Abstract

desenvolvimento da glândula mamária e câncer de mama crescimento EGFR-Dependent exigir vários fatores, tanto da glândula endócrina e parácrina origem. Analisou-se os papéis de Factor de Crescimento Epidérmico receptor (EGFR) e de hepatócitos do Factor de Crescimento do receptor (Met), em células epiteliais mamarias e células de tumor mamário de derivados de uma ratinhos transgénicos com mutação de ErbB2. Ao usar inibidores altamente específicos de tirosina-quinase descobrimos que linhas de células epiteliais mamárias MCF-10A e NMuMG são totalmente dependentes de activação de EGFR para o seu crescimento e sobrevivência. ensaios de proliferação e 3D-morfogênese mostrou que HGF não teve nenhum papel na manutenção da viabilidade das células mamárias, mas era a única citocina capaz de resgatar células mamárias inibiu-EGFR. Insulin-like growth factor-I (IGF-I), factor de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF) e Neurorregulina, que são bem conhecidos factores morfogénicas mamárias, não resgatar a proliferação ou a morfogénese nestas linhas de células, a inibição do EGFR. Do mesmo modo, as células tumorais impulsionado-ErbB2 são dependentes de EGFR e também exibir salvamento HGF-mediada. análise de Western-blot das vias de sinalização envolvido no salvamento após a inibição do EGFR indicou que concomitante de ERK1 /2 e AKT activação foi conduzida exclusivamente por Met, mas não por IGF-I ou b-FGF. Estes resultados descrevem um papel único para EGFR e Met em células epiteliais mamárias, mostrando que as vias semelhantes pode ser utilizada pelas células tumorigénicas para sustentar o crescimento e resistem às drogas anti-tumorigénica dirigida-EGFR

citação:. Accornero P, Miretti S, Bersani F, Quaglino e, Martignani e, Baratta M (2012) Met Receptor Atos exclusivamente pela sobrevivência e morfogênese do normal mamária epiteliais e células cancerosas EGFR-dependente. PLoS ONE 7 (9): e44982. doi: 10.1371 /journal.pone.0044982

editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de maio de 2012; Aceito: 16 de agosto de 2012; Publicação: 13 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Accornero et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios nacionais do Ministério da Instrução, Universidade e Pesquisa, PRIN 2009 e por doações locais da Università di Torino e Compagnia di San Paolo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

circulantes hormônios como o estrogênio, progesterona, hormona de crescimento e prolactina estavam entre os primeiros fatores endócrinos que foram identificados como necessários para a morfogênese da glândula mamária e diferenciação durante o crescimento, ciclo de reprodução e gravidez [1]. Apesar de um papel directo destes hormônios é conhecido, evidências recentes mostram que as suas principais actividades biológicas são alcançados através da liberação de fatores de crescimento locais por células epiteliais e estromais mamárias. Esses fatores, posteriormente, difundir e ativar seus respectivos receptores no estroma ou compartimentos epiteliais que promovem uma interação epitélio-mesenquimal. Ambos os compartimentos celulares da glândula são, assim, necessários para o desenvolvimento correcto deste órgão [2] – [4]. Estes mecanismos de sinalização indiretos garantir que o estímulo sistêmica é amplificado dentro do órgão-alvo e que os diferentes tipos de células participar nos eventos morfogênicos de forma coordenada e aperfeiçoá-lo de acordo com as exigências locais.

A maioria destas moléculas liberadas localmente actuam através de receptores específicos de tirosina-quinase (RTK) promovendo várias respostas biológicas, tais como a proliferação, a remodelação da matriz extra-celular e a motilidade das células alvo. Embora alguns desses fatores têm um papel preciso e único durante a morfogênese ou remodelação da glândula, muitas vias de sinalização ativada a jusante de diferentes RTKs são idênticos. Assim, estas vias podem actuar como redundantes, quando activada, simultaneamente, no mesmo tipo de célula, possivelmente, reforçando a cascata de fosforilação e o seu efeito biológico final.

