Abstract

Apesar do fato de que os novos regimes de tratamento têm melhorado a sobrevida global dos pacientes desafiados por câncer colorretal (CRC), o prognóstico da situação metastático é ainda restrito. A família Bcl-2 de proteínas tem sido identificado como alvo promissor fármaco anti cancro. Apesar de pequenas moléculas alvo proteínas Bcl-2 estão em ensaios clínicos, pouco se sabe sobre seus efeitos no CRC. O objetivo deste estudo foi investigar pré-clinicamente o valor de ABT-737 e Obatoclax como fármacos anti-cancerígenos para o tratamento CRC. Os efeitos dos BH3-miméticos ABT-737 e Obatoclax em células de CRC foram avaliadas usando os ensaios de viabilidade e de apoptose. migração de cicatrização de feridas e ensaios invasão câmara de Boyden foram aplicadas. culturas de células 3-dimensionais foram utilizadas para avaliação a longo prazo da proliferação e invasão. Concentrações clinicamente relevantes de pan-Bcl-2 inibidor Obatoclax não induziu a morte celular. Em contraste, a BH3-mimético ABT-737 induziu apoptose de um modo dependente da dose. Obatoclax causou uma linha celular específica abrandamento do crescimento das células de CRC. Além disso, Obatoclax, mas não ABT-737, recuperado expressão de E-caderina e levou a migração auditivos e invasão de células de CRC. A capacidade proliferativa e capacidade de invasão de células de CRC foi surpreendentemente inibida por dose baixa Obatoclax em culturas de células 3-dimensional de longa duração. Obatoclax, mas não ABT-737, causou uma paragem na fase G1 acompanhado por uma infra-regulação da ciclina D1 e supra-regulação de p27 e p21. A sobre-expressão de Mcl-1, Bcl-x

L ou Bcl-2 reverteu o efeito inibidor sobre a migração de Obatoclax mas não conseguiu restabelecer a capacidade proliferativa de células BF-tratados Obatoclax. Os dados apresentados indicam efeitos antitumorais amplas e multifacetadas do inibidor pan-Bcl-2 Obatoclax em células CRC. Em contraste com o ABT-737, Obatoclax inibiu a migração, proliferação e invasão em doses subletais. Em resumo, este estudo recomenda pan Bcl-2-inibição como uma abordagem promissora para ensaios clínicos em CRC

Citation:. Koehler BC, Scherr AL, Lorenz S, Elssner C, Kautz N, Welte S, et al . (2014) Pan-Bcl-2 Inhibitor Obatoclax Atrasos ciclo celular progressão e Blocos migração de células de cancro colorrectal. PLoS ONE 9 (9): e106571. doi: 10.1371 /journal.pone.0106571

editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Março, 2014; Aceito: 30 de julho de 2014; Publicação: 05 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Koehler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma Pós-Doutorado-Fellowship concedido a BCK pela Faculdade de Medicina da Universidade de Heidelberg, Alemanha (http: //www.medizinische-fakultaet- hd.uni-heidelberg.de), e concede ao HSB da Fundação alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorretal (CCR) representa a quarta causa comum de morte por câncer [1]. A incidência está a aumentar em todo o mundo e 40% de todos os pacientes têm metástases órgão distante no momento do primeiro diagnóstico. abordagens de terapia sistémica e cirurgia melhorou a sobrevida global, mas o prognóstico em UICC estágio IV ainda é pobre. A família de proteínas Bcl-2 compreende os reguladores-chave da apoptose agindo na superfície mitocondrial. membros anti-apoptóticos da família agem ligando seus parentes pró-apoptóticos, protegendo assim a célula da morte. As proteínas anti-apoptóticas Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L foram mostrados para ser regulada positivamente em várias entidades cancerosas sólidos e hematológicos incluindo CRC [2] – [4]. Essas observações levaram à investigação de vários compostos que atuem diretamente proteínas anti-apoptóticos Bcl-2. Assim chamados de BH3-miméticos actuam ligando-se a fenda de BH3 de proteínas anti-apoptóticas [5]. Esta interacção conduz à libertação de pró-apoptóticos Bcl-2 proteínas finalmente que promovem a morte celular. Os ensaios clínicos têm comprovado a segurança e eficácia de miméticos BH3 em várias malignidades hematológicas sólidos e alguns [6]. Apesar investigações clínicas, dados pré-clínicos válidos sobre a potência de miméticos BH3 como uma opção de tratamento para CRC são limitadas. Neste estudo, foi investigada a atividade antitumoral de Obatoclax e ABT-737 em células CRC. Ambos são pequenas moléculas inibidoras de proteínas Bcl-2 anti-apoptóticas. Eles diferem nos seus perfis de inibição, uma vez que ABT-737 não inibe Mcl-1, enquanto Obatoclax é um pan-Bcl-2 inibidor. O nosso estudo mostra que ABT-737 induz a morte celular em várias linhas celulares de CRC. Em contraste, a capacidade de induzir a morte celular Obatoclax é limitada e varia entre linhas celulares de CRC.

