Abstract

MicroRNA-30c (miR-30c) foi relatado para ser um supressor tumoral no câncer de endométrio (CE). Nós demonstramos que o miR-30c é sub-regulada no tecido CE e é altamente expresso no receptor de estrogénio (ER), células-B-1 -negativas HEC. MiR-30c inibe directamente MTA-1 expressão e funciona como um supressor de tumor por meio da via de sinalização de miR-30c-MTA-1. Além disso, o miR-30c é diminuída mediante E

2 de tratamento em ambas as células de Ishikawa e ER-negativo HEC-1-B ER-positivo. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que miR-30c é um importante miRNA desregulamentado no CE e poderá servir como um biomarcador potencial e novo alvo terapêutico para a CE

Citation:. Kong X, Xu X, Y Yan, Guo F , Li J, Hu Y, et al. (2014) Estrogênio Regulamenta o tumor supressor de miRNA-30c e seu gene alvo, MTA-1, no câncer de endométrio. PLoS ONE 9 (3): e90810. doi: 10.1371 /journal.pone.0090810

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de agosto de 2013; Aceito: 04 de fevereiro de 2014; Publicação: 03 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por seis Talent Projeto Cúpula das bureau província de Jiangsu Pessoal (WSW-021). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial (CE) é o tumor maligno mais frequente do trato genital feminino em todo o mundo. O câncer endometrial é composto por dois subtipos patogênicos diferentes. Tipo I tumores são cânceres de baixo grau relacionadas com estrogénio endometrióides (CEE), que geralmente se desenvolvem a partir hiperplasias endometriais complexas e atípicos em mulheres peri-menopausa. Em contraste, os tumores do tipo II são cancros não-endometrióides agressivos (NEEC) que não estão relacionados à estimulação estrogênio e que se desenvolvem a partir do endométrio atrófico de mulheres idosas. As diferenças entre os dois subtipos da CE levar a um tratamento e prognóstico [1].

A importância de microARNs (miARNs), um tipo de ARN não-codificante, foi demonstrada em cancro diferente. Os genes que codificam miARNs de mamífero são inicialmente transcrito como miARNs primárias (pri-miARNs), que são transformados pelos complexos enzimáticos e Drosha Dicer para se tornar miARNs precursoras (pré-miARNs) e miARNs maduros [2]. Os miARNs maduros são aproximadamente de 22 nucleótidos de comprimento, as moléculas de cadeia simples de ARN que regulam a expressão dos genes alvo por complementação imprecisa para as regiões não traduzidas 3 ‘(UTRs), 5’-UTR, e mesmo sequências codificantes dos mRNAs para reprimir a tradução em animais [2] – [5]. O estrogénio (E

2) e o receptor de estrogénio (ER) foram mostrados para modular miARNs tais como o miR-125a [6] e miR-429 [7] no útero do rato, miARN-20a e miARN-21 no endométrio normais células epiteliais glandulares [8], Deixe-7 família, miR-27a, miR320 e miR-424 [9] em células CE, miR-104 [10], miR-7 [11], miR-21 [12], miR -30C e miR-103 [13] em células de cancro da mama, o miR-135b em células colorrectais [14] e miR-203 em células de músculo liso vascular [15]. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que E

2 e jogo ER papéis importantes na regulação do miRNA.

Recentemente, a desregulamentação do miR-30c tem sido relatado, não só para ser relevante para a tumorigênese e progressão de muitos cancros, tais como CE [16], [17], câncer de ovário [18], [19], o cancro da mama [20] – [23], o cancro do pulmão [24], carcinoma de células renais de células claras [25], câncer gástrico [26], o cancro da bexiga [27] e do neuroblastoma [28], mas também para expor implicações de diagnóstico e prognóstico potenciais, bem como para representar um alvo terapêutico potencial de quimio e radioterapias para cancros [18], [29], [ ,,,0],30]. Actualmente, associada a metástases do gene-1 (MTA-1) [17], KRAS [20], Dll4 [31], TWF1, vimentina [21], BCL9 [19], REDD1 [32], PAI-1 [33] e CTGF [34] foram identificadas como alvos de miR-30c, e SERPINE1 [28], NYH11, GPRASP2 DDR2 [16], PPARGC1B, Makorin-3, UBAC1, PTPDC1 [22] snail1 [35], p53 [36] são alvos potenciais que continuam a ser validado. Porque miR-30c apresenta uma diminuição relativa na expressão de endométrio normal a hiperplasia atípica ao câncer, e porque o papel do miR-30c na CE permanece desconhecida, foi realizada uma investigação do papel de miR-30c na CE. Os nossos estudos anteriores descobriram que os objectivos de miR-30C MTA-1, que é altamente expresso em EC [37] e funciona como supressor tumoral em linhas celulares de EC [17]. No entanto, os papéis precisos de miR-30c e MTA-1 em CE não são claras. Portanto, realizamos este estudo prolongado.

