Sumário
Nós relatamos alterações mecânicas de células em resposta a alteração da expressão do humano equilibrative nucleosídeo transporter-1 (hENT1), uma membrana plasmática transportador de nucleosídeo mais abundantes e amplamente distribuídas em células e /ou tecidos humanos . Modulação do nível de expressão hENT1 alterou a rigidez da Capan-1 e Panc 03.27 células cancerosas no pâncreas, que foi analisada por microscopia de força atômica (AFM) e correlacionados com plataforma microfluídica. A redução induzida hENT1 knockdown de rigidez celular em ambas as células até 70%. Além disso, as alterações fenotípicas celulares, tais como a morfologia celular, a migração, e o nível de transição (EMT) marcadores epiteliais mesenquimais-expressão foram observados após hENT1 knockdown. As células com hENT1 suprimida ficou alongado, migraram mais rapidamente, e tinha reduzido de E-caderina e N-caderina elevado comparado com as células parentais que são consistentes com a transição epitelial-mesenquimal (EMT). Essas mudanças fenotípicas celulares estreitamente correlacionadas com as mudanças na rigidez celular. Este estudo sugere que o nível de expressão hENT1 afeta o fenótipo celular e comportamento elástico celular pode ser um biomarcador física para a expressão hENT1 quantificar e detectar mudança fenotípica. Além disso, a mecânica de células pode ser uma ferramenta crítica para detectar progressão da doença e resposta à terapia
Citation:. Lee Y, Koay EJ, Zhang W, Qin L, Kirui DK, Hussain F, et al. (2014) Human Equilibrative nucleosídeos Transporter-1 Mecânica Knockdown Tunes celular através epitelial-mesenquimal Transição em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (10): e107973. doi: 10.1371 /journal.pone.0107973
editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 03 de julho de 2014; Aceito: 16 de agosto de 2014; Publicação: 14 de outubro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e a sua arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Os autores agradecem o apoio financeiro das seguintes fontes: Departamento de Defesa concede W81XWH-09-1-0212 e W81XWH-12-1- 0414, Instituto Nacional de Saúde concede U54CA143837 e U54CA151668, o RP121071 concessão CPRIT do Estado do Texas, eo Ilustre Presidente Endowed Ernest Cockrell Jr.. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
adenocarcinoma do pâncreas (PDAC) é um dos cancros humanos mais letais com um prognóstico extremamente pobre [1]. PDAC possui baixa taxa de sobrevivência, mesmo após a ressecção completa do tumor, que é a única chance de cura. Infelizmente, a maioria dos tumores são não operável e metastático. Deste modo, a quimioterapia e /ou radioterapia são as únicas opções [2], [3]. Gemcitabina (2 ‘, 2’-difluorodesoxicitidina) é um dos agentes anti-cancro eficazes para o cancro do pâncreas [1]. É um análogo de nucleósido pirimidina citotóxico que é transportado para dentro do compartimento celular através da proteína de transporte principal, humano equilibrative transportador nucleósido-1 (hENT1), e, eventualmente, inibe a replicação do ADN. O nível de expressão hENT1 em células de câncer de pâncreas foi previamente correlacionado com eficácia terapêutica em que células com maior expressão hENT1 foram mostrados para responder melhor a gemcitabina. Além disso, estudos nível celular também têm demonstrado que as células de cancro do pâncreas com baixa expressão hENT1 são altamente resistentes a gemcitabina [4]. Além disso, estudos clínicos têm demonstrado que a expressão hENT1 afetar a forma como pacientes respondem ao tratamento, onde os pacientes cujo tumor expressou baixo biomarcador hENT1 responderam mal à terapia gemcitabina [3], [5].
