Abstract

Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que os níveis de expressão Orc6 se haviam elevado em amostras de colo de pacientes de câncer e a indução de Orc6 foi associada ao tratamento com 5-fluorouracilo (5-FU). O objetivo deste estudo foi investigar o impacto molecular e celular do Orc6 no câncer de cólon. Neste estudo, usamos HCT116 (p53 wt) e HCT116 (null-p53) linhas de células de cancro do cólon como um sistema modelo para investigar o impacto de Orc6 sobre a proliferação celular, a quimiossensibilidade e vias envolvidas com Orc6. Foi demonstrado que a regulação negativa da Orc6 sensibiliza as células de cancro do cólon se tanto ao tratamento com cisplatina (cis-PT) 5-FU e. Diminuição da expressão Orc6 em células HCT-116 (peso-p53) por interferência de RNA desencadeada parada do ciclo celular na fase G1. inibição prolongada de expressão Orc6 resultou em células multinucleadas no HCT-116 (peso-p53) da linha celular. análise de imunotransferência de Western mostraram que a regulação por diminuição da expressão de p21 Orc6 induzida em células HCT-116 (p-p53). A indução de p21 foi mediada pelo aumento do nível de p53 fosforilada em Ser-15. Em contraste, não existe uma expressão elevada da proteína p21 em células HCT-116 (null-p53). Orc6 regulação negativa também aumentou a expressão de ADN prejudiciais proteína de reparação GADD45β e reduziu o nível de expressão de JNK1. Orc6 pode ser um novo alvo potencial para o desenvolvimento terapêutico anti câncer de futuro no cancro do cólon

Citation:. Gavin EJ, Song B, Wang Y, Xi Y, Ju J (2008) Redução do Orc6 Expressão sensibiliza cancro do cólon humano As células a 5-fluorouracil e cisplatina. PLoS ONE 3 (12): e4054. doi: 10.1371 /journal.pone.0004054

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de novembro de 2008; Aceito: 01 de dezembro de 2008; Publicação: 29 de dezembro de 2008

Direitos de autor: © 2008 Gavin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo laboratório de genômica do câncer de fundos start-up Cancer Institute Mitchell (J. Ju) e NIH CA114043 (J. Ju). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Orc6 é uma proteína do complexo de seis reconhecimento origem em células humanas. Ele funciona como a plataforma de montagem inicial que é necessária para a replicação do ADN. Os papéis de Orc6 na replicação do ADN têm sido investigados extensivamente tanto em levedura e Drosophila [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Mas existem informações limitadas sobre câncer humano [7], [8]. Tem sido relatado que, em adição à sua função como uma proteína de replicação do DNA iniciador, que também desempenha um papel fundamental no silenciamento do gene da transcrição e da formação de heterocromatina [8]. No entanto, não está claro durante a montagem complexo de iniciação no qual o passo que Orc6 participa [9]. Demonstrou-se elegantemente por Prasanth

et ai. Of the dinâmica de Orc6 localização ao longo de todo o ciclo celular, incluindo a replicação do ADN, regregation cromossoma, e citocinese. Eles também sugerem Orc6 pode funcionar na sinalização para o controlo do ciclo celular [8]. O nosso interesse em Orc6 provindo dos seus estudos anteriores com uma análise genómica global revelou que Orc6 está associada com 5-FU resistência associada em linhas celulares de cancro do cólon humano [10]. O nosso estudo de seguimento utilizando amostras de pacientes colorectais confirmou ainda que a expressão de Orc6 é altamente elevados em tecidos de tumor colo-rectais humanos normais em comparação com amostras emparelhadas [11]. Estes resultados confirmam a relevância clínica da Orc6 levando a nossa hipótese de que Orc6 pode ser um jogador-chave que está envolvido no cancro colorectal. Seu nível elevado pode também ser um contributo significativo para chemoresistance. p53 é um dos supressores de tumor mais frequentemente alterada no cancro colo-rectal e, devido à sua função fundamental no controlo do ciclo [12], [13]. Neste estudo, nós usamos um par de linhas celulares de cancro do cólon com qualquer tipo p53 selvagem ou p53 nulo como o nosso sistema modelo.

