Sumário
Cancro continua a ser uma das principais causas de morte no mundo eo número total de casos globalmente está aumentando. estratégias de tratamento inovadoras são, portanto, necessários desesperadamente para o tratamento radical de cancros e de longa sobrevida dos pacientes. Uma nova tecnologia utilizando elevado campo eléctrico pulsado emergiu de aplicação militar em biologia e medicina, aplicando nsPEF como meio para inibir o cancro. No entanto, os mecanismos moleculares de nsPEF em tumores ou neoplasias ainda não estão claros. Neste trabalho, descobrimos que nsPEF tinha extensos efeitos biológicos em cancros, e esclareceu seus mecanismos moleculares possíveis
in vitro
e
in vivo
. Não só podia induzir apoptose celular via dependente de mitocôndrias via de apoptose intrínseca que foi desencadeada por desequilíbrio de proteínas anti-apoptose ou pró-família Bcl-2, mas também inibir a proliferação celular através da repressão do NF-kB via de sinalização para reduzir a expressão das proteínas ciclina . Além disso, nsPEF também poderia inativar metástase e invasão em células cancerosas através da supressão de Wnt /β-catenina caminho para a expressão das proteínas da família VEGF e MMPs down-regulação da sinalização. Mais importante ainda, nsPEF pode funcionar com segurança e eficácia como uma terapia anti-cancro através da indução de apoptose de células tumorais, destruindo microambiente do tumor, angiogénese e pressionando no tecido tumoral
In vivo
. Estas descobertas podem fornecer uma estratégia terapêutica criativo e eficaz para cancros
Citation:. Ren Z, Chen X, Cui G, Yin S, Chen L, Jiang J, et al. (2013) Nanossegundo Pulsed elétrico Campo inibe o crescimento do cancro da Seguido de Alteração em expressões de NF-kB e Wnt /β-catenina moléculas sinalizadoras. PLoS ONE 8 (9): e74322. doi: 10.1371 /journal.pone.0074322
editor: Irina L Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América
Recebido: 10 de maio de 2013; Aceito: 25 de julho de 2013; Publicação: 17 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Ren et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National S T Projeto major da China (2012ZX10002-017, 2012ZX10002-004), NSFC para Innovative Research Group da China (81.121.002), Zhejiang Medical Research Funding (2008B079, LY13H180003), SRF para ROCS, SEM (J20120279 ) e Xinjiang Ciência e Tecnologia Projeto Bureau (2013911131). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Cancro ainda são uma das principais causas de morte no mundo e foi responsável por 7,6 milhões de mortes (cerca de 13% de todas as mortes), em 2008, segundo a OMS, e as mortes por câncer são projetados para subir para mais de 11 milhões em 2030 [ ,,,0],1]. Uma proporção significativa de cânceres podem ser curados com cirurgia, radioterapia ou quimioterapia, especialmente se eles são detectados cedo. No entanto, alguns tipos de cânceres não pode ser descoberto em fase inicial e têm pouca resposta à radioterapia e quimioterapia, assim, pacientes com esses tipos de câncer têm um prognóstico pobre. Por exemplo, o câncer de pâncreas tem aproximadamente 23% de sobrevida em 1 ano após o diagnóstico e 5% de sobrevida em 5 anos na melhor das hipóteses [2]. Além disso, havia uma estimativa de 43.140 novos casos e 36, 800 mortes atribuídas ao câncer de pâncreas nos Estados Unidos [3,4]. É essencial procurar uma nova técnica de terapia para melhorar o prognóstico e sobrevida de pacientes com câncer.