células cancerosas do pâncreas que adquirem gemcitabina resistência são caracterizados por transição (EMT) fenótipo epitelial-mesenquimal e mostram mudanças morfológicas distintas de motilidade celular epitelial para fusiformes e aumentando a [6], [7]. EMT é um processo biológico que as células epiteliais polarizadas mudar para um fenótipo mesenquimal semelhante através de várias alterações bioquímicas. Esta transição fenotípica é caracterizada pela perda de adesão célula-célula e alterações dinâmicas na estrutura do citoesqueleto que levar as células a separar a partir do epitélio e para obter a capacidade de migrar para locais distantes [8], [9]. Assim, no presente estudo, a hipótese que a modulação dos níveis de expressão hENT1 em células de cancro do pâncreas podem alterar as suas características fisiológicas, uma vez que pode induzir a mudança fenotípica por inibição da absorção de gemcitabina. Além de métodos bioquímicos para identificar alterações fisiológicas celulares, mecânica celulares compreensão pode fornecer novos insights biológicos. Estudos recentes revelam que as propriedades mecânicas de células fornecem informação crucial para compreender vários comportamentos biofísicas, que incluem a forma da célula, motilidade, e a adesão de células que gerar uma cascata de sinais bioquímicos que são cruciais para as respostas biológicas [10]. As assinaturas mecânica das células pode ser uma ferramenta importante em vários aspectos: (1) a identificação de células de cancro a partir de células normais com base na sua rigidez relativamente inferior [11]; (2) A antecipação de um potencial metastático de células de cancro como a rigidez celular correlaciona-se inversamente com a migração e invasão [12] – [14]; (3) Reconhecimento de mudanças fenotípicas associadas à alteração da estrutura intracelular e motilidade em células cancerosas através da medição de aumentos ou diminuições de módulo elástico [11], [15] – [18]. Embora não haja nenhuma evidência direta de que hENT1 está relacionada a eventos fenotípicas em células de câncer de pâncreas, podemos especular que a expressão hENT1 pode modular comportamentos biofísicos celulares baseada na estreita correlação entre a expressão hENT1 e sensibilidade gemcitabina. A mudança fenotípica celular a partir de células resistentes gemcitabina estabelecidas por cultura de células para aumentar a concentração de gemcitabina em série também apoia a nossa hipótese.
Neste estudo, dois métodos diferentes, AFM e uma plataforma de microfluidos, foram utilizados para avaliar o modo como a modulação de influências nível de expressão hENT1 na rigidez das células de câncer de pâncreas. Em seguida, as alterações morfológicas que a acompanham, citoesqueleto rearranjos, motilidade celular e alterações nos níveis dos marcadores EMT expressão para investigar mudança fenotípica celular foram caracterizados (Figura 1). Juntos, nossos resultados no nível de expressão hENT1 e rigidez celular correlaciona muito bem com as alterações mecanicistas da estrutura do citoesqueleto intracelular, motilidade celular e sugerem que as propriedades elásticas celulares pode estimar nível de expressão hENT1, bem como mudança fenotípica.
O hENT1 knockdown induz alterações na mecânica celulares através EMT acompanhadas por alterações nos níveis de expressão de e-caderina e N-caderina, morfologia celular e a motilidade das células de cancro do pâncreas. Além disso, hENT1 knockdown induz diminuição da rigidez das células, como demonstrado nas curvas de separação vigor representativos obtidos a partir Panc 03.27 células (gráfico superior a partir de uma célula-mãe, o segundo gráfico a partir de uma célula knockdown hENT1). Utilizando AFM
materiais e Métodos
cultura celular
Todas as linhas celulares foram adquiridos a American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). O AsPC-1, BxPC-3, mia Paca dois, e Panc-1 As células foram cultivadas em Dulbeccos Modified Eagles Médium (DMEM, Thermo Hyclone Scientific, Waltham, MA) com soro de bovino fetal a 10% (FBS, ATLAS Biologicals, Fort Collins , CO), Capan-1 em meio DMEM com FBS a 20%, e Panc 03,27 em meio RPMI 1640 (Hyclone Thermo Scientific, Waltham, MA), com 15% FBS e insulina humana recombinante (10 unidades /mL, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) na presença de 5% de CO
2 a 37 ° C.
knockdown hENT1 com ARNsi transfecção
as células foram cultivadas em disco de 6 cm de cultura de células a uma densidade de 5 × 10
5 células /prato. Após lavagem com PBS, as células foram tratadas com INTERFERin (Polyplus transfecção ™) contendo ARNsi contra hENT1 (SmartPool: em-alvo mais SLC29A, Dharmacon, Inc., Pittsburgh, PA) ou siARN (controlo negativo negativo Silenciador No. um siRNA, AM4635 , Invitrogen, Grand Island, Nova Iorque) numa concentração de 50 nM em Opti-MEM (Invitrogen, Grand Island, NY). Após 24 horas da transfecção, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas durante 3 dias.