Neste estudo, nós fornecemos evidências experimentais de que a diminuição de expressão Orc6 por interferência de RNA pode sensibilizar cólon linhas celulares de cancro para dois dos principais agentes quimioterapêuticos 5-Fu e o tratamento com cisplatina. Diminuindo a expressão Orc6 por siRNA knock-down desencadeada paragem do ciclo celular e diminuição da proliferação celular em células HCT-116 (peso-p53). Por outro lado, este efeito foi significativamente prejudicada em células HCT-116 (null-p53). A alteração de controlo do ciclo celular por diminuição da expressão Orc6 era devida à indução de p21, um gene controlo do ciclo celular importante. A indução de p21 era devido ao aumento do nível de phosphorylatd de p53 em Ser-15 desencadeada por knock-down Orc6 de expressão. Orc6 pode ser um novo alvo potencial para o desenvolvimento de novos terapêutica anti tumor.

Resultados e Discussão

Diminuição de expressão Orc6 em células HCT-116 (peso-p53) inibe a proliferação celular

o aumento dos níveis de Orc6 em amostras de cancro do cólon humano nos levou a investigar os papéis de Orc6 no controle do ciclo celular e sensibilidade às drogas. Usando uma abordagem knock-down siRNA, primeiro confirmou que os níveis de proteína de Orc6 foi diminuída utilizando análise de imunotransferência de Western, tanto HCT (WT-p53) as células (Figura 1A, pista 1, siRNA de controlo não específico; pista 2, ARNsi contra células Orc6) e HCT-116 (null-p53) (Figura 1A, pista 3, ARNsi de controlo não específico; pista 4, ARNsi contra Orc6). A expressão da proteína Orc6 foi reduzido em mais de 5 vezes na HCT (WT-p53) e células HCT-116 (null-p53).

α-tubulina foi utilizada como controlo (A). Aumento multinucleações sobre silenciamento de Orc6 em células por siRNA HCT-116 (peso-p53). painel da esquerda, imagem de luz; painel direito, coloração nuclear DAPI (B).

Foi demonstrado anteriormente que a polypoidy Orc6 em Hela células knock-down induzido [8]. Os nossos resultados mostraram que essa transfecção em células cancerígenas do cólon, depois repetido a cada 3 dias, as células com expressão reduzida Orc6 HCT-116 (p-p53) tornou-se multinucleadas (Figura 1B). Esta população aumentou com o tempo. Cromatina foi corada com 4 ‘, 6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para mostrar células multinucleadas após Orc6 knockdown por siRNA sofridos (painel esquerdo, imagem Célula dispersão de luz; painel da direita, imagem coloração nuclear DAPI na Figura 1B). taxa de proliferação celular foi reduzida em mais de 50% (open bar) com Orc6 knock-down (Figura 2). No entanto, a redução de expressão nas células Orc6 redução na proliferação de células HCT-116 (null-p53) por apenas 23% (barra tracejada). Para investigar o impacto da diminuição Orc6 no controlo do ciclo celular, as células HCT-116 (p-p53) e HCT-116 (null-p53) foram primeiro transfectados com 100 nM Orc6 siARN. As células transfectadas foram expostas a 10? M de 5-FU durante 12 horas. Observou-se que 12 horas mais tarde, dois (WT-p53) as células HCT-116 de controlo e células com células que expressam reduzidas Orc6 foram capazes de permanecer em grande parte na fase G1 do ciclo celular, sem re-entrada (Figura 3A). Em contraste, HCT-116 (null-p53) as células de controlo e células Orc6 reduzidas foram re-entrado em fase S do ciclo celular, apesar dos danos de DNA por 5-FU e redução Orc6 (Figura 3B). Estes resultados sugerem que o controlo do ciclo celular após lesão de DNA está de acordo com a presença de p53 do tipo selvagem.

