia da quimioterapia.

Note-se que, contrariamente à maioria dos estudos, observou-se uma associação positiva entre o consumo de álcool e sobrevida global dos pacientes com CECP avançados neste estudo. Interessante, um resultado semelhante foi publicado recentemente, que propôs as diferenças dos nossos dados e tradição cultural pode ser causada por diferentes hábitos de consumo: os pacientes com CECP avançadas da China, muitas vezes bebeu bebidas com alta concentração de álcool (geralmente 50%) , enquanto que os ocidentais geralmente consomem bebidas com muito menor concentração de álcool. Tais concentrações elevadas de álcool pode estimular a mucosa oral e destruir as bactérias equilíbrio, influenciar o curso da doença de HNSCCC avançada [21]. Não podemos excluir a possibilidade de dimensão limitada da amostra e /ou outros fatores que podem ter contribuído para essa observação.

Este estudo foi um estudo de caso-controle retrospectivo e teve algumas limitações. No presente estudo, optou IHC para avaliar a expressão de XIAP, em vez de alguns métodos quantitativos primários, devido à indisponibilidade de tecidos de biópsia frescos. Embora IHC é um método semi-quantitativo, que é agora o, mais simples e mais eficaz de protocolo mais comumente utilizado no custo do trabalho clínico [22]. Além disso, a taxa de expressão de XIAP elevada nas amostras de pré-quimioterapia foi de apenas 20,83%, ao passo que a taxa de resposta à quimioterapia (CR + PR) das pacientes foi de 43,34%. É mais do que provável que muitos factores podem contribuir para a resposta global da droga em HNSCC avançada; expressão de XIAP pode ser apenas um dos muitos fatores envolvidos.

Os resultados do estudo têm implicações clínicas potencialmente importantes. Em primeiro lugar, o nosso estudo mostrou que, pela primeira vez que a expressão de XIAP é associada com a resposta a quimioterapia e pode ser utilizado como um biomarcador para prever os resultados clínicos de pacientes com CECP avançadas, especialmente para aqueles que tiveram a terapia quimioterapêutica com cisplatina. Em segundo lugar, a expressão de XIAP pode ser um biomarcador útil para selecionar pacientes que têm a maior chance de se beneficiar de quimioterapia neoadjuvante baseada em cisplatina. Finalmente, a relação causal entre o nível de expressão de XIAP e resposta à quimioterapia indicam que a infra-regulação de XIAP pode ser uma terapia adjuvante promissor para pacientes com CECP avançados.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das nono Pessoas, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine e realizada de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinki. Sem o consentimento informado (escrito ou verbal) foi obtido para o uso de amostras de tecido retrospectivos dos pacientes dentro deste estudo, muitos dos quais foram mortas, uma vez que a Comissão de Ética, que dispensou a necessidade de consentimento, não o considerem necessário. Todas as amostras foram anónimo.

Cultura celular

linha de células de carcinoma epidermóide humano CAL27, que era resistente ao tratamento com cisplatina, foi obtida a partir da Colecção de Tecidos Americana celular (Manassas, VA, EUA) e cultivadas em DMEM (Gibco, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de glutamina, e 1% de penicilina-estreptomicina. A linha celular de WSU-HN13 [23] era dotado da Universidade de Maryland School dental (Baltimore, MD, EUA) e também cultivadas em DMEM (Gibco, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de glutamina, e 1 % de penicilina-estreptomicina

pacientes e Tumor amostras

Sessenta pacientes com CECP avançada. (estádio clínico III /IV-a;.. UICC /AJCC 7 ed, 2010) foram recrutados neste estudo. Todos os pacientes aceitaram quimioterapia neoadjuvante baseada em cisplatina seguido de ressecção do tumor radical dentro de duas a três semanas de completar a quimioterapia no Departamento de Cirurgia Oral e Maxilofacial, Hospital nono Pessoas, Shanghai Jiao Tong University de janeiro de 1999 a dezembro de 2004.

a resposta clínica de quimioterapia foi avaliada pelo menos 2 semanas após os pacientes completaram a quimioterapia de acordo com critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST) [24]. Uma CR foi definida como o desaparecimento completo de todas as lesões mensuráveis, sem o aparecimento de quaisquer novas lesões. A RP foi definida como uma redução nas lesões mensuráveis ​​bidimensionalmente por, pelo menos, 50 por cento da soma dos produtos das suas maiores diâmetros perpendiculares e uma ausência de progressão em outras lesões, sem o aparecimento de quaisquer novas lesões. SD [9] foi definido como uma redução no volume de tumor de menos do que 50 por cento ou um aumento do volume de uma ou mais lesões mensuráveis ​​de menos do que 25 por cento, sem o aparecimento de quaisquer novas lesões. DP foi definida como um aumento no tamanho de pelo menos uma lesão mensurável bidimensionalmente por, pelo menos, 25 por cento e o aparecimento de novas lesões. informações clínico-patológico do paciente é apresentada na Tabela 4. Todos os doentes foram tratados com as operações normais de cura com margem de ressecção negativo. Todos os pacientes receberam radioterapia pós-operatória dentro de duas e seis semanas de completar a cirurgia. A dose total para a área do tumor primário e do pescoço dos gânglios positivos foi 6000cGy e para tumor primário e do pescoço dos gânglios negativos foi 5000 cGy.