A capacidade para migrar e invadem tecidos estranhos é uma característica comum das células cancerosas que contribuem significativamente para a malignidade da doença. O nosso grupo demonstrou recentemente que a regulação baixa de Mcl-1, Bcl-x

L ou Bcl-2 conduz a uma deficiência marcante da migração e invasão das células CRC [7]. Aqui, nós investigamos a relevância dos BH3-miméticos Obatoclax e ABT-737 por essas características malignas. Em contraste com a ABT-737, doses subletais de migração bloco Obatoclax e invasão de células CRC de uma forma dependente da proteína Bcl-2.

Além disso, este estudo tem como objetivo avaliar a capacidade proliferativa das células CRC tratado com Obatoclax e ABT-737. Obatoclax dose baixa, mas não ABT-737, tem efeitos inibitórios impressionantes sobre a progressão do ciclo celular e proliferação. Aqui, descrevemos efeitos antiproliferativos de Obatoclax independentes de proteínas Bcl-2.

Em conclusão, nossos dados revelaram que pan-Bcl-2 inibidor Obatoclax exerce várias atividades antitumorais independentes de indução de morte celular, recomendando pan-Bcl 2 inibição para o desenvolvimento clínico em câncer colorretal.

Resultados

ABT-737, mas não Obatoclax mesilato induz a apoptose em células CRC

para avaliar a morte celular após o tratamento de células CRC com Obatoclax e ABT-737 durante 48 h, foi analisada a fragmentação de ADN por citometria de fluxo. ABT-737 causou a morte celular em todas as linhas celulares investigadas de uma forma dependente da dose. Foi observado o efeito mais marcante em células Colo205 (mais do que 90% de células apoptóticas após 48 horas de tratamento com 10 uM de ABT-737, Fig. 1A). Em contraste, o aumento das concentrações de Obatoclax apenas ligeiramente induzida morte celular em células SW480, Colo205 e Caco2

(A e B) análise de citometria de fluxo para o DNA-fragmentação como um indicador para a morte apoptótica em quatro linhas celulares de CRC.; 48 h de tratamento com ABT-737 ou Obatoclax. (C) Ensaio de MTT de células HT29 após 72 h de Obatoclax e ABT-737 de tratamento. (p-valores: Oba 0,25? M: 0,003; Oba 0,05? M: 0,004; ABT-737 5? M: 0,589) (D) Western blot Representante para PARP clivada após 24 h de tratamento Obatoclax. Tubulin serviu como controle de carga. 2 uM tratamento com estaurosporina durante 24 h serviu como um controlo positivo para a indução da morte celular. Os ensaios foram realizados em triplicado. As barras representam SD ± média. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. Oba = Obatoclax, STS = estaurosporina.

HT29 células não mostraram nenhuma fragmentação do DNA apoptose (Fig. 1B).

Verificou-se ainda mais nossos resultados por transferência de Western para PARP clivada. Em linha com os dados de citometria de fluxo, não havia PARP clivada detectável em todas as linhas celulares de CRC como exemplarmente mostrados para HT29 e SW480 na Fig. 1D.

A fim de investigar os efeitos sobre a proliferação de Obatoclax, seguimos o crescimento celular de células HT29 ao longo do tempo (72 h). O crescimento celular foi inibido, mesmo em dose baixa Obatoclax, enquanto que as células não tratadas e tratadas ABT-737 continuou a proliferar. Este resultado indica um forte efeito de Obatoclax na capacidade proliferativa (Fig 1C).