Uma nova tecnologia usando alto campo elétrico pulsado emergiu de aplicação militar em biologia e medicina através da aplicação de campo elétrico de pulso nanosegundo (nsPEF ) como um meio para inibir o cancro [5]. A principal característica da nsPEF é a sua alta potência e baixo consumo de energia levando a muito pouco a produção de calor e sua habilidade especial para penetrar na célula para influenciar organelas intracelulares [6,7]. Bastante diferente da eletroporação membrana plasmática clássica, nsPEF pode produzir energia altamente comprimido (bilhões de watts), durações de pulso ultra-curtos (nanossegundos), tempos de subida rápidos (nanossegundos) e campos elétricos elevados (kV /cm). O pulso nanossegundo resultante pode penetrar na célula antes de membrana plasmática está totalmente carregada permitindo nsPEF ter mínima afectar membrana plasmática, por conseguinte, não causando electroporação [8]. Nos últimos anos, estudos têm sido feitos para determinar os efeitos de nsPEF em pesquisas experimentais e modelo. Os resultados provaram que nsPEF poderia induzir a apoptose em várias linhas celulares de cancro
in vitro
[9,10] e um tumor fibrosarcoma
ex vivo
[7], e erradicar B16F10 tumor melanoma
in vivo
[11,12,13]. No entanto, os mecanismos moleculares de efeitos biológicos de nsPEF em tumores ou neoplasias ainda não estão claros.
Nesta pesquisa, procurou-se investigar efeito anti-câncer de nsPEF e dos seus mecanismos moleculares possíveis através de
in vitro
e
in vivo
experimentos. Aqui, mostramos que nsPEF poderia inibir significativamente o crescimento do câncer
in vitro
e
in vivo
via indução de apoptose, inibindo a proliferação, inativação de invasão e metástase, e destruindo microambiente do tumor, o que proporcionará um romance e a estratégia terapêutica eficaz para o câncer.
Materiais e Métodos
cultura celular
pancreático linha de células de carcinoma humano linha celular (PANC-1) e HCC (Hep-3B) foram comprado de celular Banco da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Ambas as linhas celulares foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, SAFC Biosciences, Lenexa, KS, EUA), 100 unidades /ml de penicilina e 100 mg /mL de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).
a indução de morte celular por nsPEF
Como a nossa descrição anterior [11], nsPEF gerador com duração de 100 -ns foi mostrado na Figura S1. Os campos eléctricos variou de 20 kV /cm a 60 kV /cm. Formas de onda foram monitorados com um osciloscópio digital de fósforo (Figura S1 A B, DPO4054, Tektronix, EUA), equipado com uma sonda de alta tensão (P6015A, Tektronix, EUA). células PANC-1 foram colhidas com tripsina e re-suspensos em meio DMEM fresco com 10% de FBS com uma concentração de 5,0 x 10
6 células /ml. 500 ul da suspensão de células foram colocados numa cuveta de 0,1 centímetros (lacuna eléctrodos Figura S1 C, Biosmith, placa de alumínio) e expostas a pulsos de 100 a 0, 20, 40 e 60 kV /cm de intensidade de campo eléctrico, respectivamente. A maioria das detecções de respostas de células foram realizados em 1h após o tratamento, principalmente, incluindo ensaio transpoço, TEM celular, ensaio escada de DNA, ensaio de TUNEL de células, citometria de fluxo e Western-blot. A viabilidade celular e a taxa de inibição de proliferação foram medidos em diferentes pontos de tempo após o tratamento para observar um processo gradual activo. inteiros As experiências foram repetidas três vezes.
Medição da viabilidade das células e taxa de inibição proliferativa
células PANC-1 foram expostas a nsPEF e em seguida cultivadas. 2 × 10
5 células foram expostas a nsPEF com diferentes intensidades, e em seguida cultivadas durante 0, 0,5, 1, 2, 24 e 48 h, respectivamente. As células foram tripsinizadas e as células viáveis foram contadas por um analisador de viabilidade celular (células Vi, Backman). Após incubação durante 24, 48 e 72 h, respectivamente, as células foram calculados pela Cell Counting Kit-8 (CCK-8) de ensaio (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante, reflectindo a inibição da proliferação celular.
a detecção de metástases de células e capacidade de invasão com Transwell ensaio
1 h após o tratamento nsPEF, as células tratadas de sobrevivência, ao mesmo número foram obtidos para executar Transwell ensaios baseados em câmaras Transwell (Millipore, EUA), reflectindo a metástase de células e capacidade de invasão, como previamente descrito [14].
Observação da ultra-estrutura celular por TEM
1 h após o tratamento nsPEF, as células tratadas foram obtidos e fixados com glutaraldeído a 2,5% para observar célula ultraestrutura por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) no Imaging Facility, da Core Facilities, Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, como descrito anteriormente [15].