Análise Western Blot

A proteína total foi lisadas em 2 × tampão de lise contendo Tris-HCl 125 (pH 6,8), 5% w /v de SDS, e 24,75% de glicerol. 40 ug de proteínas foram separadas utilizando 12% de SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de PVDF. Após incubação durante a noite com o anticorpo monoclonal de ratinho-humano anti-XIAP (BD, EUA) a uma diluição de 1:4000 e incubação de uma hora com o anticorpo secundário anti-ratinho de cabra IRDye 800CW (LI-COR, EUA), o sinal foi digitalizada e analisada usando o Infrared Imaging System Odyssey (LI-COR Biosciences, EUA). β-actina (Sigma-Aldrich, EUA) foi usada como um controlo interno.

-PCR em tempo real

O ARN total foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA). 1 ug de ARN total wasreverse transcrito em cDNA utilizando oligo-dT e RTase PrimeScript II (Takara, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizado com térmica Cycler Dados real do sistema do tempo (Takara, Japão). Os primers para PCR foram desenhados com v3.0 de software Primer Express (Applied Biosystem, EUA). As sequências dos iniciadores de XIAP foram: 5′-CCGGCTGTCCTGGCGCGAAA-3 ‘e 5′-GCTCGTGCCAGTGTTGATGCTGA-3’. As sequências dos iniciadores de β-actina foram: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3 ‘e 5′-GGGCCGGACTCGTCATACT-3′, e as sequências de iniciadores de GAPDH foram: 5’-AATTGAGCCCGCAGCCTCCC -3 ‘e 5′-ACCAGGCGCCCAATACGACC-3’. Todos os iniciadores foram separados por, pelo menos, um intrão no ADN genómico correspondente. A análise da curva de dissociação foi incluído em todas as reacções para excluir a amplificação não específica. A quantidade relativa de ARNm de XIAP nível foi calculada com base nos métodos ΔΔCT normais [25]. Ambos β-actina e GAPDH foram utilizados como controle interno.

siRNA Knockdown

Três anti-XIAP siRNAs cada visando as duas variantes de processamento de XIAP e um controle negativo marcado com FAM siRNA (não- sequência alvo), foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China). As sequências foram: siRNA1: GGUCAGUACAAAGUUGAAATT, siRNA2: GCAGGUUGUAGAUAUAUCATT, siRNA3: CCGGAAUCUUAAUAUUCGATT e controle negativo: AAUUCUCCGAACGUGUCACGU. A transfecção foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA), seguindo o protocolo do fabricante.

Imunohistoquímica

pré e pós-quimioterapia blocos de parafina de tecido representativo foram cortadas com 5 mm de para coloração imuno-histoquímica padrão (IHC ). Após recuperação de antigénio induzido pelo calor, em tampão de ácido cítrico (pH 7,0) durante 20 min e o bloqueio em 5% de soro de cabra durante 30 minutos, as lâminas foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-humano de XIAP (BD, EUA) a uma diluição de 1: 100 a 4 ° C durante a noite. A omissão do anticorpo primário serviram como controlo negativo. O anticorpo ligado foi detectado por um sistema de detecção de IHC Super sensível (BioGenex, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. As secções foram visualizados com (, Sigma EUA) e tetracloridrato de diaminobenzidina solução contrastadas com hematoxilina de Harris. O resultado de coloração foi determinada por contagem de 1000 células de tumor em três 100 × campos de ampliação por dois patologistas independentes e adicionalmente classificados como baixa expressão (a percentagem da taxa positiva 25%) e de expressão elevada (a percentagem da taxa positiva ≥25%) .

droga sensibilidade do ensaio

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 4 x 10

3 células /poço e incubadas durante mais 24 h. 6 h após a transfecção com controlo negativo ou ARNsi, o meio foi removido e substituído com meio fresco containingone de diluições em série de DDP durante mais 72 h, incluindo o controlo negativo sem DDP. Em seguida, 20 uL de corante MTT esterilizado (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-di-phenyltetrazolium, 5 mg Dissolveu-se em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato, Sigma, EUA) foi adicionada à meio de cultura para uma concentração final de 0,5 mg /ml e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. Subsequentemente, os cristais de formazan foram solubilizados com 150 uL de sulfóxido de dimetilo durante 10 min. espectrometria de absorvância a 490 nm foi medida com um leitor de microplacas. Cada experimento foi realizado em triplicado.

Análise Estatística

O pacote de software SPSS 17.0 foi utilizado para análise estatística. Frequências foram comparados com o teste exato de Fisher, × 2 teste de contingência, ou testes não-paramétricos, conforme apropriado. Estimou-se curvas de sobrevida e tempo de progressão utilizando o método de Kaplan-Meier e comparou-os usando um teste de log-rank de dois lados. Regressões logísticas múltiplas que utilizaram um modelo de riscos proporcionais de Cox foram utilizados para determinar se as características moleculares dos tumores preditores independentes de sobrevivência em nossa coorte de pacientes com CECP avançados. P 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

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