análise de transferência de Western
As células foram lisadas com tampão RIPA Pierce (Thermo Scientific, Waltham, MA) com o inibidor da protease cocktail (Thermo Scientific, Waltham, MA). Os lisados celulares (10 ug) com tampão de carregamento (tampão de amostra LDS não redutor, Thermo Scientific, Waltham, MA) foram aquecidos durante 5 min a 95 ° C. Os lisados celulares e de proteínas escada (2 Xpert prestained proteína marcadora, GenDEPOT) carregado em géis de poliacrilamida (Qualquer kD Mini-PROTEAN TGX Precast Gel, Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidas para nitrocelulose de membrana (Bio-Rad, Hercules, CA) . As membranas foram bloqueadas com tampão de bloqueio, TBST (NaCl a 20 mM de Tris pH 7,6 /150 mM /0,05% de Tween 20) contendo 5% de leite durante uma hora. As membranas foram incubadas durante a noite com TBST e leite a 5% contendo os anticorpos primários em determinadas proporções: anticorpo anti-hENT1 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anticorpo anti-E-caderina (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anticorpo anti-N-caderina (1:500, Abcam, Cambridge, MA); citoqueratina 18 (1:1000, tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA); Lamin A /C (1:1000, tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA); anticorpo anti-GAPDH (1:2000, tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA). Depois de se lavar três vezes com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos e TBST contendo 5% de leite secundário, anti-IgG de ratinho, um anticorpo ligado a HRP (1:5000, tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA) ou IgG anti-coelho, HRP anticorpo -Conectado (1:5000, tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA), durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, as manchas colocado sobre uma mistura de Pierce substrato ECL Western blotting (Thermo Scientific, Waltham, MA) e Lumigen TMA-6 (Lumigen, Inc., Southfield, MI), e as proteínas foram detectadas.
Imunofluorescência
células de cancro pancreático foram semeadas em placas de 6 poços contendo esterilizado, colagénio I (Invitrogen, Grand Island, NY) -Revestido lamelas (22 × 22 mm, Corning) a uma densidade de 2 × 10
5 células /poço. As células foram preparadas com três grupos: 1) Controlo (sem tratamento); 2) precipitação (transfectadas com siRNA controle negativo); e 3) knockdown hENT1. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (Affymetrix, Santa Clara, CA) durante 30 min à temperatura ambiente e depois permeabilizadas com 2% de Triton X-100 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 min. Após bloqueio com albumina de soro bovino a 2% (Calbiochem) durante 1 hora, as células foram incubadas durante a noite com o anticorpo anti-Vinculina (1:200, Abcam, Cambridge, MA), anti-caderina-E (1:200), anti- N-cadhrein (1:100), anti-cytoketarin 18 (1:200), ou anti-lamina a /C (1:200) a 4 ° C com agitação suave. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS durante 10 min e incubadas com Alexa 488 ou anticorpos secundários conjugados com 594 durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, para a coloração de F-actina, as células foram incubadas com Alexa Fluor 488 faloidina (1:250, Invitrogen, Grand Island, NY) durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, os núcleos foram coradas usando a Hoechst 33342 (Molecular Probes, Life Technologies, Grand Island, NY) durante 10 min. As células foram monitorados por microscópio confocal de varredura a laser (CLSM, Olympus FluoView FV1000).