Determinação da fragmentação do DNA com ensaio escada de DNA
a 1 h após o tratamento nsPEF, obtiveram-se as células tratadas para investigar a fragmentação do ADN celular por ensaio de escada de ADN de acordo com as instruções do fabricante, como previamente descrito [11].
Medição da apoptose de uma única célula com TUNEL
a 1 h após o tratamento nsPEF, as células tratadas foram obtidos para determinar a apoptose de uma única célula, utilizando o ensaio de TdT-dUTP terminal Etiquetagem final-Nick (TUNEL) com
In Situ
Kit de Detecção de Morte celular (Millipore, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, como previamente descrito [14].
a detecção de apoptose de células com citometria de fluxo
1 h após o tratamento nsPEF, as células tratadas foram obtidos para detectar apoptose de células por Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) como anteriormente descrito [16].
Análise do ciclo celular com citometria de fluxo
1 h após o tratamento nsPEF, as células tratadas foram obtidos a determinar a mudança do ciclo celular. ensaio do ciclo celular e a análise foi realizada como descrito anteriormente [17].
análise de transferência de Western
1 h após o tratamento nsPEF, as células tratadas foram obtidos para extrair a proteína. Extracção de proteínas e análise de transferência de Western foram realizados como previamente descrito [18]. anticorpos e detalhes preliminares estão listadas na Tabela S1.
indução de tumor em ratinhos nus com células Hep-3B
Os ratos nus velhos 5 semanas foram adquiridos a partir de Xangai Centro Experimental Animal, Academia Chinesa de Ciências . Os animais experimentais foram mantidos no Biotério Central da Zhejiang University School of Medicine e alojados em armários fl uxo laminar- em condições livres de patógenos específicos a 22 ° C com um 12 h ciclo de luz /escuridão. Todos os ratinhos foram anestesiados com cetamina (100 mg /kg intraperitoneal). modelos de ratos portadores de tumores foram estabelecidos por meio de injecção de 2 x 10
6 células Hep-3B no abdómen direito em ratinhos. Em 1 semana após a injecção das células, o tumor foi tipicamente de 3 mm de largura e tinha exibiram angiogénese. Quando os tumores cresceram até 10 mm de largura, ou mais — tipicamente cerca de 4 semanas após a injecção das células, 50 modelos de ratos portadores de tumores foram estabelecidos com sucesso e divididos em dois grupos: o grupo de controlo (n = 17) e grupo nsPEF (n = 33) . Os ratinhos no grupo nsPEF foram expostas a nsPEF (Figura S1 D E, 100 pulsos, 20 kV /cm), com a braçadeira. Os eléctrodos de aperto foram feitas a partir de braçadeira suporte de plástico com 5 mm de largura de cobre fina para cobrir o tumor. Nós revestido estes eléctrodos com um gel de ultra-som para separar a pele a partir do eléctrodo. Para o tratamento, cada tumor foi posicionado entre duas palmas das braçadeiras com uma separação de 0,5 mm, enquanto que 100 ns impulsos em duração e 20 kV /cm de intensidade foram aplicados a uma frequência de 0,5 Hz. Durante toda a experiência, o rato foi anestesiado e posicionado em uma fase de aquecimento que mantém a temperatura do corpo do rato dentro da gama normal. actividades e pesos dos ratinhos física, bem como cada tumor foram observados e registados uma vez ou duas vezes por semana. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o ” Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório ” publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH publicação 86-23 revista 1985). protocolos animais foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Zhejiang dos cuidados animais e instalações.
Tumor
in vivo
imagiologia com ressonância magnética especial de rato
ratinhos portadores de tumor do grupo de controle e nsPEF grupo foram anestesiados e colocados na pequena bobina para rato (Universidade de Pequim, China), e em seguida colocado em máquina de NMR (Adiantamento 400, Hruker Company, Swiss). O
in vivo
imagem de ratinhos com tumor foi tomada.