Neste estudo, avaliamos a expressão de miR-30c em tecidos da CE e diferentes linhagens de células CE, investigada a relação entre o miR-30c e MTA-1, validou a função supressora de tumores de miR-30c e explorou a regulação do miR-30c em linhagens de células CE. Assim, buscou-se determinar a função de supressão do tumor de miR-30c, o que definiria seu valor potencial como um novo alvo terapêutico para o tratamento da CE.

Materiais e Métodos

Pacientes e tecidos amostras

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Nanjing Drum Tower Hospital Filiado à Universidade de Nanjing. Os sujeitos do estudo foram recrutados de pacientes no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School, em Nanjing, China. consentimento informado por escrito foi recebida de todos os participantes envolvidos no estudo. Todas as amostras foram coletadas com o consentimento informado dos pacientes e confirmada pelo exame patológico. Todos os pacientes sofriam de tipo I CE e nenhum deles recebeu tratamento pré-operatório, tal como terapia de radiação ou quimioterapia. 21 amostras de tecido de tumores primários da CE foram obtidos a partir dos pacientes CE, e 14 amostras de tecidos endometriais normais foram obtidos a partir de mulheres que se submeteram a histerectomia (laparoscópica ou abdominal) para o tratamento de outras doenças, tais como mioma uterino ou prolapso.

linhagens de células CE e tratamentos

células

Human CE Ishikawa foram gentilmente cedidas pelo Professor LHWei (Hospital Peking University Pessoas, China), e HEC-1-B foram adquiridos a partir da coleta de células de Xangai (Shanghai, China). As células Ishikawa foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Gibco, EUA), e as células HEC-1-B foram cultivadas em 5A meio de McCoy (Gibco, EUA), ambos os quais foram complementados com soro bovino fetal a 10% ( FBS, Gibco). As células foram mantidas em 5% de CO

2 atmosfera humidificada a 37 ° C. Para determinar a regulação da E

2, as células foram tratadas com 17β-estradiol (E

2, 10

-8 M e 10

-10 M, Sigma, EUA) durante 6, 12, 24 e 48 h em placas de 6 poços. Ishikawa e HEC-1-B As células foram co-tratados com o antagonista de ER fulvestrant (ICI 182780, 10

-8 M, Sigma, EUA) e 10

-8 M ou 10

-10 ME

2 para 24 e 48 h, respectivamente.

transfecção celular

Os imita (miR10000244) e inibidor (miR20000244) de miR-30c, pequeno RNA de interferência do MTA-1 (si- MTA-1, si-h-MTA1_001) e seus respectivos oligonucleotídeos mexidos, imita-sc (miR01101), inibidor-sc (miR02101), Sir-sc (siN05815122147), foram concebidos e sintetizados por Guangzhou RiboBio (Guangzhou, China). Todos os oligonucleótidos foram transfectados para células utilizando Lipofectamina

TM 2000 (Invitrogen, EUA) em meio Opti-MEM isento de antibiótico (Invitrogen, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante, a uma concentração final de 50 nM. Para as co-transfecções, utilizou-se 25 nM de cada oligonucleótido. O ARN total e as proteínas foram extraídos às 48 h após a transfecção para análise posterior. As células não-transfectadas Ishikawa em meio de cultura também foram preparadas para servir como controlos simulados.

quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR)