Um dos melhores descrito RTK que actuar como um modulador morfogénica fundamental da mamária glândula é o factor de Crescimento epidérmico receptor (EGFR). Dentro da glândula mamária roedor, anfirregulina libertadas localmente, cujo único receptor conhecido é o EGFR, foi encontrada para mediar a sinalização de estrogénio durante o desenvolvimento mamário puberdade. Os hormônio age esteróides, estimulando a liberação amphiregulin pelo compartimento positivo epitelial do receptor de estrogénio da glândula. Anfirregulina, em seguida, promove a activação do EGFR no interior do compartimento estromal da glândula dirigir a ramificação correcta deste órgão [5], [6]. Embora os principais alvos da amphiregulin são células estromais, isso não exclui que a sinalização EGFR também tem um papel no epitélio. O EGFR é expresso em ambos os compartimentos do estroma e epiteliais [7], [8], e outros ligandos de EGFR, em particular EGF, são altamente expresso nas glândulas durante a gravidez [9]. Assim, o nosso primeiro objectivo foi avaliar se a EGFR desempenha um papel no crescimento celular epitelial mamaria e rotatividade. Nós fizemos isso, visando este receptor com inibidores altamente específicos. A dificuldade de esclarecer o papel do EGFR no adulto compartimento epitelial mamária é possivelmente devido ao fato de que outros receptores, com um padrão de expressão semelhante, pode substituir a ausência de EGFR ou seus ligantes

in vivo

. De facto, fibroblastos do estroma produzir muitos sinais para as células epiteliais vizinhas. Vários factores de crescimento, como o factor de crescimento tipo insulina (IGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF), Neurorregulina e factor de crescimento de hepatócitos (HGF) são expressos no estroma da mama, enquanto que os seus respectivos receptores são encontrados no epitélio [1]. Especificamente, o IGF-I tem um papel importante na morfogénese ductal, e pode ser necessária para as fases posteriores do desenvolvimento mamário [10]. FGFR2 está envolvido no desenvolvimento mamário, em especial na proliferação e invasão por botões extremidade terminal, mas parece dispensável na glândula madura [11], [12]. Neuregulina opera durante o desenvolvimento lóbulo-alveolar na gravidez [13], [14]. Finalmente, o receptor de tirosina cinase para o HGF, Met, verificou-se desempenhar um papel na mamaria ramificação morfogénese em

ex vivo

e

In vitro

experimentos [15], [16]. Met poderia ser um bom candidato para a substituição EGFR desde evidência recente mostrou que este receptor e EGFR pode agir cooperativamente durante o desenvolvimento do rim para regular ureteral bud ramificação e mediar a manutenção do canal adulto recolher o normal [17].

neste estudo foi avaliado em linhas celulares epiteliais mamárias se outros receptores, habitualmente presentes na glândula mamaria, poderiam sustentar actividades EGFR como semelhantes e vias de transdução de sinal, quando a sinalização do EGFR foi excisada pela administração de inibidores altamente específicos. Finalmente, testamos se tais mecanismos compensatórios também estavam presentes nas células tumorais isoladas de um modelo de rato transgénico bem descrito de ErbB2 tumorigênese mamária.

Resultados

As células epiteliais mamárias EGFR Express e Met receptores e Responder para HGF ou Tratamento EGF com a fosforilação de seus receptores respectivos e ativação da ERK1 /2 e AKT Pathways

em primeiro lugar, analisou a expressão de receptores EGFR e MET e a resposta bioquímica aos seus respectivos ligantes em 3 de células epiteliais mamárias linhas de origem diferente. Todas as células expressaram Met e EGFR (Fig. 1A). MCF-10A e NMuMG estimuladas com HGF ou EGF durante 10 min, 30 min ou 60 min apresentado um aumento em fosfo-EGFR, fosfo-Met, fosfo-ERK1 /2 e os níveis de fosfo-AKT que gradualmente retornado perto de níveis basais (Fig . 1B). Dados semelhantes já foram descritos para a linha celular BME-UV [18].

análise de Western-blot da expressão do EGFR e Met no ser humano MCF-10A, murino NMuMG e bovinos BME-UV células epiteliais mamárias. extracto de fígado de rato foi usada como um controlo positivo para ambos Met e EGFR. B. análise de Western-blot de EGFR, Met, ERK1 /2 e a fosforilação de AKT em células MCF-10A e NMuMG cultivadas em meio de fome-soro e tratadas com EGF ou HGF (20 ng /ml) durante 10, 30 e 60 min. EGFR, Met, ERK1 /2 e AKT foram usadas para mostrar cargas comparáveis ​​entre as pistas.