Amostra coleção
Em cerca de 6,5 semanas após a injeção de células, todos os ratos foram sacrificados por anestesia over-dosado e todos Os tumores foram dissecados para comparar. O tecido tumoral foi fixada em formalina tamponada com fosfato (10%) para executar a H E de coloração, ensaio de TUNEL, e coloração IHC. Enquanto isso, parte do tumor foi fixado em glutaraldeído 2,5% (4 ° C, pH 7,4) para executar TEM tumor
H . E coloração e imuno-histoquímica
H E de coloração e imuno-histoquímica (IHQ ) foram realizados como já anteriormente descrito [19]. Os anticorpos primários e detalhes estão listados na Tabela S1.
Tumor detecção in situ de apoptose com TUNEL ensaio
apoptose celular do tumor foi medido utilizando um ensaio de TUNEL, realizada como previamente descrito [14].
A análise estatística
Os presentes dados são expressos como média ± SEM. software Graph Pad Prism 5 foi aplicado para análise estatística. apoptose celular e ciclo celular foram analisados por FlowJo 7.6.1 Software. A intensidade relativa de cada banda de proteína foi analisada pelo software Photoshop CS4. IHC resultados foram analisados pelo software Image Pro-Plus. one-way análise de variância (ANOVA) com comparações múltiplas de Dunnett e um, bicaudal teste t de Student não pareado foram utilizados para análise dos dados. A significância estatística foi fixado em valor de P 0,05.
Resultados e Discussão
Apesar dos esforços intensivos em práticas de tratamento de câncer, as taxas de sobrevivência para alguns tipos de cânceres não foram substancialmente melhorado nos últimos anos, tais como o cancro do pâncreas [2], da próstata carcinoma [20] e câncer de pulmão [21]. estratégias de tratamento inovadoras são, portanto, necessários desesperadamente para o tratamento de cancros e de longa sobrevida dos pacientes. Durante o desenvolvimento de várias etapas, cancros humanos adquirem dez características biológicas, incluindo resistência a morte celular, mantendo a sinalização proliferativa, ativando invasão e metástase, permitindo a imortalidade replicativo, fugindo supressores de crescimento, induzindo a angiogênese, a reprogramação do metabolismo energético, evitando a destruição imune, inflamação de promoção do tumor, e instabilidade do genoma e mutação [22,23]. Estas características constituem um princípio organizador para racionalizar as complexidades da doença neoplásica e os principais alvos tornam-se também para a investigação do cancro e estratégias terapêuticas. Como uma tecnologia relativamente nova para interpretar cancro, nsPEF é eficaz em várias linhas de células in
in vitro
[5,9,10], e melanoma B16F10 e carcinoma hepatocelular [11,24], bem como carcinoma pancreático humano [25]
in vivo
, demonstrando potencial perspectiva aplicação de nsPEF para terapia de câncer. No entanto, até agora, não se sabe sobre os mecanismos moleculares de nsPEF sobre cancros.
Neste estudo, foram utilizados modelos de cancro ambos
in vitro
e
in vivo
experimentos para busca de possíveis mecanismos moleculares.
induzida NsPEF câncer de células da morte e inibição de proliferação
in vitro
para abordar efeito da nsPEF em células PANC-1, as células foram expostas a nsPEF com o campo eléctrico, a 0, 20, 40 e 60 kV /cm, respectivamente (Figura 1A). A taxa de células viáveis /controle foi detectada por contagem de células negativas tripano azul no 0h, 0,5 h, 1 h e 2 h de pulso de pós (Figura 1B). Verificou-se que as células viáveis deixar pulso foram significativamente diminuída em comparação com o controlo (p 0,001), mas o modo dependente do tempo e forma dose-dependente desta tendência reduzida não foram observados em um pulso de pós de tempo curto, pelo menos, dentro de 2 horas. Além disso, as células tratadas foram cultivadas durante 24 h e 48 h, e, em seguida, calculados, respectivamente. Verificou-se que as células viáveis foram também notavelmente reduzida em relação ao controlo (ambos p 0,001) (Figura 1C D). Além disso, as taxas de inibição da proliferação celular, detectados por CCK-8 de ensaio, foram aumentando consideravelmente em diferentes intensidades às 48h e 72h após a exposição ao nsPEF. Especialmente às 72h depois do pulso, as intensidades mais elevadas taxas de inibição adquirida mais elevadas, que apresentavam uma forma dependente da dose, indicando que a proliferação de células de sobrevivência foi influenciada com dependência da dose (Figura 1E). A Figura 1 mostrou não apenas células mortes, mas também a inibição da proliferação de células induzida por nsPEF.