Em seguida, teve como objetivo avaliar a potência de Obatoclax ao lado de agentes quimioterápicos aprovados para o tratamento CRC. Observou-se que a citotoxicidade de oxaliplatina foi aumentada quando combinado com Obatoclax. Efeitos são mostradas durante um período de tratamento de 48 h em cultura celular convencional e ainda validado por um período de tratamento de 7 dias em cultura de células 3D (Fig. S3). Nem Obatoclax nem Oxaliplatina isoladamente foram capazes de induzir a morte celular em células SW480 (percentagem de células positivas de PARP clivada: 1,3% [não tratada], 1.7 [iM 0,25 Obatoclax] e 1,6% [20 pM de oxaliplatina]). Em contraste impressionante, 22,7% de células sofreram apoptose como indicado por tingimento de PARP clivada quando Obatoclax e Oxaliplatina foram combinadas (Fig. S3C). Mais importante, não houve efeito sensibilizante para a combinação de Obatoclax com 5-FU (dados não mostrados). Tomadas em conjunto, as nossas observações indicam uma indução de morte celular, dependente da dose por ABT-737 e um efeito dependente da dose e tipo de célula em proliferação de Obatoclax. A combinação de inibidores da Bcl-2 com quimioterapia, e.g. oxaliplatina, deve ser analisada como uma abordagem potencial tratamento em estudos futuros.

Obatoclax recupera E-caderina nas células CRC, mas deixa antiapoptóticas Bcl-2 níveis de proteína inalterada

Temos demonstrado recentemente que siRNA regulação negativa mediada de proteínas Bcl-2 anti-apoptóticos prejudica a migração e a invasão de células de CRC [7]. E-caderina é uma proteína ligada à membrana, principalmente com uma função chave para junções de adesão e Wnt-sinalização. Tem sido mostrado para ser perdido durante a transformação maligna [8]. Impressionantemente, encontramos uma recuperação importante da E-caderina em todas as linhas de células, exceto para SW480 células, após o tratamento Obatoclax (Fig. 2A). De nota, N-caderina, que foi reportado como um promotor da migração, não foi detectável nas quatro linhas celulares investigadas (dados não mostrados) [9].

(A) transferência de Western para E-caderina em quatro linhas celulares de CRC após 24 h de tratamento com Obatoclax em doses crescentes (esquerda). Correspondendo a análise densitométrica em relação aos controlos não tratados e ajustado à tubulina como controlo de carga. (B) Western Blot de Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-x

L em células HT29 (esquerda) e células SW480 (à direita) após 24 h de tratamento com Obatoclax. Tubulina serviu como um controlo de carga. Western blot são representativos de pelo menos três manchas de experimentos independentes.

Outros relataram que antiapoptóticas proteínas Bcl-2, por exemplo, Mcl-1, foram rápida e completamente degradado em células cancerosas tratadas com Obatoclax [10]. Em nítido contraste, os nossos dados mostram nenhuma diminuição de Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L níveis. Muito ao contrário, imunotransferência de proteínas de células inteiras revelaram um aumento do nível de Bcl-x

L, e um ligeiro aumento dos níveis de Bcl-2 em células HT29 para todas as concentrações Obatoclax aplicada (Fig. 2B, esquerda). Em células SW480, a Bcl-2 e Bcl-x

L níveis aumentada sob baixa dosagem Obatoclax, mas apresentaram níveis semelhantes às células não tratadas na presença de doses mais altas Obatoclax (Fig. 2B, direita). níveis de Mcl-1 apresentaram um aumento mais proeminente em tratamento Obatoclax comparação com Bcl-2 e Bcl-x

L em células HT29 (Fig. 2B, esquerda). Não há mudanças notáveis ​​em MCL-1 níveis foram detectados por SW480 células (Fig. 2B, à direita).

Baixa dose de Obatoclax notavelmente prejudica a migração e invasão de células CRC

A fim de investigar a impacto de Obatoclax em células de CRC, realizamos ensaios de migração de cura de feridas. Mesmo doses subletais foram capazes de prejudicar maciçamente capacidade migratória das células HT29 ao longo do tempo. Após 48 h, a anulação do diferencial medida foi de 650 uM em células de controlo em comparação com 263 uM em Obatoclax células tratadas (Figura 3A e B, p. 0,001). Além disso, as células Caco2 migrou significativamente menos sob tratamento com 0,25 uM Obatoclax. fechamento do gap foi 901 vs. 744 mm (Fig 3C, p . 0,05). De nota, ABT-737 não conseguiu inibir a migração, mesmo numa dose de 5? M, como mostrado na Fig. S1.