O ARN total de tecido e células foi extraído usando TRIzol reagente (Invitrogen, EUA). O iniciador de RT stem-loop ininterrupto de miR-30c, iniciadores de miR-30c, U6 e MTA-1 para qRT-PCR foram descritos em nosso estudo anterior [17]. A GAPDH, pri-miR-30c, e pré-miR-30c iniciadores foram concebidos como segue: GAPDH iniciador directo: TGAACGGGAAGCTCACTGG, GAPDH iniciador inverso: TCCACCACCCTGTTGCTGTA; pri-miR-30c iniciador directo: GCCCAAGTGGTTCTGTGTTT, pré-miR-30c iniciador directo: ACCATGCTGTAGTGTGTGTAAACA, e pri-miR-30c /pré-miR-30c iniciador inverso: TCCATGGCAGAAGGAGTAAA. O ADNc foi sintetizado a partir de ARN total por transcrição reversa, utilizando o kit de reagente PrimeScript ™ RT (Takara, Dalian, China). Em seguida, qRT-PCR foi realizado usando o kit de SYBR PrimeScript ™ RT-PCR (Takara, Dalian, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de expressão relativos de miR-30c e MTA-1 foram determinados usando o

-ΔΔCt método de análise de 2; os níveis de GAPDH e U6 foram usados ​​como controles internos para MTA-1 e miR-30c, pri-miR-30c, pré-miR-30c.

Western Blot

As células foram colhidas e lisadas em radioimunoprecipitação ensaio (RIPA) de tampão de lise (Sigma, EUA), contendo um cocktail inibidor da protease (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). As concentrações de proteína dos lisados ​​celulares totais foram medidas utilizando o kit de ensaio de proteína Micro BCA (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, EUA). Uma quantidade igual (50 ug) de cada lisado celular foi resolvido por electroforese em 10% SDS-poliacrilamida gel (SDS-PAGE) e transferidos para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA), que foram bloqueadas em TBST com 10% não-gordo, de leite em pó. As membranas foram sondadas com um anticorpo primário contra o MTA-1 (1:500, Abcam, Cambridge, UK) e um anticorpo secundário de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated (1:5000, Bioworld Technology, EUA). As proteínas de interesse foram então detectado utilizando um sistema de detecção de mancha de quimioluminescência aumentada (ECL) (Millipore, Billerica, MA). GAPDH foi usada como um controlo de carga. A intensidade relativa das bandas alvo foi analisado utilizando Quantity One.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi analisada utilizando um ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT). As células foram semeadas em placas de 96 poços (5 x 10

3 células /cavidade) ou directamente às 24 h após a transfecção e foram incubadas durante 24, 48, 72 e 96 h, respectivamente. Após incubação com 25 ul de MTT (5 mg /ml, Sigma, EUA) a 37 ° C durante 4 h, os sobrenadantes foram removidos e 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma, EUA) foi adicionado a cada poço. O valor de absorvância (DO) de cada poço foi medido a 490 nm. Para cada condição experimental, foram utilizados 6 poços, e a experiência foi realizada em triplicado.

A migração celular e invasão ensaio

A migração celular foi medida utilizando um ensaio de cicatrização da ferida. As células transfectadas foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até à confluência. As feridas foram feitas utilizando uma ponta de pipeta de p10, e as células foram lavadas com PBS para eliminar detritos e células isoladas. As células foram então incubadas em meio isento de soro durante mais 24 ou 48 h. As aberturas individuais foram observadas e fotografadas utilizando um microscópio invertido, a 0, 24 e 48 h à mesma posição da ferida.

Os ensaios de invasão celular foram realizados em 24 poços, as câmaras de invasão de Matrigel-revestidas. Às 48 h pós-transfecção, 2 × 10

4 células em 0,2 ml de soro-livre de DMEM foram adicionados às câmaras superiores (8-um, Millipore), as quais foram revestidas com 30 de Matrigel ul (BD Bioscience, San Jose , CA), e 0,6 ml de 10% de FBS-DMEM foi adicionado como o quimioatractivo para a câmara inferior. As células foram incubadas a 37 ° C durante 24 h, após o que as células não invasoras foram removidos com cotonetes de algodão. As células invasoras foram coradas com 0,1% de violeta de cristal. As células foram contadas em 5 campos aleatórios de alta potência a 200 × ampliação por poço. O experimento foi realizado em triplicado.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, EUA). Os valores são apresentados como médias ± DP. teste t de Student foi utilizado para comparar os valores das amostras de teste e de controlo. As diferenças entre os grupos de tratamento foram examinadas para a significância estatística usando ANOVA de uma via. O nível de significância estatística foi designado como P . 0,05