(a) Calendário de células cancerosas expostas a nsPEF com intensidades diferentes, para contagem de células viáveis e ensaio CCK-8. (B) A taxa de células viáveis /controle foi detectada por contagem de células negativas tripano azul, a 0 h, 0,5 h, 1 h, e 2 h após a impulsos com diferentes intensidades. *** P 0,001. (C e D) Os números de células viáveis foram calculadas após exposição a nsPEF com intensidades diferentes, para 24 h e 48 h, respectivamente. * P 0,05, *** p 0,001. (E) De acordo com CCK-8 do ensaio, as taxas de inibição da proliferação de células induzida por nsPEF com diferentes intensidades foram detectados. ** P . 0,01
NsPEF induzida apoptose celular pela via dependente da mitocôndria intrínseca apoptótica
in vitro
Em primeiro lugar, para investigar características de morte induzida por nsPEF em células de carcinoma do pâncreas, que detectadas alterações da morfologia das células após o tratamento por TEM (Figura 2A). características de células apoptóticas foram raramente observados no controle (0kV /cm). No entanto, as células tratadas com 20 kV /cm nsPEF começou a apresentar alteração da morfologia celular de apoptose precoce: o encolhimento nuclear, entalhe nuclear, condensação da cromatina e marginalização, e degeneração mitocôndrias menor. Sob efeito de 40 kV /cm nsPEF, foram observadas outras alterações, incluindo principalmente aglomeração cromatina, citoplasma condensação e alguns vacúolos que aparecem na membrana celular ou no citoplasma. Enquanto isso, os fragmentos nucleares e citoplasmáticas constituintes foram embalados em corpos apoptóticos, e mitocôndrias mostrou degeneração vacuolar. Quando os campos elétricos aumentada até 60kV /cm, as células tratadas apresentaram lise da membrana, formação de bolhas de membrana nuclear, lise nuclear e fragmentação, bem como danos mitocôndrias, que eram normalmente considerados como necrose.
(A) muda Morfologia de câncer células expostas a nsPEF com diferentes intensidades foram observados por microscopia eletrônica de transmissão celular (TEM). N: alterações nucleares, incluindo o encolhimento nuclear, formação de bolhas de membrana nuclear e lise nuclear. H: degeneração mitocôndrias ou degeneração vacuolar. (B) a apoptose de células únicas de células cancerosas expostas a nsPEF com diferentes intensidades foi calculada pelo ensaio de TUNEL de células. ampliação original, de 400 ×. *** P 0,001. fragmentação de ADN (C) celular de células cancerosas expostas a nsPEF foi observada por ensaio de escada de ADN apoptose. taxas de (D) a apoptose de células cancerosas expostas a nsPEF com diferentes intensidades foram testados com o ensaio de coloração com PI e Anexina V por citometria de fluxo. Os resultados foram analisados por FlowJo 7.6.1 Software. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. (E) expressão de proteínas da família de anti-/pro-apoptose Bcl-2, o citocromo C e a caspase-3 em células de cancro após exposição a nsPEF com diferentes intensidades foram detectados por ensaio Western-blot. A intensidade relativa de cada proteína foi analisada pelo software Photoshop CS4. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001
Subsequentemente, foram estudados danos no ADN e fragmentação pelo ensaio de TUNEL e escada de DNA de ensaio de apoptose. Na coloração TUNEL, as etiquetas combinados locais danificados de DNA, e células apoptóticas foram coradas amarelo acastanhado. Observou-se que as taxas de TUNEL positivas foram, obviamente, elevando-se em células PANC-1 Post pulso em 20, 40 e 60 kV /cm em comparação com o controlo, respectivamente (todos p 0,001) (Figura 2B). Consistente com os resultados de TUNEL, fragmentação de ADN apresentada em PANC-1 células expostas a nsPEF a 20 e 40 kV /cm, como comparado com o controlo positivo e de controlo negativo do ensaio escada de ADN (Figura 2C).