(A) imagens representativas de feridas ensaios de cura de raspadinhas de veículo (superior) e Obatoclax células HT29 tratados (mais baixos). Barra de escala aplicar para todas as imagens. (B) Encerramento Gap de células HT29 após 48 horas de tratamento com Obatoclax. fechamento (C) Gap de células Caco2 tratados 48 h com Obatoclax. Os ensaios foram realizados em triplicado. As barras representam SD ± média. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05, *** p 0,001. Oba = Obatoclax.

sistemas de cultura celular tridimensional melhor refletir o crescimento fisiológico celular, bem como a morfologia e as interações célula-célula de acolhimento [11]. Além disso, um sistema tridimensional levanta a possibilidade de proceder a experiências de cultura de células de longo prazo, incluindo a exposição ao fármaco obter mais informação do que a cultura celular convencional. Assim, foram utilizados andaimes polistirol durante 7 dias de tratamento seguido por Obatoclax avaliação de invasão, proliferação e apoptose. células HT29 não mostraram indução de apoptose após tratamento com Obatoclax (Fig. 1B e D). Surpreendentemente, não houve um bloqueio massivo de invasão em cultura de células a longo termo 3D (Fig. 4A e B). Além disso, Colo205 mostrou uma migração auditivos profundamente em cultura de células de longo prazo, tal como indicado por uma diminuição da profundidade de invasão (Fig. S2). Sem indução de apoptose, mas uma diminuição da proliferação, tal como indicado por uma redução de positividade Ki67, foi observada (Fig. S2). Esta observação acentua ainda mais a eficácia antitumoral amplo de Obatoclax no que diz respeito a um inibidor da migração de fenótipo combinado com um efeito antiproliferativo, independente da indução da morte celular.

(A) Imagens representativas de células HT29 em andaimes após 7 dias de tratamento com Obatoclax (hematoxilina-eosina. barra de escala aplica-se para ambos os quadros) (B) correspondente análise da profundidade de invasão em andaimes. Os ensaios foram realizados em triplicado. As barras representam SD ± média. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. *** P 0,001. Oba = Obatoclax.

Em seguida, investigou-se a capacidade de invasão das células SW480 tratados com dose baixa Obatoclax em matrigel contendo ensaio de câmara de Boyden. A fim de provar a fixação adequada de células em Obatoclax contendo meio, as células foram previamente semeadas em placas de poliestireno, seguida por ensaio MTT após 24 h. Não houve ligação deficiente observada na presença de Obatoclax (dados não mostrados). Invasão foi surpreendentemente inibida em células tratadas com 0,25? M Obatoclax (293 invadiram as células de controlo versus 89 invadiram as células tratadas Obatoclax, p . 0,001, Fig 5) e foi ainda abolida em células tratadas com 0,5 uM Obatoclax (293 invadiram as células de controlo vs. 59 invadiram células tratadas Obatoclax, p .. 0.001, Fig 5)

células SW480 foram semeadas na câmara superior de um Transwell. 48 h após a sementeira, os núcleos na superfície inferior foram visualizadas por coloração de Hoechst. (A) imagens representativas da superfície de inserção inferior após coloração Hoechst (barra de escala indicam ampliação para todos os painéis). (B) Cinco campos de visão por pastilha foram contados. N = 5 por grupo. Os valores são expressos como média ± DP. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. *** P 0,001. Oba = Obatoclax, ctrl = controle.

A superexpressão de proteínas Bcl-2 antiapoptóticas restaura migração de Obatoclax trataram células CRC

Em seguida, teve como objetivo explorar o compromisso de anti-apoptótica Bcl-2 proteínas para o fenótipo de inibição de migração causada por Obatoclax. Encontramos uma recuperação impressionante de migração em células HT29 tratados com 0,25 mM Obatoclax mas que sobre-expressam proteínas anti-apoptóticos Bcl-2. Este efeito foi observado o fenótipo revertendo para Mcl-1 (p 0,05), Bcl-x

L (p 0,001) e Bcl-2 (P 0,001), com o efeito mais pronunciado para Bcl-2 (Fig. 6A-D). Superexpressão de proteínas anti-apoptóticos constantemente bloqueou a inibição da migração sob tratamento Obatoclax mais de 72 h. É de grande importância, neste contexto, para assegurar que um restabelecimento da migração não é característica secundária de uma proliferação aumentada devido a uma sobre-expressão de Bcl-2 proteínas anti-apoptóticas. Por isso, foi investigada a proliferação em células que sobre-expressam Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L. Foi observado nenhum efeito sobre a proliferação de qualquer das proteínas investigados como mostrado em pormenor na Fig. S4. (A-D).