Resultados

A expressão de miR-30c e MTA-1 em amostras CE e linhas celulares

MIR-30c foi relatado para expor relativamente a diminuição da expressão de endométrio normal a hiperplasia atípica para o cancro [16] e para funcionar como um supressor tumoral em linhas celulares de EC [17]. No entanto, não há outros estudos demonstraram que o miR-30c desempenha um papel na CE. Por conseguinte, foram investigados primeiro a expressão relativa de miR-30c entre as amostras de tecido em estudo. Nossas análises de qRT-PCR mostrou que o miR-30c é significativamente diminuída em amostras CE (Fig. 1A), sugerindo que o miR-30c desempenha um papel na incidência de CE.

(A). MiR-30c foi diminuída em 21 amostras CE em comparação com 14 NE amostras, tal como indicado por análise de qRT-PCR. Cada amostra foi avaliada em triplicado. (B). MiR-30c foi altamente expressa em células de HEC-1-B em comparação com as células de Ishikawa, como indicado por análise de qRT-PCR. (C) e (D). A expressão de MTA-1 foi diminuída em células HEC-1-B em comparação com as células de Ishikawa do ARNm (C) e os níveis de proteína (D). Cada barra representa os valores médios ± DP de três experiências independentes. (* P 0,05, ** P 0,01).

próxima avaliada a expressão de miR-30c em diferentes linhas celulares. células de Ishikawa ER-positivas e células HEC-1-B ER-negativas representar modelos do tipo I e tipo II CE, respectivamente. A nossa análise de qRT-PCR revelou que o miR-30c é altamente expresso em células de HEC-1-B, em comparação com as células de Ishikawa, por 1,79 vezes (Figura 1B.), Sugerindo que a expressão de miR-30c correlaciona-se com ER ou E

2. Em seguida, foram avaliados os níveis de MTA-1 expressão em diferentes linhas celulares e descobriu que ele é altamente expressa em células de Ishikawa em ambos os níveis de proteína (Fig 1C e 1D) mRNA e. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam uma correlação negativa entre o miR-30c e MTA-1, consistente com a nossa conclusão anterior de que o miR-30c atinge MTA-1.

Variação de expressão de miR-30c modula a expressão de seu alvo gene, MTA-1, em células CE

Nós já demonstrou que tem como alvo miR-30c MTA-1 transcritos de mRNA na Ishikawa e linhas celulares HEC-1-B utilizando um ensaio de repórter de luciferase. Para elucidar completamente a relação entre o miR-30c e MTA-1, utilizou-se o miR-30C-imita e miR-30c-inibidor para restaurar e para reduzir a expressão de miR-30c, respectivamente. Além disso, utilizou-se Sir-MTA-1 a knockdown MTA-1 em células de Ishikawa.

A expressão de miR-30c em células de Ishikawa foi regulada por 23,14 vezes e para baixo-regulado por 0,043 vezes por transfecção com miR-30C-imita e miR-30c-inibidor, respectivamente (Fig 2A). Após a eficiência de transfecção suficiente, verificou-se que MTA-1 expressão foi significativamente diminuída quando o miR-30c foi restaurada e que a redução de miR-30c-regulada MTA-1 expressão (Fig 2B).

(A) . A eficiência de transfecção de células de Ishikawa foi avaliada pela qRT-PCR em 48 h após a transfecção de miR-30c-imita e miR-30c-inibidor, mostrados como vezes de mudanças em relação aos seus controles mexidos. (B). MTA-1 a expressão da proteína foi avaliada por análise de Western blot em 48 h após transfecção com miR-30C-imita, de miR-30c-inibidor e os seus comandos mexidos. (C). A cotransfecção com inibidor de miR-30c, Sir-MTA-1 e os seus controlos mexidos foi realizada, e MTA-1 a expressão da proteína foi avaliada por análise de Western blot. (D e E). Sir-MTA-1 reduz MTA-1 expressão nos níveis de proteína (E) mRNA (D) e às 48 h após a transfecção. (F). análise de qRT-PCR mostra um aumento na expressão de miR-30c depois do MTA-1 foi inibida de expressão. Cada barra representa os valores médios ± DP de três experiências independentes. (* P 0,05, ** P 0,01).