Para investigar mais apoptótica grau em células cancerosas deixar pulso, testamos as taxas de apoptose de células tratadas com Anexina-V /PI coloração por citometria de fluxo (Figura 2D). Comparado com o controle, a taxa de anexina V
-PI
– células (células viáveis) diminuiu significativamente após a exposição ao nsPEF, mas a taxa de anexina V
+ PI
– células (início apoptose) foi notavelmente aumentada a 20 kV /cm (P 0,001), e, em seguida, diminuiu significativamente a 40 kV /cm (P 0,05) e 60 kV /cm (P 0,01). Em agudo contraste, a taxa de anexina V
+ PI
+ células (apoptose tardia ou necrose) foi continuamente crescente na dependência da dose a 20, 40 e 60 kV /cm (todos p 0,01). Estes dados sugerem células morte induzida por nsPEF apresentados de apoptose precoce de apoptose tardia ou necrose com aumento da intensidade de nsPEF, em outras palavras, a dose-dependência. Estes resultados foram idênticos com os nossos achados através de MET de células.
pesquisas mais recentes mostram que a apoptose desempenhou um papel importante na morte celular induzida por nsPEF [11,26]. De acordo com estes estudos, encontramos degeneração corpo e mitocôndrias apoptose por TEM após o tratamento nsPEF. Além disso, os resultados do ensaio de TUNEL, ensaio de apoptose e escada de DNA de coloração /PI Anexina-V também provou apoptose induzida por nsPEF em células PANC-1. Alguns estudos [5,9] relatou que a morte de células cancerígenas induzida por nsPEF foi atribuído principalmente à apoptose e interpretado que o aumento de anexina V
+ PI
+ células de dose-dependência pode ser atribuída a um especial “imitando necrose “que altas doses de pulso induzido buracos maiores nas membranas celulares e células, em seguida, PI mancha inseridos. No entanto, a nossa mais uma prova via TEM celular provou que a morte celular apresentado da apoptose cedo para apoptose tardia ou necrose com o aumento das intensidades de nsPEF, não apenas a apoptose celular.
A apoptose intrínseca induzida por estímulos de indução de estresse e apoptose extrínseca através da activação de receptor de morte são duas principais vias de apoptose. função de mitocôndrias e anti /pró-apoptose proteínas Bcl-2 família desempenham um papel essencial na via de apoptose intrínseca [27]. membros proteínas da família Bcl-2 Anti /pro-apoptose são inicialmente proteínas de membrana integrais encontrados na mitocôndria, retículo endoplasmático (ER), ou membrana nuclear [28]. Um local principal de activação de proteínas Bcl-2 é da membrana mitocondrial [27]. Para explorar possíveis mecanismos de apoptose induzida por nsPEF, detectamos expressão de proteínas relativa da via apoptótica intrínseco, tais como proteínas da família Bcl-2 pró-apoptose (Bad, p-Bad, Bax, Bik, Bim, BID, Bak e Puma) , as proteínas da família Bcl-2 pró-sobrevivência (p-Bcl-2, Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1), e proteínas de apoptose directamente relativos (citocromo-C e caspase-3) (Figura 2E). Em comparação com o controlo, expressão das proteínas da família Bcl-2, anti-apoptose, incluindo principalmente p-Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1, foram notavelmente reduzida em diferentes graus, enquanto expressão das proteínas da família pro-apoptose Bcl-2 , incluindo principalmente Bax, Bim e BID, foram significativamente elevados em diferentes graus com o aumento das intensidades de nsPEF. Enquanto isso, as expressões de citocromo-C e caspase-3 foram obviamente aumentada após exposição a nsPEF. Concluiu-se que a apoptose induzida por nsPEF foi desencadeada através do controlo do desequilíbrio de proteínas anti-apoptose ou pró-família Bcl-2 na membrana mitocondrial. Estes resultados eram consistentes com a degeneração mitocôndrias e danos na célula de ultra-estrutura. Colectivamente, estes dados indicaram que a apoptose induzida nsPEF apoptose em células PANC-1 através da mitocôndria dependentes via de apoptose intrínseca que foi desencadeada por desequilíbrio de proteínas anti-apoptose ou pró-família Bcl-2.