EGFR é necessária para a viabilidade de um subconjunto de linhas de células epiteliais mamárias, enquanto Met Activation é dispensável

para testar se a actividade de EGFR ou Met modular a viabilidade nas linhas de células mamarias foram utilizados inibidores altamente específicos da tirosina cinase do receptor (RTKi; AG1478 para EGFR e PHA-665752 para Met) em concentrações nanomolares. O primeiro testada a especificidade destes inibidores, estimulando as células MCF-10A privadas de soro com o HGF ou EGF em conjunto com AG1478 ou PHA-665752 a 250 nm (Fig. S1). A análise Western blot mostrou que AG1478 e PHA-665752 inibiu exclusivamente a fosforilação do EGFR e Met, respectivamente.

Estes inibidores foram então utilizado num ensaio de viabilidade para testar a dependência de diferentes linhas de células mamárias no Met ou sinalização de EGFR ( A Fig. 2A). As células, cultivadas em seu respectivo meio de crescimento, foram tratados com AG1478 e PHA-665752 (250 nM) e monitorizada por MTT às 24 e 48 h. Todas as linhas de células epiteliais mamárias não foram afectadas pela inibidor da Met PHA-665752. inibição de EGFR por AG1478, não modificou viabilidade BME-UV, enquanto a viabilidade das células MCF-10A e NMuMG foi muito prejudicada.

MTT da MCF-10A, NMuMG e células BME-UV a 0 h, 24 h e 48 h. As células foram cultivadas no seu meio de crescimento (ver Materiais e Métodos) e, ou deixada sem tratamento (Ctrl) ou tratadas com PHA-665752 (PHA) ou AG1478 (ambos 250 nM). valor de MTT a 0 h foi definido como 100%. Colunas, média (n = 6); barras, S.E.M. * P 0,01. B. análise de Western-blot de ERK1 /2 e a fosforilação de AKT em células mamarias cultivadas no seu respectivo meio de crescimento sem (Ctrl) ou com os inibidores de RTK (250 nm, 1 H) PHA-665752 (PHA) ou AG1478 (AG). EGFR, Met, ERK1 /2 e AKT foram usadas para mostrar as cargas comparáveis ​​entre as pistas.

Para determinar o mecanismo de bloqueio viabilidade mediado pela inibição de EGFR que ensaiada do estado de activação de ERK1 /2 e AKT AG1478 seguinte ou tratamento de PHA-665752 em células cultivadas em meio de proliferação (Fig. 2B). Em resposta ao tratamento com AG1478, mas não PHA-665752, as células MCF-10A NMuMG e mostrou uma redução de ambos fosforilação de ERK1 /2 e AKT. De acordo com a incapacidade dos inibidores para reduzir a viabilidade, ERK1 /2 e activação AKT estados mantiveram-se inalterados em todas as condições em células BME-UV.

O HGF-Met Axis Restaura Proliferação, Sobrevivência e morfogênese in NMuMG e As células MCF-10A Privadas de EGFR Atividade

A seguir, analisou se a ativação do Met poderia resgatar as células de restrição de crescimento seguintes inibição EGFR. HGF actuou como um agente de recuperação em células MCF-10A e NMuMG tratados com AG1478 (Fig. 3A). Uma vez que o IGF-I, b-FGF e Neurorregulina foram descritos como mediadores importantes do desenvolvimento mamário [10], [11], [14] testámos o seu efeito como possíveis agentes de recuperação alternativos nas mesmas linhas celulares. Tanto a não aumentar a proliferação em resposta a estes factores de crescimento, após o tratamento AG1478 (Fig. 3A). HGF recuperação mediada em células tratadas com AG1478 foi evidente como um aumento da confluência em células MCF-10A (que crescem ilhas tão compacto; a Fig. 3B painéis esquerdos) e o aumento da densidade celular em células NMuMG (que crescem como células dispersas; A Fig. 3B painéis da direita) .