Efeito do Orc6 na quimiossensibilidade a 5-FU e cis-pt

para investigar o impacto potencial das Orc6 na quimiossensibilidade a alguns dos primeiros compostos linha quimioterapêuticos, tais como 5-FU e cis-PT no cancro colo-rectal, as células HCT-116 (p-p53) foram utilizadas como o nosso sistema modelo usando células transfectadas com oligofectamine sozinho, siRNA não específico, e Orc6 siRNA específico. As células, em seguida, tratada com 5-FU ou cisplatina com diluição em série. Após 72 horas, a proliferação celular foi quantificado pelo ensaio de WST-1. Figura 4A mostrou que as células com expressão reduzida Orc6 HCT-116 (p-p53) foram cinco vezes mais sensíveis ao tratamento com 5-FU em comparação com células de controlo com base na IC

50 valor. células com expressão reduzida Orc6 HCT-116 (p-p53) foram também mais sensíveis ao tratamento com cisplatina, em comparação com células de controlo (Figura 4B). Este efeito foi, em grande parte ausente da HCT116 (null-p53) células (dados não mostram).

baixo fluxo de percursos efectuados por Orc6

sinalização

Para começar a entender o fluxo para baixo vias de sinalização potencialmente envolvidos com Orc6, uma análise da expressão de genes de alto rendimento foi usada para quantificar as alterações de expressão de genes entre células transfectadas com ARNsi específico Orc6 e ARNsi de controlo não específico HCT-116 (p-p53). Expressão e análise GeneOntology mostraram que um número de genes foram influenciadas por inibição Orc6 (dados, S1). Com base nos nossos resultados, uma série de genes bem conhecidos de controlo do ciclo celular foram confirmadas utilizando análise de imunotransferência de Western. Os nossos resultados mostraram que a expressão de p21 foi significativamente induzida em células HCT-116 (p-p53) após Orc6 knock-down (Figura 5, pista 1, oligo de controlo não específico; pista 2, siARN da Orc6). Nós também confirmado que a expressão da proteína de reparação de danos no ADN Gadd45β também foi induzida por diminuição expressão Orc6 em células HCT-116 (p-p53) (Figura 5, pista 1, ARNsi de controlo não específico; pista 2, Orc6 siRNA específico). Está bem documentado que Gadd45β desempenha um papel importante na paragem do ciclo celular, a reparação do ADN, a imunidade inata, a manutenção da estabilidade do genoma e a apoptose [7], [14], [15], [16]. A função de Gadd45β é mediada através de interacções com outras proteínas, tais como cdc2 por perturbar a interacção entre ccd2 e ciclina B1 no desencadeamento /M do ciclo celular G2 prisão sob stress genotóxico [17], [18]. Os nossos resultados mostraram que Gadd45β é, pelo menos, em parte, responsável pelo defeito de replicação de ADN desencadeada pela expressão Orc6 reduzida em células de cancro do cólon. A expressão de nível JNK1 foi diminuída com a expressão Orc6 reduzido (Figura 5). Demonstrou-se que os papéis de JNK1 foram bastante complexo devido ao seu papel devido em ambos os apoptóticos e sobrevivência vias de sinalização [19], [20]. Os fibroblastos com orifícios de JNK são mais sensíveis a apoptose induzida por TNF [21]. Fibroblastos de embriões que carecem MKK7 (activador a montante da JNK) submeter a senescência celular e /paragem do crescimento G2 M, apoiar ainda mais a nossa conclusão de que a redução da expressão de JNK1 pode ser um dos fatores que contribuem para G2 /M detenção causadas por knock-down de Orc6 expressão [22]. Estas alterações foram, em grande parte ausente das células HCT-116 (null-p53) (dados não mostram). Isto é consistente com estudos anteriores relataram que o p53 desempenha um papel fundamental no controlo do ciclo celular em resposta ao dano no DNA. Com a indução da expressão de p21, prevemos que a subsequente expressão de p53 pode ser aumentada porque p21 é um gene de controlo de pontos de verificação do ciclo celular mediada por p53 conhecida. No entanto, a nível celular total de proteína p53 não foi alterado com a knock-down da expressão de p53 (Figura 6A, faixas 1 e 2). A indução de p21 estava ausente em células HCT-116 (null-p53) com Orc6 knock-down (Figura 6A, pista 3, controle; a pista 4, siRNA de Orc6). Isto indica que a indução da expressão de p21 tem que ser dependente de p53, apesar da ausência de expressão do nível de p53. Embora o nível total de p53 não aumentou em células HCT-116 (p-p53), especula-se que o nível de p53 na fracção nuclear pode ser aumentado devido a evento conhecido p53 translocação. Ao separar os núcleos e citoplasma, demonstrou-se que o nível de proteína total de p53 nos núcleos não foi elevada nas células com expressão reduzida Orc6 tratada por Orc6 específica siRNA (Figura 6A) de HCT-116 (p-p53). Em vez disso, o nível de p53 fosforilada em Ser-15 foi aumentado na fracção nuclear das células com expressão reduzida Orc6 (Figura 6B) de HCT-116 (p-p53). Isto é altamente consistente com um mecanismo bem documentado de p53 em resposta a danos no ADN (14). p53 fosforilada em Ser-15 resíduo pode diminuir sua interação com o regulador negativo, a oncoproteína MDM2.