Em experiências de co-transfecção, descobrimos que inibidor de miR-30c e Sir-MTA-1 reproduzido de forma antagônica em MTA-1 regulamento (Fig 2C). Juntamente com a observação de que sir-MTA-1 suppresseed a expressão de MTA-1, tanto o ARNm e os níveis de proteína (Figura 2D e 2E), acreditamos que o miR-30c faz, de facto, regulada negativamente MTA-1. Curiosamente, a repressão do MTA-1 expressão de Sir-MTA-1 resultou em um aumento da expressão de miR-30c (Fig 2 F).

Em conjunto, que confirmou que miR-30c diretamente reprimida MTA-1 expressão e que uma reacção de ciclo está presente entre eles. Embora mais estudos são necessários para explorar o mecanismo subjacente específico a sua regulação por feedback-loop, estes resultados suportam a noção de que o miR-30c pode funcionar através da inibição da MTA-1 em CE.

Mir-30c regula a proliferação celular, migração e invasão na CE

Como o nosso estudo anterior mostrou, a expressão ectópica de miR-30c pode inibir a proliferação celular CE, migração e invasão [17]. Aqui, nós fornecemos mais provas para confirmar estes efeitos em células de Ishikawa. A expressão ectópica de miR-30c inibiu a proliferação celular num ensaio MTT. A viabilidade das transfectado foi reprimido (Fig 3A) e proliferação celular relativa foi reduzida a 72 e 96 h pós-transfecção (Figura 3B). Em termos de migração e invasão, foi realizada uma cicatrização de feridas e um ensaio Transwell. A transfecção de miR-30C-imita diminuiu migração e invasão comparado com os imitadores-sc, como mostrado na figura 3C e 3D. Por outro lado, as capacidades de proliferação celular, migração e invasão foram reforçadas seguinte, as células foram transfectadas com o miR-30c-inibidor (Fig 3A -3D).

(A). Um ensaio de MTT mostra que imita o miR-30C suprimida a viabilidade celular (superior), enquanto inibidor de miR-promovido 30c viabilidade celular (inferior). (B). Mir-30c-imita reduz a proliferação celular relativa (superior), ao passo que miR-30c-inibidor aumenta a proliferação celular relativa (inferior), respectivamente, em 72 e 96 h após a transfecção. (C). Fotografias representativas do ensaio de cicatrização da ferida que mostra a capacidade migratória das células transfectadas a 0, 24 e 48 horas após o ferimento. (D). fotografias representativas de invasão celular em um ensaio Transwell. O número médio de células foi contado a partir de 5 campos aleatórios (200 ×). Os valores apresentados são os valores médios ± DP da invasão celular relativa. (* P 0,05, ** P 0,01).

Assim, a expressão variável de miR-30c provocou efeitos diferentes sobre as características malignas de células de Ishikawa. Acreditamos que o miR-30c funciona como um supressor de tumor, influenciando a proliferação, a migração e a invasão de células CE.

funções miR-30c como um supressor de tumor, através do miR-1-30c-MTA via de sinalização

Foi previamente assumido que os alvos de miR-30C MTA-1, que é sobre-expresso em EC [37], e que actua como um oncogene em muitos tumores humanos [38], [39]. No entanto, a função de MTA-1 em CE permanece indefinido. Por isso, nós investigamos se as funções de miR-30c através da via de sinalização de miR-30c-MTA-1. A repressão de MTA-1 por Sir-MTA-1 inibiu a proliferação de células de Ishikawa, como indicado pelos nossos resultados de MTT (Fig 4A). Além disso, a perda de MTA-1, também reduziu a migração celular e invasão, como indicado pelo nosso cicatrização de feridas e os resultados do ensaio Transwell (Figura 4B e 4C). Estes resultados revelaram que a MTA-1 desempenha um papel pro-tumorigénico em células CE através da regulação da proliferação, a migração e a invasão de células de Ishikawa. Uma vez que o miR-30c pode reprimir directamente a expressão do MTA-1, e MTA-1, porque é um oncogene em CE, acreditamos que o miR-30c funciona como um supressor de tumor por segmentação MTA-1.