contagem de células viáveis ​​por exclusão de tripano de coloração azul-de 48 h de células MCF-10A (painel da esquerda) e células cultivadas no seu respectivo meio de crescimento e tratados com os factores indicados NMuMG (painel da direita) (HGF de 10 ng /ml (H), de IGF-I a 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), Neurorregulina 20 ng /ml (n); AG1478 250 nm (A)). Controlo não tratado (Ctrl) foi definida como 100%. Colunas, média (n = 6); barras, S.E.M. * P 0,05. B. células MCF-10A (painéis da esquerda; compósitos de 9 campos) e as células NMuMG (painéis da direita) cultivadas no seu respectivo meio de crescimento durante 24 h com os factores indicados (HGF de 10 ng /ml; AG1478 250 nm). Barra = 1,000 uM. C. morte estendido imagem composta de campo obtidos a partir de várias imagens-Z empilhamento de células MCF-10A (painéis da esquerda) e células NMuMG (painéis da direita) cultivadas em colagénio durante 4 dias com os factores indicados (HGF de 10 ng /ml; 250 AG1478 nM). Barra = 500 um. células e NMuMG (painéis da direita; 16 H); D. distribuição do ciclo celular analisada por coloração com iodeto de propidio e análise de FACS de células MCF-10A (8 h painéis esquerdos) cultivadas em meio de crescimento e tratados com os factores indicados (HGF de 10 ng /ml, AG1478 250 nM).

NMuMG e linhas de células MCF-10A possuem capacidades morfogênicos quando novamente suspensas e cultivadas em uma matriz 3-D como o colágeno [16], [19]. AG1478 teve um efeito dramático sobre a 3D-morfogénese de ambas as linhas celulares, induzindo a morte de todas as células (Fig. 3C, AG e vídeo S1). O HGF foi o factor de crescimento testado apenas capaz de recuperar células da inibição de EGFR (Fig. 3C, Ag + HGF e vídeo S2). EGF, IGF-I, b-FGF e Neurorregulina foram incapazes de recuperar a morte celular após tratamento AG1478 (não mostrado). especificidade reuniram-se para a recuperação HGF em células NMuMG MCF-10A e foi confirmada usando o PHA-665752 a 250 nm em conjunto com AG e HGF inibidor da Met altamente específico. Na presença deste RTKi, HGF perdeu a sua capacidade para recuperar células mamárias de inibição de EGFR (Fig. S2, A + P + H). Análise

Células ciclo por FACS mostrou que a inibição do EGFR levou a um aumento a percentagem de células em G0 /G1 fase (Fig 3D;. AG). tratamento de HGF inverteu a percentagem de células na fase G0 /G1 para valores de controlo (Fig 3D;. Ag + HGF).

HGF é um factor de sobrevivência em células de tumor mamário derivado de um constitutivamente activada Ratos transgénicos ErbB2

testou-se os efeitos descobertos em células mamarias normais pode ser aplicada a células isoladas a partir de um modelo bem descrito de ratinhos transgénicos com mutação de ErbB2 (MMTV-neu; [20]). O primeiro visualizado, por análise de Western-blot, a presença de ErbB2, EGFR e Met em lisados ​​de tumor mamário obtidos a partir de ratinhos diferentes (Fig. 4A). As células primárias obtidas a partir destes tumores foram submetidos a morte celular após 72 horas de tratamento com AG1478 (250 nM), enquanto o PHA-665752 (250 nM) não teve nenhum efeito (Fig. 4B). A fim de testar se a morte celular induzida por AG1478 poderia ser recuperado por activação Met, as células tratadas com AG1478 foram suplementadas com HGF. A viabilidade das células revertidas para os valores de controlo, enquanto que a suplementação de IGF-I, b-FGF e Neurorregulina não teve nenhum efeito (Fig. 4C). Análise do ciclo celular por coloração com iodeto de propídio-e citometria de fluxo mostrou um aumento de células na fase G0 /G1 após adição AG1478 (Fig. 4D, AG). Após as células de tratamento HGF reverteram para valores semelhantes a células não tratadas (Fig 4D;. Ag + HGF). Para confirmar contribuição Met ao mecanismo de recuperação que usamos PHA-665752 em conjunto com AG e HGF. Descobrimos que na presença deste Met TKI, HGF perdeu sua capacidade de recuperar células tumorais ErbB2 de EGFR inativação (Fig S3A;. A + P + H). Para confirmar ainda mais a especificidade de AG1478, que estas células tratadas com dois outros inibidores de EGFR utilizados em protocolos clínicos (Iressa e Tarceva; 1 uM). HGF reteve a capacidade para recuperar células tumorais tratadas com ErbB2 Iressa e Tarceva (Fig. 4E e Fig. S3B). Portanto, as células tumorais ErbB2 obtidos a partir deste modelo transgénico são dependentes de EGFR activado para o crescimento e sobrevivência e pode ser resgatado por activação Met.