(A-D) Encerramento Gap da cicatrização de feridas ensaios de migração de células HT29 tratados com Obatoclax. (A) Vetor e Mcl-1 transfectadas (B) vector e a Bcl-xL de células transfectadas e (D) e vector Bcl-2 de células transfectadas. (C) imagens representativas de cicatrização de feridas de vector e Mcl-1 transfectadas tratadas com Obatoclax. Os valores são expressos como média ± DP. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. *** P 0,001. Vec = vetor.

Baixa dose de Obatoclax inibe a proliferação via G1-Phase efetuará a prisão acompanhada por uma regulação positiva de p27 e p21, bem como infra-regulação da ciclina D1

Uma vez que as células CRC em andaimes 3D mostrou uma diminuição da proliferação em tratamento a longo prazo com Obatoclax, decidimos para dissecar ainda mais regulação do ciclo celular. Coloração para teor de ADN sob tratamento Obatoclax revelou uma grande mudança a partir da G2- no G1-fase do ciclo celular que é indicativo da paragem na fase G1 ou uma transição de fase G1 interrompido. A percentagem de células na fase G2 diminuiu de 37% em células de controlo para 13% nas células HT29 tratados com 0,25 uM Obatoclax (Figura 7A e B, p. 0,001).

(A) de fluxo representativas cytomeric análise para o conteúdo em ADN em células HT29 tratados com 0,25 uM Obatoclax. 2n = células diplóides do G1 fase, 4N = células tetraplóides em G2-fase. (B) A análise gráfica da distribuição de fases do ciclo celular que corresponde a (A). Os valores são expressos como média ± DP. *** P 0,001. (C) Rel. níveis de mRNA de ciclina D1, p21 e p27 em 2 células HT29 e Caco após 24 horas de tratamento com Obatoclax. Os níveis de ARNm foram quantificados por qRT-PCR e normalizadas para GAPDH como gene de manutenção. Os ensaios são representativos de pelo menos três experiências independentes. (D) Western blots representativos para ciclina D1, p21, e p27 em células HT29 e Caco2 tratados com Obatoclax durante 24 h. Tubulina serviu como um controlo de carga. Oba = Obatoclax, ctrl = controle.

Além disso, teve como objetivo quantificar as proteínas reguladoras do ciclo celular central sob tratamento Obatoclax. Ciclina D1 (CD1) representa a chave ciclina para a transição G1-Phase [12]. CD1 foi marcadamente reprimidos em tratamento Obatoclax em ambos o nível de proteína em HT29 (0,5 mudança vezes) e ARNm e células Caco2 (mais do que 0,5 vezes de alteração, Fig. 7C e D). P27 é um inibidor da quinase dependente de ciclina (CDKI) e a sua regulação positiva indica paragem do ciclo celular [13]. Foi observada uma regulação positiva da p27 em ARNm e os níveis de proteína em células HT29 e Caco2 tratados com Obatoclax (Fig. 7C e D). Além disso, observou-se um aumento dependente de dose e notável de ciclina p21 inibidor da quinase dependente de ARNm e os níveis de proteína em células HT29 e Caco2 (Fig. 7C e D). Tomados em conjunto, estes dados são indicativos de uma regulação do ciclo celular por Obatoclax via proteínas reguladoras chave da transição do ciclo celular, tais como ciclina D1, p27 e p21.