(A ). Um ensaio de MTT mostra a viabilidade de células (esquerda) e proliferação celular relativa (direita) foram reprimidos por transfecção de Sir-MTA-1 a 72 e 96 h. (B). Fotografias representativas do ensaio de cicatrização mostrar a capacidade migratória das células transfectadas a 0, 24 e 48 horas após o ferimento. (C). fotografias representativas de invasão celular em um ensaio Transwell. O número médio de células foi contado a partir de 5 campos aleatórios (200 ×). Os valores apresentados são os valores médios ± DP da invasão celular relativa. (D) e (E). Cotransfec�o de miR-30c-inibidor e Sir-MTA-1; cotransfecção de miR-30c-inibidor e SIR-sc serviu como controlo. (D). Em comparação com a transfecção de controlo, a viabilidade celular (superior) e da proliferação celular relativa (inferior) foi suprimido em 96 h. (E). fotografias representativas de invasão celular em um ensaio Transwell. O número médio de células foi contado a partir de 5 campos aleatórios (200 ×). Os valores apresentados são os valores médios ± DP da invasão celular relativa. As diferenças de proliferação celular relativa entre os grupos apareceu após 96 h após a transfecção. (* P 0,05, ** P 0,01).

Para estender nosso estudo, cotransfectadas miR-30c-inibidor e Sir-MTA-1 em células de Ishikawa e descobriu que a redução do MTA -1 atenuada proliferação e invasão celular mediada por miR-30c-inibidor, quando comparada com o grupo controlo transfectado-(Fig 4D e 4E). Nossos resultados sugerem que a função miR-30c depende MTA-1 e validado a existência de miR-30c MTA-1-via de sinalização.

O estrogênio down-regula a expressão de miR-30c em células CE

Tendo demonstrado a capacidade supressora de tumor de miR-30c, nós próxima investigou a regulação do miR-30c. A diferença na expressão de miR-30c entre as células de Ishikawa ER-positivo e células B-1-HEC ER-negativas sugere que E

2 e ER podem desempenhar papéis importantes na regulação de miR-30c. Assim, investigamos se as mudanças de expressão de miR-30c em cima E

2 tratamento.

Em comparação com o controle em branco, a expressão de miR-30c foi marcadamente down-regulada de forma tempo e dose-dependente em 6, 12, 24 e 48 h após a 10

-8 M e 10

-10 ME

2 tratamento de células de Ishikawa ER-positivos (Fig 5A). As alterações na expressão de miR-30c induzidas por E

tratamento 2 foram em parte revertida pela co-tratamento com ICI182780 em células de Ishikawa (Fig 5B). Além disso para o E

2 repressão induzida por tratamento de miR-30c, pri-miR-30c e pré-miR-30C foram também regulada para baixo (Figura 5C), sugerindo que a E

2-ER pode inibir a transcrição de miR-30c nas células de Ishikawa.

(a). MiR-30c foi reduzido por tratamento com 10

-8 M e 10

-10 M E

2 a 6, 12, 24 e 48 h após o tratamento por análise de qRT-PCR em células de Ishikawa. O tratamento com 10

-8 M E

2 exercida uma inibição mais significativo, exceto às 48 h. (B). 10

-8 M ICI182780 inverteu parcialmente a redução dos níveis de miR-30C induzida pelo tratamento com 10

-8 M e 10

-10 M E

2 a 24 h após a co-tratamento em células de Ishikawa. (C). níveis pré-miR-30C foram reduzidos por E

2 de tratamento, tanto no Ishikawa e células HEC-1-B (superior). níveis de 30C-Pri-miR foram reduzidos por E

2 Tratamento em Ishikawa, mas não em células HEC-1-B (inferior). (D). níveis de miR-30C foram reduzidos em cima 10

-8 M e 10

-10 ME

2 tratamento aos 6, 12, 24 e 48 h após o tratamento por análise de qRT-PCR em células HEC-1-B . O efeito de duas concentrações diferiu em 12 h após o tratamento. (E). 10