análise de Western-blot de expressão ErbB2, EGFR e Met em tumores mamários obtidos a partir de três separados camundongos mutantes transgênica ErbB2 (ver materiais e métodos). Tubulina foi utilizada como um controlo de carga interna. imagens de contraste B. Fase de células primárias de ErbB2 tumores mamários (bar = 500 mm). As células foram cultivadas em meio de proliferação e ou deixada sem tratamento (Ctrl) ou tratados com AG1478 (250 nM) ou PHA-665752 (250 nM) durante 96 h. contagem de células viáveis ​​por coloração C. exclusão tripan-azul às 48 h, de células tumorais ErbB2 imortalizadas tratados com os factores indicados (HGF de 10 ng /ml (H), de IGF-I a 100 ng /ml (I), b-FGF 20 ng /ml (F), Neurorregulina 20 ng /ml (N); AG1478 250 nM (A)). Controlo não tratado (Ctrl) foi definida como 100%. Colunas, média (n = 6); barras, S.E.M. * P 0,05. D. distribuição do ciclo celular analisada por coloração com iodeto de propidio e análise de FACS de células de tumor mamário de ErbB2 cultivadas em meio de crescimento e tratados com os factores indicados durante 16 h (de HGF de 10 ng /ml, AG1478 250 nM). células de E. Immortalized ErbB2 tumorais cultivadas no seu respectivo meio de crescimento durante 48 h com os factores indicados (HGF de 10 ng /ml; AG1478 250 nM; IRESSA 1 uM; TARCEVA 1 uM). Bar = 500 mm

Met fosforilação Simultaneamente Ativa ERK1 /2 e AKT quando EGFR sinalização é inibida:. Importância relativa da AKT Pathways ERK1 /2 e para a proliferação e 3D Morfogênese

para compreender o mecanismo de recuperação mediada por HGF, foi realizada análise de western-blot do EGFR fosforilado, Met e o seu efectores a jusante ERK1 /2 e AKT (Fig. 5A). Para este efeito, as células MCF-10A e NMuMG privadas de soro foram tratadas com EGF (10 ng /ml), o HGF (20 ng /ml) ou IGF-I (100 ng /ml) na ausência ou na presença de AG1478.

análise de Western-blot de EGFR, Met, ERK1 /2 e AKT estado de fosforilação nas células MCF-10A e NMuMG e células tumorais ErbB2 cultivadas em meio de fome durante 16 h e, em seguida, tratados com o RTK inibidores AG1478 (250 nM , 1 h) antes de adicionar as citocinas indicadas (10 min; EGF 10 ng /ml, o HGF de 10 ng /ml, o IGF-I 100 ng /ml). contagem de células viáveis ​​por coloração B. exclusão tripan-azul em 48 h de células NMuMG cultivadas em meio de crescimento e os inibidores indicados (AG /A = AG1478 250 nM; Uo /L = UO126 15 uM; WORT /W = wortmanina 100 nM) na presença ou ausência de HGF de 10 ng /ml (H). Controlo não tratado (Ctrl) foi definida como 100%. %. Colunas, média (n = 6); barras, S.E.M. * P 0,05. C. imagens representativas de células NMuMG cultivados em géis de colagénio, durante 4 dias em meio de crescimento com os factores indicados (concentrações como em B; barra = 250 um).

Todos os factores de crescimento activados tanto a ERK1 /2 e as vias AKT na ausência de inibição de EGFR (Fig. 5A, pistas 3, 5, 7). A seguir ao tratamento AG1478, HGF permaneceu a única citoquina capaz de manter ambas as vias activo em simultâneo, de acordo com o facto de fosfo-Met ainda está presente nas células inibidas EGFR (Fig. 5A, pista 6). Embora os níveis de fosfo-AKT IGF-I activadas não foi afectada pela AG1478, os níveis de fosfo-ERK1 /2 foram abolidas pela inibição de EGFR (Figura 5A, pista 8;. Ver discussão). Portanto salvamento HGF-mediada de proliferação e morfogénese de células mamárias possivelmente necessita de reactivação simultânea de ambos os ERK1 /2 e AKT vias.

análises semelhantes Western blot realizado em células tumorais ErbB2 privadas de soro demonstraram basal fosfo-EGFR, níveis de fosfo-AKT que foram abolidos pelo tratamento AG1478 fosfo-ERK1 /2 e. Analogamente às células mamarias normais, o HGF só tinha a capacidade de restaurar simultaneamente ERK1 /2 e AKT fosforilação na presença de inibição de EGFR. Assim, as células tumorais impulsionado-ErbB2 possivelmente utilizar um mecanismo de recuperação comparável àquele encontrado no NMuMG não malignas e células MCF-10A (Fig. 5A, ErbB2). Para confirmar ainda mais a especificidade de AG1478, as experiências de transferência de Western foram repetidos usando Iressa (1 uM) em NMuMG e células impulsionado-ErbB2, com resultados comparáveis ​​(Fig. S4A).