NsPEF inibiu a proliferação de células via reprimindo via de sinalização de NF-kB
in vitro
Além de apoptose, nsPEF teve uma influência notável sobre a proliferação de células do nosso ensaio de CCK-8 que a taxa de inibição da proliferação celular foi notavelmente aumentada de forma da dose-dependência e tempo-dependência após o pulso 48h post. No ciclo celular, a tradução do G1 fase a fase S e percentual de fase G2 /M geralmente reflete a capacidade proliferativa celular. Examinámos ciclo celular das células tratadas, e descobriram que a percentagem da fase G1 foi obviamente aumentada (p 0,01), enquanto a percentagem de fase G2 /M foi reduzida (p 0,05) após a exposição ao nsPEF (Figura 3A), o que indica que nsPEF poderia prender a fase G1 do ciclo celular para inibir a proliferação celular.
(a) do ciclo celular de células cancerosas expostas a nsPEF com diferentes intensidades foi examinada com PI ensaio de coloração por citometria de fluxo, e os resultados foram analisados por 7,6 FlowJo Software .1. * P 0,05, ** p 0,01. (B) expressões de proteína de sinalização via NF-kB, incluindo IKK-α, IKK-β IkB-α, p65 e p-p65 em células cancerosas após a exposição ao nsPEF com diferentes intensidades foram detectados pelo ensaio Western-blot. (C) expressões de proteínas de proteínas ciclina incluindo ciclina D1 e ciclina A em células de cancro após a exposição ao nsPEF com diferentes intensidades foram detectados por ensaio Western-blot. A intensidade relativa de cada proteína foi analisada pelo software Photoshop CS4. * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001
NF-kB via de sinalização desempenha um papel importante na proliferação de células [29]. inibição de crescimento de cancro através da inibição de NF-kB via tem sido recentemente relatados em vários carcinomas humanos, tais como cólon [30], do pulmão [31] e da mama [32]. Os genes alvo que regulam a proliferação celular por meio de NF-kB via incluem c-Myc, CyclinD1, ciclina E e CDC2 que desempenham um papel essencial na regulação positiva ou negativa do ciclo celular [33,34]. Para explorar ainda mais os possíveis mecanismos de inatividade proliferativa das células pulsadas, detectamos expressões de NF-kB de sinalização proteínas da via e proteínas ciclina em células PANC-1. Os nossos resultados mostraram que a expressão das proteínas da via de NF-kB, incluindo IKK-α, IKK-β, IkB-α, NF-kB P-65 e P-p65 foram obviamente diminuiu após a exposição ao nsPEF versus o controlo (todos p 0,01 ou 0,001) (Figura 3B). maior intensidade de nsPEF levado à expressão muito inferiores destas proteínas em comparação com o controlo. Enquanto isso, expressão das proteínas ciclina, incluindo CyclinD1 e Ciclina A foram também significativamente reduzidos após a exposição ao nsPEF versus o controlo (P 0,01, 0,001, ou 0,05) (Figura 3C). Por isso, considerou que nsPEF poderia diminuir a NF-kB via para reduzir a expressão das proteínas ciclina sinalização.
Estes dados sugerem que nsPEF inibiu a proliferação celular através de reprimir NF-kB via de sinalização para reduzir a expressão das proteínas ciclina, prendendo assim a fase de G1 do ciclo celular.
NsPEF migração celular inativada ea invasão via suprimindo Wnt /β-catenina via de sinalização
in vitro
a ativação de metástase e invasão é uma característica importante de cancro [22,23]. O grau de metástase e invasão é um padrão para classificar estágio de tumor maligno, e também determina diretamente estratégias terapêuticas de câncer e sobrevida dos pacientes [35]. , De modo que detectou a capacidade de migração e invasão das células cancerígenas após o tratamento. No nosso estudo, a capacidade de migração de células de cancro deixar pulso foi acentuadamente reduzir em comparação com o controlo por ensaio Trans poços (p 0,001) (Figura 4A). Além disso, verificou-se que as células cancerosas expostas a nsPEF possuía uma capacidade significativamente fraca para invadir comparação com o controlo utilizando o ensaio de invasão de Matrigel (p 0,001) (Figura 4B). Estes resultados provaram que nsPEF poderia diminuir a metástase e invasão celular em cancros.