-8 M ICI182780 não reverteu redução dos níveis de miR-30c induzida pelo tratamento com 10

-8 M e 10

-10 ME

2 a 48 horas após a co-tratamento em HEC-1 células -b. (F). O tratamento com 10

-8-ME

2-regulado a expressão de ARNm de MTA-1 em ambas as células de Ishikawa e células HEC-1 a 24 e 48 h, respectivamente, um efeito que foi revertida pela co-tratamento com 10

-8 M ICI182780 nas células de Ishikawa (superior), mas não as células HEC-1-B ((inferior) (* P . 0,05, ** P . 0,01)

no entanto , descobrimos que E

2 também reduziu os níveis de expressão de miR-30c em células ER-negativos HEC-1-B (Fig 5D). era expectável que a inibição da expressão de miR-30c por E

tratamento 2 foi não bloqueados pelo ICI182780 em células HEC-1-B (figura 5E). diferente de células de Ishikawa, E

2 apenas reduziu a expressão de pré-miR-30c mas não pri-miR-30C em células HEC-1-B (Fig 5C), sugerindo que E

2 deve inibir a maturação de miR-30c de forma independente-ER.

Além disso, E

2-regulada a expressão do MTA-1 ARNm tanto em células de Ishikawa e HEC-1-B, um efeito que foi revertida por ICI182780 em células de Ishikawa apenas com concentração seleccionada e o tempo (Figura 5F). Isto pode ser atribuído a, ou a redução de miR-30c induzida por tratamento com E

2 ou outra via de sinalização como de ainda não identificado.

Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que E

2 representa um factor regulador para a expressão de miR-30c, o qual funciona em ambas as maneiras dependente de ER e ER-independentes. No entanto, o mecanismo molecular subjacente preciso pelo qual E

2 regula a expressão de miR-30c requer estudos mais detalhados.

Discussão

A desregulamentação dos miRNAs em câncer pode promover a angiogênese, o crescimento vantagem, invasão de tecidos e metástases. No entanto, a nossa compreensão da expressão aberrante e potenciais papéis de miRNAs em câncer continua a ser limitado. MiR-30c, um membro da família de miR-30, foi mostrado para ser sub-regulada em CE em microarrays análises [16] e no cancro da mama [23] em comparação com tecidos normais, mas sobre-regulada no cancro do ovário, quando comparada com benigna ou tumores borderline de ovário [18] e em mesotelioma células [29]. MiR-30c também pode servir como um biomarcador potencial devido à sua desregulação em diferentes subtipos e fases de tumores malignos, incluindo o cancro da mama [21], do cancro do ovário [18] e mesotelioma [28], [29]. Além disso, o aumento da expressão de miR-30c correlaciona-se com prognóstico favorável e eficácia clínica da terapia com tamoxifeno em câncer de mama [22], bem como a sobrevivência livre de progressão mais em carcinoma renal de células claras [25], mas pior sobrevivência no mesotelioma maligno [29] e resistência quimioterapêutico no cancro do pulmão [24]. Notavelmente, em relação ao papel de miR-30c na resistência quimioterapêutico no cancro do ovário, Eitan et ai. e Sorrentino et ai. fizeram conclusões contrastantes [40], [41]. As conclusões controversas em matéria de miR-30c confirmar seu importante papel na tumorigénese e progressão, independentemente de sua precisão cancerígeno ou tumor supressora natureza.

Neste estudo, nós investigamos ainda mais o papel de miR-30c na CE. Descobrimos que o miR-30C foi regulada para baixo em amostras de CE em comparação com amostras de indivíduos normais, como indicado por análise de qRT-PCR, consistente com a análise de micro-arranjo anterior por Boren et al [16]. Infelizmente, não tivemos casos suficientes para valorizar a desregulação da expressão de miR-30c entre os diferentes subtipos e características clínico-patológicas. Nossos estudos futuros terão como objectivo elucidar esta questão. No entanto, descobrimos que a expressão de miR-30c foi maior em uma linha de células ER-negativo, o que implica que o miR-30c pode correlacionar com E

2 e ER, bem como com subtipos específicos de CE.