Uma vez que o EGFR e Met parecem agir através de efectores a jusante semelhantes, nós testamos se EGF e HGF tratamento simultâneo poderia aumentar as células mamárias crescimento, dispersão e morfogênese. As células tratadas simultaneamente com as duas citocinas exibido um aumento na percentagem de confluência (células MCF-10A; Vídeo S3 e Fig S4B.), Dispersão e morfogênese (células NMuMG; Figura S4C). Relação ao EGF apenas células ou HGF única tratados

finalmente analisada a importância relativa dos /2 e AKT vias ERK1 durante a proliferação e morfogénese em EGFR células mamárias inibidos (Fig. 5B). Para este efeito, inibiu selectivamente /2 e /ou AKT vias ERK1 UO126 com 15 uM e wortmanina 100 nM, respectivamente. Tais inibidores foram acoplados com AG1478 tratamento, a fim de entender se o HGF reteve a capacidade de recuperar o crescimento em células mamarias que não possuem estes percursos. Inibição da ERK1 /2 e PI3K-AKT, separadamente e em conjunto com o bloqueio de EGFR, levar a um decréscimo na viabilidade celular. Curiosamente, sob todas as condições inibidoras, o HGF aumentou os números de células, embora com eficiências diferentes de acordo com o tratamento. Este comportamento indica que na ausência de qualquer combinação de sinalização de EGFR /ERK1-2 /AKT, Met ainda aumenta a proliferação em cultura de células em 2D (Fig. 5B painel superior e a Fig. S5) provavelmente activação de vias de sinalização alternativas.

Uma análise realizada em células NMuMG cultivadas em 3D de colágeno suspensões nos deu resultados diferentes e mostrou que ERK1 /2 sinalização era sempre necessário para sustentar a viabilidade (Fig 5B painel inferior.): a suplementação com HGF não poderia restaurar a viabilidade em UO126 células tratadas (UO ; UO + HGF; AG + UO; AG + UO + HGF). Por outro lado, a inibição da via de sinalização de PI3K-AKT parou elongação ductal, mas não matam as células (erva). HGF adição crescimento restaurado e morfogénese (erva + HGF) em células tratadas com wortmanina. Curiosamente, quando as células inibidas EGFR foram tratados simultaneamente com Wortmannin, HGF não poderia agir como um agente de recuperação (AG + WORT e A + W + HGF). Estes dados indicam que, na ausência de sinalização de EGFR a ERK1 /2 e as vias de PI3K-AKT são ambos, independentemente, necessária para o crescimento de uma matriz de três dimensões mas não em um ensaio de proliferação 2D.