medições AFM
rigidez celular foi medida pela técnica vigor curva em um Bioscope (Bruker Corporation, Billerica, MA). As células foram cultivadas em 6 cm de placa de cultura de células e todas as medições foram realizadas em meio de cultura a 37 ° C. A AFM foi equipado com um microscópio de luz invertido (Olympus IX81), de modo que as células foram constantemente monitorizados. Para minimizar os danos celulares, de micropartículas de sílica (diâmetro: 5 um) de silício consolas de nitreto modificados (Novascan Technologies, Inc., Ames, IA), com valores de constante de mola de aproximadamente ~0.06 N /m foram utilizados em todas as experimentações AFM. O valor da constante de mola exacta foi medido pelo método de ajuste térmico. As sondas foram posicionados no proximidades núcleos das células sob controlo óptico, e curvas de força foram adquiridos a uma taxa de amostragem de 1 Hz. o módulo de Young, E, foi calculada a partir de curvas de força obtidos com base no modelo Hertz (Eq. 1) usando o programa de análise Nanoscope da Bruker corporação. (1) onde F = força, módulo de E = de Young, ν = razão de Poisson (ν = 0,5, neste estudo), R = raio do penetrador (R = 2,500 nm, neste estudo), e δ = profundidade de penetração.
Para obter o módulo de Young, dois experimentos independentes foram realizados e força curvas de pelo menos 50 células foram coletadas em cada experimento.
projeto MS-chip e fabricação
wafers de silício (4 polegadas) da Corning Inc. SU-8 2015 fotorresiste, e SU-8 desenvolvedor de Microchem Corp. e polidimetilsiloxano (PDMS RTV615) da Momentive performance Materials Inc. foram utilizados. O padrão microchip foi projetado com software AutoCAD (Autodesk Inc.) e depois impressa quanto 10 mícrons máscaras resolução cromo perto Photo Science Inc. O padrão photomask foi traduzido pela primeira vez para uma microestrutura de uma pastilha de silício 4-in usando SU-8 2015 foto-resistente, que é um molde para a fundição de materiais PDMS. Resumidamente, o molde foi preparado por revestimento por rotação SU-8 2015 fotorresistência sobre uma bolacha de silício e de reticulação por UV durante 180 segundos. Subsequentemente, o padrão concebido foi desenvolvido usando SU-8 programador (Microchem Corp.) e limpas com álcool isopropílico e azoto gasoso. Os furos para as entradas e saídas foram perfurados com agulhas. A camada de PDMS foi limpo por lavagem com álcool isopropílico e água desionizada e seca com azoto gasoso. Após o tratamento com plasma de oxigénio, a camada de PDMS foi ligado imediatamente a uma lâmina de vidro de 75 × 50 mm. Finalmente, o dispositivo ligado foi cozida durante 2 h a 80 ° C.
on-chip de separação de células
, os canais em MS-chip e o tubo Tygon ligada à entrada de chips foram humedecidas com PBS e depois mantidos com 0,5% de BSA em PBS durante 1 hora. blocos de BSA a aderência de superfície e mais um impeditivo não específica de células de PDMS. As membranas de controlo e células hENT1 knockdown foram coradas utilizando Alexa Fluor 594 ou 488 conjugado com aglutinina de gérmen de trigo (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), respectivamente. A mistura de células em quantidades iguais a uma densidade final de 1 × 10
5 células /ml foi preparada. As células em suspensão foram então aplicadas para o MS-chip por meio de um tubo de Tygon. Durante a experiência, azoto gasoso comprimido foi aplicada à suspensão de células a uma pressão de ~ 10 psi (69 x 10
3 Pa). Uma separação típica durou -15 min, e a taxa de fluxo média foi controlada a 1-2 mL /h. As células aplicadas para o MS-chip foram fotografadas por microscopia de fluorescência (IX81, Olympus). Número de células retidas no chip após a separação foi contado por imagem J.
In vitro
zero ensaio
O ensaio zero foi realizado em ambos células nativas (controle) ou transfectadas células (mexidos e siRNA contra hENT1) para estudar o efeito de hENT1 knockdown na migração celular. células Capan-1 Panc 03,27 ou foram semeadas em placa de 24 poços. Quando as células são cerca de 50-60% confluentes, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, transfectadas com ARNsi contra INTERFERin contendo hENT1 ou siRNA negativo a uma concentração de 50 nM em Opti-MEM. Passadas 6 horas da transfecção, as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubaram-se durante 2 dias. Um risco de a monocamada de células foi criada utilizando uma ponta de pipeta. Em seguida, lavou-se as placas e foi substituído com a forma desejada. O microscópio de lapso de tempo (EVOS FL Auto Imaging System, Life Technologies) com câmara (95% de ar e 5% de CO
2) e controle de temperatura (37 ° C) foi usado para a aquisição das imagens do mesmo campo automaticamente para 18 horas. As imagens obtidas foram analisados quantitativamente usando uma imagem J.