para estender nosso estudo anterior, nós absolutamente examinou a relação entre miR-30c e MTA-1. Anteriormente, foi realizado um ensaio de repórter de luciferase que demonstraram a 3′-UTR do MTA-1 alvo de miR-30c. Além disso, mostramos que a expressão excessiva do miR-30c diminuiu MTA-1 na expressão de ARNm e os níveis de proteína em ambas as células de Ishikawa e HEC-1-B [17]. Aqui, nós não apenas restaurada, mas também reduziu a expressão de miR-30c e avaliou as mudanças resultantes no MTA-1. Nós usamos células de Ishikawa só neste estudo, pois miR-30c funcionava o mesmo nas duas linhas de células em nosso estudo anterior. Os resultados deste estudo são consistentes com os de nosso estudo anterior, e nós também descobriram que Sir-MTA-1 e o inibidor de miR-30c trabalhou de modo antagônico. Como verificamos a repressão direta do MTA-1 por Sir-MTA-1, que foram capazes de deduzir uma relação funcional entre miR-30c e MTA-1. Notavelmente, também identificamos um feedback de circuito em que a repressão do MTA-1 aumentou os níveis de miR-30c, um efeito de feedback que também ocorreu com o miR-145 e seu gene alvo, OCT4 [42]. MiR-30c foi previamente relatado para desempenhar um papel na supressão de proliferação de células tumorais, metástases e resistência aos medicamentos por segmentação BCL9 [19], TWF1, vimentina [21] e KRAS [20]. Neste estudo, confirmamos que miR-30c-MTA-1 via de sinalização representa um mecanismo funcional pelo qual miR-30c suprime CE. No entanto, miRs geralmente trabalham na regulação de vários alvos e não podia dizer que não há outra via de sinalização trabalhando por miR-30c na CE.

Atualmente, a regulamentação dos miRNAs é um tema que tem atraído cada vez maior atenção. ONCONASE [43], ácido lisofosfatídico (LPA) [19], e o EGF e receptores MET [24] foram relatados para modular a expressão de miR-30c. Considerando a expressão diferencial de miR-30c entre as linhagens de células CE ER-positivos e ER-negativos usados ​​em nosso estudo e a relação entre a CE e E

2, optamos por analisar E

2 como um regulador candidato expressão de miR-30c.

na CE, miR-206 [44] e da família Let-7 de miRNAs [9] correlacionam com e

2 e ER, quer por segmentação ERa ou por estar sujeita à modulação por E

2. A modulação de miARNs por E

2-ER foi definitivamente demonstrado [45]. Yamagata et al [6] indicaram que ERa, não RpE, que inibiu a maturação de miARN, impedindo a pri-miARN-se de pré-conversão de miARN. Esta interacção ocorre a um nível pós-transcricional através da sua associação com Drosha e p68 /p72, que pode ser activado por E

2. No entanto, mesmo na ausência de E

2, uma associação física entre ERa e Drosha ainda ocorre, possivelmente representando a supressão de miR-30c nas células de Ishikawa em comparação com as células de HEC-1-B, que observou-se neste estude. Outro estudo recente sugeriu que ERa suprimida a expressão de miR-140 ao nível da transcrição por ligação a um elemento promotor específico (-79 /-50) de miR-140 [10]. Exceto para ERa, ERP [14] e Dicer [13] também foram relatados para ser relevante em termos de E

2 na regulação dos miRNAs. No entanto, todos estes resultados foram derivados a partir da mama células MCF-7. Assim, sugerimos que novos estudos sobre os mecanismos em células da CE são procurados.

Nosso estudo mostrou que E

2 regulada negativamente miR-30c e induziu seu gene alvo, MTA-1, em células da CE, uma regulamentação efeito que também foi exibido pela miR-140 e do seu gene alvo, SOX2, em células de cancro da mama [10]. A indução da MTA-1, E

2 em células da CE pode ser atribuído a uma diminuição no miR-30c ou à estimulação direta por E

2, sendo que ambos requerem mais estudos.

contraste, um estudo mostrou que miR-30c é up-regulada por E

2 no cancro da mama MCF-7cells ER-positivos [13], o que demonstra os diferentes mecanismos de modulação pelo qual E

2 regula miR-30c em células cancerígenas diferentes.