Discussão

crescimento dos órgãos, homeostase dos tecidos normais e desenvolvimento do tumor pode partilhar caminhos biológicos comuns. Neste estudo, trataram da relação entre EGFR e reuniu-se as vias de sinalização em células epiteliais mamarias normais bem como em células derivadas a partir de um modelo transgénico bem descrito de tumorigénese mamária. Verificou-se que 2 de 3 linhas de células testadas epiteliais mamárias, o NMuMG murino e as linhas de células MCF-10A humano, são dependentes da atividade de EGFR, a fim de crescer em um ensaio de proliferação de 2D e para sobreviver num ensaio de morfogénese-3D. Um papel fundamental para o receptor de EGF na morfogénese da glândula mamaria foi encontrado durante o crescimento pré-púberes no compartimento estromal deste órgão [5], [21], mas, a partir de agora, não há nenhuma função conhecida para este receptor no compartimento epitelial da glândula mamária adulto. Aqui descrevemos que o EGFR é fundamental para o crescimento e a viabilidade em linhas celulares mamarias não tumorigénicas específicas que tenham sido obtidos a partir de tecidos mamários adultos. O comprometimento do EGFR, mas não o TEM sinalização nestas linhas celulares interrompido morfogênese e morte celular induzida completa. dependência de células MCF-10A com o EGFR pode ser devido a estas células serem cultivadas num meio contendo EGF. Uma possível explicação para o EGFR em células de vício NMuMG é que esta linha celular produz os seus próprios ligandos de EGFR. De facto, encontraram níveis elevados de expressão de ARNm em células anfirregulina NMuMG (dados não mostrados), possivelmente conduzindo a proliferação de um loop autócrino. Outras células epiteliais mamarias têm sido mostrados para produzir e libertar ligandos de EGFR [22], por conseguinte, este mecanismo de crescimento pode ser comum às células epiteliais mesmo na glândula mamária adulto. O facto de que a BME-UV células mamárias bovina não respondem à inibição de EGFR é provavelmente devido ao facto de que esta linha de células mantém as vias de ERK1 /2 e AKT activas sob tratamento AG1478. Uma possível explicação é que, durante o processo de imortalização, inativação de importantes supressores de tumor (como PTEN) trouxeram células BME-UV para ativar constitutivamente estas vias fundamentais de sinalização. Outra hipótese especulativa é que, em bovinos, que não são propensas a desenvolver cancros mamários, essas vias têm níveis de fosforilação constitutivamente mais elevados, mesmo em linhas de células não tumorigénicas. A diferença de sensibilidade EGFR encontrados em linhas de células, coloca a questão de saber se algumas células mamárias pertencentes a diferentes compartimentos da glândula (por exemplo basal ou luminal) podem ter diferentes requisitos para o crescimento. Expandindo nossa pesquisa com outras células mamárias linhas de diferentes origens podem esclarecer esta dúvida. Este facto também é importante porque os tumores que surgem a partir de células de um determinado compartimento pode mostrar respostas diferentes a inibidores específicos.

Embora Met era dispensável para o crescimento em todas as linhas celulares testadas, o HGF foi a única citoquina capaz de recuperar a proliferação e morfogênese in EGFR células inibida. Alguns autores descreveram um papel direto para HGF na glândula mamária [23], [24], mas os dados completo que esclarecer o papel que desempenha receptores Met

in vivo

ainda faltam. Nosso laboratório está atualmente avaliando o papel do Met por gene que alveja com promotores específicos mamárias (MMTV-cre e Wap-CRE), mas de forma coerente com as

in vitro

dados aqui apresentados, que ainda não encontraram um papel para o receptor do HGF nestes modelos transgénicos (manuscrito em preparação). Interessantemente, outros factores de crescimento (IGF-I, b-FGF e Neurorregulina), que foram descritos como mediadores importantes da morfogénese mamaria [10] – [14], [25], não foram capazes de actuar como agentes de recuperação nestas células. Não podemos excluir que esses fatores podem desempenhar um papel importante em células derivadas de diferentes subpopulações de glândulas ou os cancros da mama mamária. Dados recentes revelam que o EGFR pode desempenhar um papel significativo em algumas respostas biológicas de HGF /Met mediadas de tumor mamário e células epiteliais. Neste sistema de inibição da cinase de EGFR gefitinib ou erlotinib com abolida HGF induziu a proliferação e motilidade de algumas células de carcinoma [26]. Pelo contrário nas nossas condições experimentais Met foi capaz de actuar como um agente de recuperação em células inibidas EGFR e fosfo-Met e fosfo-EGFR pareciam ser activado, pelo menos em parte, separadamente. Embora não podemos descartar um certo grau de Met-EGFR transativação em nosso sistema, a maior parte da sinalização a jusante é evocada por um mecanismo independente, ou conduzido-EGFR Met-driven. A diferença nos resultados pode depender das diferentes linhas de células que, quando usado ou a sua condição de cultura (sempre usados ​​meio de crescimento completo com factores de crescimento e de soro para a maior parte das experiências). Este resultado indica como dois percursos específicos que se originam a partir de receptores diferentes pode dirigir respostas celulares semelhantes (por exemplo, viabilidade ou a proliferação) de forma independente uns dos outros.

Nós também descobrimos que a activação síncrona de EGFR e Met aumento do crescimento, e de dispersão morfogênese em células NMuMG e MCF-10A. Este efeito, em que dois receptores de tirosina-quinase separadas podem actuar de uma forma redundante e aditivo para promover o crescimento celular, não é único para as células mamarias.

In vivo

, durante a morfogênese rim, tecidos Met específicas knock-out têm reduzido número final de néfrons. Cruzando estes ratinhos com agitavam-2 mutantes espontâneos, transportando um único ponto de mutação que reduz a actividade de cinase de EGFR, afecta botão uretérico de ramificação, bem como número glomerular final [17]. Recentemente, mostrou que um mecanismo semelhante de redundância EGFR /Met acontece também na glândula mamaria [27].