(A) Análise Western blot da expressão de p53 e p21 após Orc6 knockdown por siRNA em ambos os HCT-116 células e HCT-116 (null-p53) (pista 3, o controlo não específico; pista 4, ARNsi específico para Orc6); (p-p53) as células (pista 2, ARNsi específico para Orc6 pista 1, o controlo não-específica) . (B) Análise de imunotransferência de Western da expressão da p53 fosforilada em Ser-15 em ambos fracção citoplasmática e nuclear em células controlo (pista 1, citoplasmática; pista 2, nuclear) HCT-116 (p-p53) e HCT-116 (p-p53 ), as células tratadas com ARNsi contra Orc6 (pista 3, citoplasmática; pista 4, nuclear). Os níveis totais de expressão da proteína p53 foram usadas como proteína de controlo em fracções nucleares e α-tubulina foi utilizada como controlo para as fracções citoplasmáticos.

Parece que a resposta a danos no ADN causados ​​por um nível diminuído Orc6 é mediado através da p53 via controle do ciclo celular dependente. Nós especulamos que o alto nível de Orc6 no câncer colorretal pode contribuir para a genoma instabilidade e talvez acumulada miss-disparo de replicação do DNA com deleção do gene p53 /mutações em mais de 50% dos tumores colorretais. A perda de p53 em tumores colorrectais contribui ainda mais para a instabilidade do genoma e mutações acumuladas. serão necessários futuros estudos para compreender o mecanismo molecular e celular da Orc6 no cancro colorectal. Apesar do seu papel essencial na plataforma de montagem inicial necessário para a replicação do ADN, Orc6 podem ter um potencial como um novo alvo para o desenvolvimento terapêutico anticancerígeno. A situação talvez semelhante ao proteassoma 26S como um alvo para o bortezomib droga anticorpo. Inicialmente pensava-se que a segmentação proteassoma 26S não é uma boa estratégia devido ao seu papel onipresente na degradação de proteínas [23]. relatório mais recente de Chen

et ai.

sugere que Orc6 é dispensável na actividade de ligação a ADN de Orcs em levedura. Isto apoia ainda mais a nossa noção de que a segmentação Orc6 no câncer colorretal é uma estratégia viável para o desenvolvimento terapêutico futuro [24].