Discussão

membros Anitapoptotic do Bcl família de proteínas -2 são frequentemente sobre-expresso em cancros humanos, incluindo [3] CRC. Os níveis elevados de proteínas anti-apoptóticas têm sido mostrados para contribuir para a resposta terapêutica pobre e para promover a progressão do tumor. Por exemplo, Bcl-x

L expressão se correlaciona com metástases em linfonodos, pobre diferenciação e maior etapa de Duke, na CRC [14]. padrões de expressão de Mcl-1 são preditivos de resposta terapêutica em doentes diagnosticados com CRC metástase [15]. Por isso, grandes esforços têm sido feitos a fim de orientar antiapoptóticas proteínas Bcl-2 com o objetivo de indução da morte de células de câncer [16]. Importante, mais profundas percepções mecanicistas e estruturais conduziu ao desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas de proteínas Bcl-2 anti-apoptóticas. Esta classe de moléculas pequenas actua ligando-se ao hidrofóbico BH3-fissura de anti-apoptóticos Bcl-2 proteínas imitando assim proteínas pró-apoptóticos Bcl-2 e promover a morte de células [17]. De segurança e determinação da dose ensaios com Obatoclax foram realizados em tumores sólidos e linfomas [18], [19]. Apesar do facto de BH3-miméticos já entraram primeiros ensaios clínicos, poucos se sabe sobre os efeitos da inibição da proteína Bcl-2 para além da regulação da morte celular [18], [19]. Mostrámos recentemente que um knockdown de Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

G notavelmente inibe a invasividade de células de CRC. Neste estudo anterior, um knockdown de uma única proteína Bcl-2 (Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L) foi suficiente para bloquear a migração e invasão [7].

Baseado em estes relatórios anteriores, nosso estudo teve como objetivo investigar o potencial de Bcl-2 inibir pequenas moléculas como candidatos a fármacos para o tratamento CRC

in vitro

. Em primeiro lugar, que comparou a eficácia de Bcl-2 e Bcl-x

inibidor G ABT-737, com a pan-Bcl-2 inibidor Obatoclax. Uma comparação directa dos dois inibidores permite que os efeitos distintivos de um amplo pan-Bcl-2 por inibição Obatoclax de um modo mais específico, utilizando ABT-737. Apesar do facto de que ambos os inibidores mostrou uma toxicidade significativa em ensaios clínicos, estes compostos podem ser utilizados como ferramentas para o pré-clínico

In vitro

-Teste Bcl-2 de inibição [19] – [22]. ABT-737 foi mostrada para sinergizar com oxaliplatina e celecoxib na morte de células de CRC [23], [24]. Observamos indução de apoptose dependente da dose causada por ABT-737 em todas as linhas celulares investigadas. Está bem documentado que uma resistência à ABT-737 podem ser accionados por níveis elevados de Mcl-1 por inibição da noxa proapoptótica [25]. Muito recentemente, foi demonstrado que as células cancerosas em condições de hipóxia são resensitized para ABT-737 por uma perda de Mcl-1 [26]. Desde efeitos da ABT-737 são claramente pró-apoptótica e determinantes para a sensibilidade no CRC estão bem documentados, decidimos focar ainda mais em efeitos antitumorais de Obatoclax.

Em nítido contraste com ABT-737, Obatoclax não levar a significativa indução de morte celular em células de CRC. Em nosso estudo, doses Obatoclax aplicadas foram clinicamente relevantes, como indicado em ensaios de fase I, e não atingiu o Composto IC

50 relatados para Obatoclax [19], [27] Curiosamente, o tratamento Obatoclax resultou em níveis de expressão estáveis ​​ou crescentes de todas as proteínas Bcl-2 anti-apoptóticos investigada. Outro estudo demonstrou a regulação negativa das proteínas Bcl-2 anti-apoptóticos em tratamento Obatoclax em células de linfoma [10]. Uma vez que este estudo demonstra a apoptose de células de linfoma causadas por Obatoclax, diminuição dos níveis de proteínas anti-apoptóticos pode ser secundária no decurso de morte celular, em vez de um efeito desencadeado pela ligação directa de Obatoclax.