(A) a capacidade de migração das células cancerosas expostas a nsPEF foi testada pelo ensaio de trans-bem. As células migraram expostos a nsPEF foram coradas roxo por solução de violeta cristal 0,1%, observado sob microscópio de luz por 40 ou 400 ampliações, e contou para análise estatística. ampliação original, 40 × 400 ×. *** P 0,001. (B) capacidade da invasão de células cancerosas expostas a nsPEF foi detectada utilizando um ensaio de invasão de Matrigel. Após o tratamento nsPEF, as células que possuíam a capacidade de invasão penetrado através do matrigel, foram coradas de púrpura por solução de violeta cristal a 0,1%, e foram contadas para a análise estatística. ampliação original, 40 × 400 ×. *** P 0,001. (C) expressões de proteínas de Wnt /β-catenina via de sinalização incluindo hDPR1, β-catenina e c-Myc em células de cancro após a exposição ao nsPEF com diferentes intensidades foram detectados pelo ensaio Western-blot. expressões (D) proteína de MMPs e a família de VEGF em células de cancro após exposição a nsPEF com diferentes intensidades foram detectados por ensaio Western-blot. A intensidade relativa de cada proteína foi analisada pelo software Photoshop CS4. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
evidência acumulada demonstrou que Wnt /β-catenina via de sinalização desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário e várias doenças malignas humanas. [36]. As acções de Wnt /β-catenina via de sinalização nas células alvo incluem principalmente alterações na expressão genética, a polarização celular, migração e invasão por meio da regulação de moléculas responsivas a jusante distintos [37]. Como efector a jusante do /β-catenina via de sinalização Wnt, proteínas da família MMP e o VEGF desempenha um papel crítico na invasão tumoral e metástase [38]. Assim que detectada expressão de proteínas de Wnt /β-catenina via de sinalização, família MMPs e VEGF. Descobrimos que as expressões de Wnt /β-catenina proteínas de sinalização de vias, incluindo principalmente hDPR1, β-catenina e c-Myc em células cancerosas expostas a nsPEF foram notavelmente diminuída com dependência da dose em relação ao controlo (p 0,05 a 20 kV /cm, p 0,01 a 40 kV /cm, p 0,001 em 60 kV /cm) (Figura 4C). Além disso, os resultados também indicam que a expressão das proteínas da família VEGF e MMPs incluindo principalmente MMP1, MMP2, MMP9, MMP11, MMP12, MMP14 e MMP21 foram significativamente reduzidos em diferentes graus, com diferentes intensidades de nsPEF em relação ao controlo (Figura 4D). Então pensamos que nsPEF poderia suprimir Wnt /β-catenina via de sinalização para regular expressão dos genes de proteínas da família VEGF e MMPs.
Estes resultados sugerem fortemente que nsPEF poderia inativar metástase e invasão habilidades de células cancerosas inibindo Wnt /β-catenina via de sinalização para regular expressão dos genes de proteínas da família VEGF e MMPs.
NsPEF funcionava com segurança e eficácia como uma terapia anti-tumor
in vivo
Com base no
in vitro
experiência, nsPEF poderia induzir a apoptose celular, inibir a proliferação celular, e inativar metástase e invasão. Para identificar ainda mais a função anti-tumoral de nsPEF, foi realizada a experiência nsPEF no modelo de ratinhos portadores de tumor ectópica. O modelo de tumor ectópica é um estudo piloto para mais modelo ortotópico em profundidade que reflete mais de perto as aplicações clínicas.
Durante todo o experimento animal, 2 ratos no grupo nsPEF morreu de anestesia over-dosado e 1 na Controlo morreram de causas ambíguas. Observamos condição de sobrevivência dos 47 ratos descanso portadores de tumor (16 no Controle e 31 no grupo nsPEF), e observou que nsPEF mantida ratos atividade física normal e não teve influência no peso ratos (Figura 5A), indicando que anti- função de tumor de nsPEF era seguro para o próprio corpo
in vivo
.