Em conclusão, demonstramos, neste estudo, que a regulação para baixo dos Orc6 em células de câncer de cólon células sensibilizar a 5-FU e o tratamento com cisplatina. Juntamente com os nossos estudos anteriores que Orc6 foi altamente sobre-expressos em pacientes com câncer colorretal, acreditamos que Orc6 pode ter potencial como um alvo anticancerígeno inovador para o desenvolvimento terapêutico anti-tumor futuro.

Materiais e Métodos

Cultura de células

As linhas de células cancerígenas do cólon humano, células HCT-116 (peso-p53) e HCT-116 (null-p53) eram um presente de Professor Bert Vogelstein (The Johns Hopkins University, Baltimore, MD) , e foram mantidas em meio de McCoy 5A (Gibco Laboratories). 5-FU e cisplatina foram adquiridos da Sigma.

Transfection siRNA

HCT-116 (p-p53) e HCT-116 (null-p53) foram semeadas em tabuleiros de 6 poços a uma × 10

5cells /poço e transfectadas com oligofectamine, o controlo não-específica siRNA ou ARNsi contra Orc6 na concentração de 100 nM com base no protocolo do fabricante (Invitrogen Inc.)

Isolamento de ARN

o ARN total foi isolado a partir de linhas de células utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante, decorridas 24 horas após a transfecção com siARN.

análise de imunotransferência de Western

as células foram raspadas e lisadas em tampão RIPA (Sigma). Quantidades iguais de amostras de proteína (50 ug) foram resolvidas por SDS-PAGE em géis de 12% pelo método de Laemmli e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories). As membranas foram então bloqueadas em 5% de leite magro em TBS-T (solução salina tamponada com Tris e 0,5% de Tween-20) à temperatura ambiente durante 1 h. As proteínas foram sondadas com anticorpo de rato anti-orc6 monoclonal (1:1000 diluição, Upstate Technology), de ratinho anti-α-tubulina (1:1000 diluição; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de ratinho anti-p53 (1:1000 , Santa Cruz) seguido de incubação com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano-secundário (diluição 1:1,000, Bio-Rad, Hercules, CA). As proteínas foram visualizadas com um sistema de detecção de quimioluminescência usando o substrato Super Signal (Pierce, Rockford, IL):

a síntese de cDNA a análise em tempo real de qRT-PCR

foi realizada com o kit de síntese de ADNc de alta capacidade (Applied Biosystems) utilizando 1 ug de ARN total como molde. O mestre de mistura de PCR contendo TaqMan 2 × Universal mistura de PCR Master (n AmpErase UNG), 10 × de ensaio e RT produtos TaqMan em volume de 25 ul foram processadas como se segue: 95 ° C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 35 seg (n = 3). Sinal foi coletado no ponto final de cada ciclo. Os valores de expressão do gene de Orc6 de cada amostra foram calculadas por normalização com GAPDH controlo interno e os valores foram representados graficamente quantificação relativa.

análise do ciclo celular por citometria de fluxo

HCT-116 (p-p53) e HCT-116 (null-p53) foram semeadas em tabuleiros de 6 poços a 1 × 10

5cells /poço e transfectadas com ARNsi específico oligofectamine, o controlo não-específico para o gene de siRNA ou Orc6 na concentração de 100 nM. As células foram tratadas com 5-FU (10 pM) 12 horas e as células foram colhidas por tripsina, lavadas e marcadas com iodeto de propídio, lavadas e ressuspensas em tampão de modificação de Krisham e filtrou-se para análise de citometria de fluxo (BD FACS calibre).

Informações de Apoio

dados S1.

GeneOntology. Expressão de genes e análise GeneOntology de genes diferencialmente expressos em controle e Orc6 knock-down células HCT116 (peso-p53)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004054.s001

(2,77 MB TIF)