knockdown ou sobre-expressão de Mcl-1 , Bcl-2 ou Bcl-x

L não atrasar a progressão do ciclo celular e a proliferação de células de CRC [7]. Por outro lado, a baixa dose de tratamento Obatoclax causou a proliferação de atraso em nosso estudo. Descobrimos uma paragem na fase G1 acompanhada por perda de expressão de ciclina D1 e regulação positiva de p21 e p27. A ciclina D1 (CD1), é a fase G1 Ciclina mais proeminente e foi classificado como um controlador oncogénica em células de cancro. expressão CD1 está associada com a transformação neoplásica e aumento da malignidade do câncer [12]. A transição /S-fase G1 é fortemente regulada por CDKIs, tais como p21 e p27 através de inactivação de quinases dependentes de ciclina G1 de ciclina (CDK) complexos de [13], [28]. Tomados em conjunto, os nossos dados revelam uma propriedade reguladoras do ciclo celular novela de Obatoclax via paragem na fase G1. Este efeito não foi antagonizado por sobre-expressão de Bcl-2 proteínas anti-apoptóticas. Além disso, nem a sobre-expressão de anti-apoptóticos Bcl-2 nem proteínas ABT-737 a progressão do ciclo da célula afectada. Retardar do ciclo celular e comprometendo o crescimento descontrolado de células de CRC é, aparentemente, um efeito independente da proteína Bcl-2 de Obatoclax. Mesmo se os mecanismos exactos subjacentes e as metas relevantes permanecem ainda desconhecidos, pode ser possível que a sinalização mTOR desempenha um papel neste contexto. A actividade de ligação de Obatoclax de mTOR, bem como uma inibição de fase tardia autofagia foram recentemente relatados e podem desempenhar um papel causal para os efeitos antiproliferativos descritos [29], [30]. Outras análises moleculares decentes são garantidos para dissecar Obatoclax impacto relevante na regulação do ciclo celular. Por exemplo, CDKs podem ser investigados como possíveis alvos de Obatoclax em estudos futuros.

quimioterápicos convencionais são mais eficazes em replicar as células cancerosas. Mesmo que demonstram claramente que Obatoclax reduz as propriedades proliferativas de células de CRC, os nossos dados comprova Obatoclax capacidade para ultrapassar a resistência no sentido de oxaliplatina morte celular em células SW480. O potencial terapêutico da combinação de regimes de quimioterapia baseados em platina com Obatoclax, a fim de superar a resistência a apoptose já foi relatada e é ainda mais realçada pelos nossos dados [31], [32]. Em células de carcinoma esofágico, Obatoclax tinham actividades sinérgicas juntamente com 5-FU [32]. Em nosso estudo, os efeitos sinérgicos de Obatoclax eram restritos a oxaliplatina apontando em um efeito dependente tipo de célula cancerosa. fortes efeitos de Obatoclax sobre autofagia ter sido demonstrada em vários estudos recentes [32] – [34]. No entanto, a relevância da sinalização autofagia induzida Obatoclax permanece indefinida para CRC

Migração e invasão são pré-requisitos de disseminação de células cancerosas, levando a invasão local e metástases órgão distante [35] – [37].. O nosso grupo demonstrou recentemente funções de regulação de proteínas Bcl-2 antiapoptóticas sobre migração e invasão das células CRC independentes de morte celular e proliferação [7]. À luz do facto de que Obatoclax não seria suficiente para induzir a morte de células de CRC, que investigou a migração e a invasão de células de CRC sob tratamento Obatoclax. Surpreendentemente, uma dose baixa de Obatoclax bloqueada migração e invasão em todas as linhas celulares investigadas. Longo prazo de cultura celular 3D de células CRC sob tratamento Obatoclax confirmou este bloqueio da migração apesar da falta de indução de morte celular. Mais importante, a migração foi bloqueada por Obatoclax em linhas de células resistentes, como Colo205 e CaCo2. Caderinas são importantes reguladores de fixação das células e estão envolvidos em grandes redes de sinalização, como Wnt. Tem sido demonstrado que um nocaute específica intestinal condicional de E-caderina causou aumento da migração e proliferação no intestino [38]. Por outro lado, a expressão de E-caderina diminuiu migração e proliferação nas criptas intestinais [39]. Em carcinogênese colorretal, a eliminação funcional do E-Caderinas representa um passo fundamental na aquisição de capacidade de invasão [40]. Nós, portanto, teve como objetivo investigar as alterações na expressão da caderina-E. Nós demonstramos uma profunda restauração da E-caderina nas células CRC sob tratamento com Obatoclax. No entanto, a E-caderina regulação positiva pode representar o interruptor molecular de volta para um fenótipo menos invasiva de células de CRC causadas por Obatoclax.