A análise estatística
Os dados são expressos como média ± desvio padrão. A significância estatística foi identificado por análise de duas vias ANOVA utilizando o GraphPad Prism 5.0. AP valor. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados e Discussão
Para investigar a correlação entre o nível de expressão hENT1 e celulares mecânica, dois tipos de linhas celulares de cancro do pâncreas, Capan-1 e Panc 03,27 com relativamente maior expressão hENT1 (Figura S1 no arquivo S1), foram escolhidos. Por siARN transfecção, as células foram regulados negativamente hENT1 estabelecidos (Figura 2). Nós então medido alterações na mecânica de células por dois métodos diferentes, AFM e separação microfluídico. medidas AFM propriedades elásticas de células vivas através de uma interação mecânica direta entre uma sonda e da superfície celular. rigidez celular afecta a extensão de deflexão cantilever após interacção com a superfície de células aderentes [19]. A indentação célula viva induz deformação de compartimentos celulares que incluem membrana, citoesqueleto, núcleo, e vários organelos. Assim, as propriedades elásticas das células resultam dos efeitos agregados de deformar numerosos componentes celulares. Foi utilizado um micropartículas de sílica (diâmetro: 5 mm) cantilever modificado (Figura S2 em S1 Arquivo) para reduzir os danos da membrana celular durante o contacto e distorcer o conjunto de dados diferente do que uma ponta afiada. Para otimizar a força de recuo, foi aplicado vigor até 10 nN como mostrado na Figura S2 em S1 Arquivo. módulo de células Panc 03.27 Uma constante de Young foi obtido dentro das forças de recuo até 200 pN, indicando a medida da rigidez celular utilizando AFM é válida apenas com pequenas deformações das células vivas. Ambas as linhas celulares mostraram uma tendência semelhante com a mesma força de recuo, ou seja, 100 pN. As células de controlo e células transfectadas por siRNA negativos foram significativamente mais duras do que as células hENT1 knockdown (Figura 2 e Figura S3 em S1 arquivo). A rigidez de célula médio de ambas as células de controlo é 2,95 ± 1,55 kPa (Capan-1) e 1,91 ± 0,78 kPa (Panc 03.27); no entanto, que as células de hENT1 knockdown mostrou diminuiu significativamente módulos de Young com valores de 1,50 ± 0,63 kPa (Capan-1) e 0,59 ± 0,22 kPa (Panc 03.27).
(A) Western blot de hENT1 (55 kDa ) e GAPDH (37 kDa) em Capan-1 (à esquerda) e Panc 03.27 células (direita) sem tratamento (Ctrl) ou após o tratamento de siRNA negativo (scrl) ou hENT1 siRNA (hENT1 ↓), (B) histogramas de barras mostram Young módulo de controle, siRNA negativo transfectadas e hENT1 células knockdown. (N.S: estatisticamente não significativo)
Desde AFM é limitada a medição de locais da mecânica celulares, também avaliamos deformabilidade celular utilizando método de separação de microfluidos [20] para corroborar as conclusões AFM.. Um chip de separação mecânica (MS-chip, Figura 3A), foi concebido com microbarriers artificiais em combinação com a força hidrodinâmica deformável separada a partir de células rígidas [21]. Para demonstrar a capacidade do MS-chip para separar células com base na capacidade de deformação, testou-se a separação de uma mistura contendo duas células diferentes: controlo e hENT1 knockdown. Membrana de controlo e células hENT1 knockdown foi corado usando Alexa Fluor 594 e 488 conjugado com aglutinina de gérmen de trigo (WGA), respectivamente. Como mostrado na Figura S4 S1 em arquivo, o efeito sobre a rigidez de WGA celular é insignificante. A proporção das duas linhas de células variou ao longo do comprimento do chip. Tal como mostrado na Figura 3D e 3G, os diâmetros de ambos células, controlo e hENT1 knockdown, foram semelhantes. A mistura de células em quantidades iguais a uma densidade de 1 x 10