ErbB2 é um iniciador importante da tumorigénese mamária com mais de 30% de cancros da mama humano que exibe amplificação e sobre-expressão de ErbB2 [ ,,,0],28]. O EGFR é muitas vezes um parceiro de dimerização para ErbB2 quer fisiologicamente, durante o desenvolvimento da glândula mamaria [13], [29], e tumores patologicamente em ErbB2 accionados [30]. Nós portanto, avaliou os efeitos de EGFR inactivação num modelo transgénico bem descrito de tumorigénese mamária. Esta linha transgénica expressa uma orientada para o promotor de MMTV-ErbB2 rato transportando uma mutação que força a activação constitutiva do receptor [20]. Todos os tumores obtidos a partir de murganhos mutantes ErbB2 mostrou EGFR, ErbB2 e expressão de Met. inibição EGFR causou a morte de células primárias e imortalizadas isoladas a partir deste tumor. Uma vez que a inibição do EGFR por AG1478 para a concentração utilizada nos nossos ensaios é selectivo (IC50 de 3 nM; IC50 é ErbB2 100? M) a mutação ErbB2 possivelmente activa EGFR através hetero-dimerização. Na verdade observou-se um decréscimo de ambos fosfo-EGFR e ErbB2-fosfo (não mostrado) em células tumorais ErbB2 por tratamento com AG1478. Por conseguinte, verificou-se que neste modelo transgénico, activação ErbB2 que impulsiona o crescimento do tumor é acoplada a actividade de cinase de EGFR, o que é fundamental para a viabilidade celular. tratamento de HGF resgatado células tumorais inibidas EGFR, o que indica que as vias semelhantes às presentes nas células mamarias NMuMG e MCF-10A pode também ser utilizada pelas células cancerosas para sustentar o seu crescimento. O facto de as células tumorais respondem ao HGF com o aumento da proliferação e a sobrevivência após a inibição do EGFR também tem sido dirigida no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Um subconjunto de doentes com NSCLC que desenvolvem resistência a inibidores de EGFR mostram o aumento dos níveis de HGF que suportam um papel para estromal derivada de HGF na promoção da resistência a drogas [31], [32]. Este tipo de resistência, no qual os níveis de receptores normais são acompanhadas por uma maior expressão do respectivo factor de crescimento no estroma circundante, pode, assim, representar um mecanismo usado pelas células de tumor para escapar tratamento RTKi. Nossos achados sobre a recuperação HGF mediada, estender os resultados publicados anteriormente para as células epiteliais mamárias e células tumorais mamárias ErbB2, enfatizando o fato de que os eventos moleculares presentes em células não tumorigénicas poderiam ser retidos durante o crescimento do tumor e tornar-se a base para a resistência às drogas.

Um dos possíveis mecanismos de recuperação de células mamárias subjacente por tratamento HGF seguinte EGFR inativação foi a capacidade desta citocina para ativar ambos os /2 e AKT percursos ERK1. Assim, investigou-se a importância relativa destes dois percursos de condução a resistência à inibição de EGFR. Os nossos resultados mostram que o HGF foi a única citoquina com a capacidade para activar as vias de AKT independentemente da sinalização de EGFR ERK1 /2 e. Confirmando as observações feitas por outros autores [33] – [35], que demonstraram que knockdown ou bloqueio dos EGFR bloqueou a MAPK IGF-I-induzida (sugerindo que o receptor do IGF-I podem agir a montante do EGFR) encontramos que o IGF-I não pode resgatar a via 2 /ERK1, mas pode resgatar a Akt em todas as linhas celulares inibidas EGFR. Em conformidade com a sua incapacidade para resgatar células inibidas EGFR, básico-FGF foi incapaz de activar nem a ERK1 /2, nem a via PI3K-AKT nas linhas celulares NMuMG e MCF-10A (dados não mostrados). Além disso, tanto estas linhas celulares não aumenta a proliferação seguinte b-FGF ou tratamento Neurorregulina. Assim, é possível que a b-FGF e Neurorregulina não foram funcionais no nosso modelo celular, eventualmente, para a falta de seus respectivos receptores, identificar linhas de células mamárias com diferentes necessidades de factor de crescimento.