Importante, e em contraste com a função de inibidor do crescimento de Obatoclax, a migração foi completamente restaurado em células de CRC superexpressando Mcl-1, Bcl-2 ou Bcl-x

L. No contexto da capacidade de invasão, anti-apoptóticos Bcl-2 proteínas aparecem como os principais alvos atingidos. Isto está de acordo com nosso relatório anterior, mostrando uma função reguladora de antiapoptóticas proteínas Bcl-2 na capacidade de invasão das células CRC sem afetar a proliferação ou induzir a morte celular [7]. Outros estudos suportam a hipótese de que proteínas Bcl-2 são relevantes para a metástase [41] – [43]. Por outro lado, ABT-737 tratamento não é suficiente para bloquear a migração e a invasão de células de CRC. No nosso estudo, mostramos que Obatoclax é capaz de inibir ambas, a migração e a invasão, mesmo em doses muito baixas. Este efeito de Obatoclax é novo e consideravelmente, mesmo em células resistentes principalmente. Desde ABT-737 não inibe a migração, propomos um recurso de agente específica e única de Obatoclax dentro do grupo de compostos alvo proteínas Bcl-2.

Conclusão

Com base nos dados da nossa estudo, conclui-se que o inibidor da pan-Bcl-2 Obatoclax neutraliza vários processos biológicos relevantes para a progressão do tumor. A eficácia de Obatoclax em células de CRC é amplo e inclui uma morte celular independente mas a proteína Bcl-2 viciado inibição da migração. O segundo efeito principal afecta a progressão do ciclo celular e é independente da proteína Bcl-2 de segmentação. Assim, a Bcl-2 pan-inibição, incluindo o desenvolvimento de inibidores específicos e menos tóxicos, é uma abordagem promissora para o tratamento de CRC e deve ainda ser analisado, por exemplo, em combinação com quimioterapia.

Material e Métodos

Reagentes e linhas celulares

linhas celulares de CRC HT29, SW480, CaCo2 e Colo205 foram adquiridos da ATCC. As células foram cultivadas numa atmosfera humidificada (37 ° C, 5% de CO

2) em meio RPMI + Glutamax (Gibco, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com FCS a 10% (PAA Laboratories, Cölbe, Alemanha), 1% de Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% de HEPES (Gibco) e aminoácidos não essenciais a 1% (NEAA, Gibco). Obatoclax e ABT-737 foram adquiridos a Selleckchem (Munique, Alemanha), Oxaliplatina a partir de Sigma-Aldrich (Munique, Alemanha).

A viabilidade e crescimento das células de teste

As células foram semeadas em placas de 12 poços e 24 h após a sementeira ou transfectadas tratadas como indicado. O crescimento celular foi determinada utilizando um ensaio colorimétrico de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito [7].

quantitativo PCR quantitativo em tempo real (Q-RT PCR)

Isolamento de ARN total e a síntese de ADNc foi efectuada tal como previamente descrito [44]. Q-RT PCR foi realizada utilizando kits de ensaio iniciador (Qiagen, Hilden, Alemanha). A aquisição de dados e a determinação da expressão de genes foi realizada utilizando o pacote de software do LightCycler (Roche, Mannheim, Alemanha). Cada reação de PCR foi executado em duplicatas. a expressão de ARNm foi normalizado para a expressão do gene GAPDH de limpeza.

A detecção de apoptose e distribuição de fases do ciclo celular

De um dia após a transfecção, as células foram tratadas como indicado, durante 48 h. O sobrenadante foi transferido para tubos de FACS e as células foram então suavemente individual utilizando Accutase. Após centrifugação, as células foram ressuspensas num tampão hipotónico contendo 0,1% (w /v) de citrato de sódio, 0,1% (v /v) de Triton X-100 e 50 ug /ml de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich). Após 1 h de incubação a 4 ° C, o teor de ADN total de células foi medido de acordo com o protocolo de Nicoletti

et ai.

Utilizando citometria de fluxo [45]. análise do ciclo celular foi realizada utilizando FACS diva 6 (Becton Dickinson) e FlowJo 7.6.5. (Árvore Star Inc.). As células que representam a fracção sub-G1 foram descritos como apoptótica.

A lise celular, SDS-PAGE, Western blotting e densitometria

As células foram semeadas em placas de 6 poços, cultivadas durante 24 h e tratados como indicado. A lise celular, SDS-PAGE e Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente [46].