5 células /mL foi injectada para o MS-chip e fluiu durante 15 min. A matriz lacunas entre mensagens neste projetado gama MS-chip de 22 um a 2 mm. Os canais de evitar a obstrução que ocorre em repetir matrizes de mensagens que regulam e equalizar a pressão hidrodinâmica ao longo do chip. Supõe-se que não haja contacto físico entre os pilares e as células PDMS porque o PDMS é revestido com BSA. A tensão de cisalhamento é um fator principal para interagir com as células. Quando o tamanho da folga de pós matrizes é maior do que o diâmetro de célula, a força de pressão (F
P, 10 psi no presente estudo) é a única força que actua sobre as células. Se o diâmetro da célula é o mesmo ou maior do que o tamanho da folga, a força de atrito (F
f) se opõe à força de pressão (Figura 3B). Se as células são mais rígidos, eles empurrar com mais força sobre as matrizes de correio, e em seguida F
f é significativamente aumentada. Figura 3C mostra Panc 03.27 células presas na MS-chip fotografada por microscopia de fluorescência; fluorescência vermelha mostra células controlo e de fluorescência verde mostra células hENT1 knockdown. Na entrada, igual número de controlo vermelho Panc 03.27 (ou Capan-1) e células hENT1 verde knockdown Panc 03.27 (ou Capan-1), foram observadas células (Figura 3C e 3E-I). Nesta região, canais eram muito mais larga que o diâmetro das células, resultando em nenhuma separação significativa de células flexíveis e rígidas. Devido ao diâmetro menor de células Capan-1 (diâmetro médio: 15 uM), a separação foi conseguida com tamanho 8 uM lacuna de pós matrizes. Mas, em caso de Panc 03.27 células (diâmetro médio: 19 uM), a maior separação ocorre a 12 um. Nessas linhas celulares, as células do grupo controle foram consistentemente preso enquanto as células hENT1 knockdown passou pelas lacunas com mais frequência. Estas experiências demonstram a eficiência global de separação entre os dois fenótipos diferentes com diâmetro semelhante na MS-chip. Assim, podemos concluir ambas as células de controlo são relativamente mais dura do que as células hENT1 knockdown, e esses resultados estão de acordo com os achados de AFM.
(A) fotografia (esquerda) do chip de separação microfluídico (MS-chip) visualizada por vermelho tingir dentro e imagem um representante microscopia eletrônica de varredura (à direita) da matriz post (diâmetro da coluna: 35 mm, altura de coluna: 30 mm). (B) imagem Campo brilhante e esquema das células que fluem em MS-chip quando o diâmetro da célula é menor do que o tamanho da folga pilar (seta vermelha indica células). Assume-se aqui que o atrito é devido apenas à tensão de cisalhamento (F
p: força de pressão contra a pressão aplicada (10 psi neste estudo), F
f: força de atrito). (C) A imagem de fluorescência de um dos canais entre os oito shows retido Panc 03.27 células do MS-chip após a separação de Panc 03.27-ctrl (fluorescência vermelha) e Panc 03.27-hENT1 knockdown (fluorescência verde). maior ampliação confocal imagens representativas microscópicas do chip MS (tamanho gap de 12 mm a 6 mm) mostram a eficiência da separação através de aberturas. distribuição do tamanho das células (D: Capan-1, G: Panc 03.27 células). A análise estatística das células (E: Capan-1, H: Panc 03,27) e taxa de fração de células (F: Capan-1, I: Panc 03,27) retida no chip. Os valores representam ± desvio padrão.
Para entender como hENT1 influencia a mecânica de células, alterações fisiológicas em células após hENT1 knockdown foram estudados por microscopia confocal. Observou-se que as alterações morfológicas celulares associados com knockdown hENT1. Como mostrado na Figura 4, as células foram visualizadas com laser confocal de microscópio de varrimento e o arredondamento celular foi analisada quantitativamente por o cálculo dos factores de formulário (FF). O FF é obtido pela equação, 4π (área) a /(perímetro)
2, o que dá um valor de 1 para um perímetro circular e perfeitamente decrescentemente menores valores positivos para perímetros circulares menos [22]. células Capan-1 Panc 03,27 e são do tipo epitelial e que estão intimamente ligados um ao outro por meio de complexos de adesão intercelulares. Eles têm formas quadradas com valores FF de 0,74 ± 0,08 e 0,77 ± 0,06, respectivamente (Figura 4B). Em contraste, ambas as células após hENT1 knockdown tornou-se muito menor alongado com FF com valores de 0,44 ± 0,14 e 0,52 ± 0,16, respectivamente
(A) micrografias confocal representativos de células pancreáticas (Painel superior:. Capan-1, painel inferior: Panc 03.27) mostrando a distribuição F-actina, (B) fator de forma (f = 4πa /p
2; a: área; p: perímetro) analisados por Image J (células Capan-1, ctrl: n = 37, scrl: n = 59, hENT1 ↓: n = 29; Panc 03,27, ctrl: n = 36, scrl: n = 28, hENT1 ↓: n = 28, NS: estatisticamente não significativo)
.
Além disso, foi avaliado o efeito de hENT1 knockdown na organização do citoesqueleto. Nós coradas para vinculina, o qual controla a formação de adesões focais (FAS), interagindo directamente com a actina e de outras proteínas que estão envolvidas na formação FA [23]. CC, locais de aderências entre a célula e a matriz extracelular (ECM), e fibras de stress na margem têm papéis definidos na movimentação da célula para a frente [23], [24]. Estudos relataram que o tamanho FA está correlacionada com a velocidade de célula; FAs maiores encontrados em células mais alongadas e mais rápido em movimento [25], [26]. Neste estudo, analisou-se a redistribuição de actina F e mudanças na área de adesão focal de células hENT1 knockdown (Figura 5). fibras de actina em ambos os grupos de controle foram na sua maioria concentrados em torno da periferia da célula, e foram observadas pequenas, FAs nascentes. Mas, depois de knockdown hENT1, houve um aumento do número de fibras de stress, bem como áreas de adesão focal mensuráveis. Estes resultados sugerem aumento da motilidade celular em ambas as linhas celulares.
Micrografia confocal (Z-pilhas de plano basal, 0-1,5 mm), mostrando vinculin (vermelho) e F-actina (verde) em (A) Capan- 1 e (B) Panc 03.27 células. Área de adesão focal (pixel
2) é analisado por imagem J.
Além disso, a fim de compreender efeito da hENT1 knockdown na motilidade celular, que examinou o efeito de regulação baixa de hENT1 em migração celular. Um zero ferida foi introduzido em monocamada de células confluentes, e, em seguida, observou-se a selagem da ferida durante 18 horas (Figura 6). A área de fecho da ferida foi calculado usando uma imagem J e a velocidade de migração (área de fecho da ferida (iM
2) /hora) foi calculada como se mostra na Figura 6. A área de ferida vedação e migração de velocidade tanto de células de controlo e células transfectadas com ARNsi precipitação são semelhantes. Mas hENT1 suprimida Capan-1 ou Panc 03.27 células migram 1,8 (1,7) ou 1,5 (1,5) vezes de mais rápido do que o controle (transfectadas disputa siRNA) células, respectivamente. Assim, podemos confirmar que a regulação negativa da hENT1 induz a formação de adesões focais maiores e promove a migração de células mais rapidamente. Com base em alterações morfológicas celulares e aumento da motilidade celular, é possível que ambas as células estão a sofrer alterações fenotípicas, que está associado com a adesão entre as células afrouxada e rearranjo citoarquitectónica. Após EMT, reorganização do citoesqueleto, juntamente com o aumento da FA dinâmica é crucial para as células a deixar o epitélio e começar a migrar através da MEC [22], [27], [28]. Por exemplo, um estudo recente mostrou que o aumento da migração de células pós-EMT SKOV-3 que foi factor de crescimento transformante-β (TGF-β) que gerou maiores forças mecânicas FA do que a de células pré-EMT [16]. TGF-β é relatado como indutor de EMT em diferentes linhas de células epiteliais, incluindo tubular proximal renal e células epiteliais alveolares [16], [29], [30]. O aumento da interação do citoesqueleto de actina e moléculas intracelulares com FAs iniciadas pela associação de α5β1 integrina e fibronectina reforçada motilidade celular [16].
Os riscos foram introduzidas para monocamada (A) Capan-1 e (D) Panc 03,27 células. As fotografias foram tiradas imediatamente após a indução da ferida durante 18 horas. O Capan-1 e 03.27 células (E) Panc ferida áreas de (B) de selagem foram calculados usando o programa Image J e comparado com o controlo, siARN precipitação transfectadas e células hENT1 knockdown. velocidade de migração de (C) Capan-1 e 03.27 células (F) Panc foi calculado.
A fim de confirmar essas alterações fisiológicas induzidas pelo hENT1 knockdown estão relacionados com a EMT, analisamos alterações no marcador EMT proteínas, como a e-caderina e N-caderina, após knockdown hENT1. E-caderina é uma das moléculas de adesão célula-célula. Isso mantém contactos célula-célula e arquitectura epitelial. A alternância de expressão de caderinas de E-caderina para N-caderina, que é expresso principalmente nas células mesenquimais, ocorre durante EMT. Esta alternância conduz a uma alteração drástica as propriedades adesivas de células, uma vez que perde a sua afinidade para os vizinhos epiteliais e ganhos de afinidade para células mesenquimais, que são não polarizada, junções intercelulares falta, e têm uma forma fusiforme única [27], [ ,,,0],31], [32]. Após hENT1 regulação negativa, ambas as linhas celulares apresentou baixa expressão de E-caderina e alta expressão de N-caderina, que são uma importante característica da EMT (Figura 7). A perda de E-caderina e ganho de N-caderina aumenta a motilidade celular e potencial metastático. Vários estudos demonstraram que a redução da rigidez da célula correlaciona-se directamente com o aumento do potencial metastático utilizando vários métodos de análise biomecânica in vitro [11], [17], [33]. A redução na rigidez modula celular que as células estão a sofrer EMT após hENT1 knockdown como é demonstrado na Figura 2. No entanto, há diferença negligenciável nos níveis de filamentos intermédios, citoqueratina 18, e citoesqueleto nuclear, lamina A /C de expressão em ambas as linhas celulares (Figura S5 no ficheiro S1).
Western blot e os niveis de expressão relativos de e-caderina (110 kDa), N-caderina (140 kDa) em (a) Capan-1 e (C) Panc 03.27 células após o tratamento com siRNA hENT1. Colunas em histogramas são a média de duas experiências independentes (relação da intensidade de GAPDH a E-caderina ou N-caderina). imagens confocal representativas de E-caderina (fluorescência vermelha) e expressões em (B) Capan-1 e (D) Panc 03.27 células N-caderina (fluorescência verde).
para confirmar nossos estudos supracitados que EMT sugerem que pode ser caracterizada por alterações na rigidez celular, foi avaliada alterações fenotípicas de células de cancro do pâncreas após tratamento com TGF-β. O TGF-β foi avaliado em vários estudos para induzir EMT [15], [16], [30]. Portanto, nós examinamos ainda mais esses resultados em outro experimento utilizando células de câncer pancreático induzidos por EMT. células Panc 03.27 foram expostas a TGF-β durante 2 dias a uma concentração de 10 ng /ml para induzir EMT, e então medida rigidez celular. Ligeiramente suprimida E-caderina e N-caderina elevada e expressões que indicam vimentina EMT é induzida em células Panc 03.27 (Figura S6A em S1 do ficheiro). Panc 03.27 células tratadas com TGF-β foram demonstrados pela diminuição do módulo de Young (1,42 ± 0,53 kPa) versus células não tratadas (1,91 ± 0,78 kPa). Este resultado sugere que a rigidez de células diminui quando as células estão a sofrer EMT. Recentemente, existe um relatório acerca das mudanças de rigidez celular em células A549-induzidas EMT com o tratamento de TGF-β [15]. Em seu estudo, eles mediram as propriedades mecânicas locais de células A549 usando um cantilever DNP afiada (20 nm raio de ponta), que tem uma área de contato menor em comparação com um cantilever modificado com micropartículas. Mesmo que não há evidência crucial da mudança fenotípica de células de epitelial para mesenquimal, ou seja, alterações de formas celulares e aumentar fibras de stress, ainda são consistentes com o nosso trabalho.