Abstract
Fundo
FoxM1 tem sido relatada a ser importante na iniciação e progressão de vários tumores. No entanto, se FoxM1 tem qualquer indicação para o prognóstico em pacientes com câncer de pulmão não pequenas células permanece obscuro.
Metodologia /Principais Achados
Neste estudo, a expressão FoxM1 em células tumorais foi examinado pela primeira vez pela imuno-histoquímica em 175 amostras de NSCLC, cujo resultado mostrou que FoxM1 superexpressão foi significativamente associada com o estado positivo de fumar (P = 0,001), mais pobre diferenciação de tecidos (P = 0,0052), maior estádio TNM (P 0,0001), metástases em linfonodos (P 0,0001), estágio do tumor avançado (P 0,0001), e pior prognóstico (P 0,0001). A análise multivariada mostrou que a expressão FoxM1 aumentou o risco de morte (hazard ratio, 1,899; 95% CI, 1,016-3,551). Além disso, por vários
in vitro Comprar e
in vivo
experimentos, mostramos que knockdown alvejado de expressão FoxM1 poderia inibir as habilidades migratórias e invasivos de células NSCLC, enquanto que a expressão forçada de FoxM1 poderia aumentou a invasão e migração de células NSCLC. Finalmente, descobrimos que um dos mecanismos celulares pelos quais FoxM1 promove metástase de tumor é através da indução de programa epitelial-mesenquimal de transição (EMT).
Conclusões
Estes resultados sugerem que FoxM1 superexpressão em tecidos tumorais é significativamente associada com o mau prognóstico dos pacientes com NSCLC através da promoção de metástase de tumor
Citation:. Xu N, Jia D, Chen W, Wang H, Liu F, Ge H, et al. (2013) FoxM1 está associado a um mau prognóstico de não-pequenas células do pulmão pacientes com câncer através da promoção de metástase tumoral. PLoS ONE 8 (3): e59412. doi: 10.1371 /journal.pone.0059412
Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América
Recebido: 18 Agosto, 2012; Aceito: 14 de fevereiro de 2013; Publicação: 25 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Shanghai Leading projeto disciplina acadêmica, número do projeto B115 e projeto de China National “985” (fase III). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pulmão permanece a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo por vários anos. O mau prognóstico de câncer de pulmão devido principalmente a pequenos sintomas na fase inicial e, quando diagnosticada, as células tumorais sempre metástase para outros órgãos [1]. Epitelial-mesenquimal transição (EMT) é substancial na metástase de células tumorais e caracterizado pela dissolução de junções intercelulares através da internalização e a sub-regulação de diversas proteínas presentes nas junções apertadas, tais como zonula occludens (ZO) -1, e adherens junções, tal como e-caderina [2], [3].
caixa de forkhead M1 (FoxM1), um membro da família de factores de transcrição de Fox, tem sido demonstrado ser essencial para a progressão do ciclo celular e é uma importante regulador do ciclo celular controlar a transição da fase G1 para a fase S, bem como a entrada e a conclusão da mitose [4],. Tem sido relatado para ser sobre-expresso numa variedade de tumores, incluindo cancros do pulmão, do fígado e da mama [8], [9], [10], [11], [12], [13], e desempenhou um essencial papel no desenvolvimento e progressão de várias doenças malignas [11], [14], [15], [16]. Recentemente, FoxM1 foi relatado de conduzir a fibrose hepática e metástases no carcinoma hepatocelular [17], e tem sido bem documentado que a via de sinalização de hedgehog foi activado no CPNPC, e várias moléculas envolvidas nesta via, incluindo PTCH1, SMO, GLI1, foram observados para correlacionar com vários parâmetros prognósticos do CPNPC. Notavelmente, estas moléculas também foram observados para correlacionar com a expressão aumentada de FoxM1 [18]. No entanto, se FoxM1 poderia exercer um efeito directo sobre o prognóstico de pacientes NSCLCs continua por ser elucidado. Yang e seus colegas relataram recentemente que FoxM1 superexpressão correlacionados com os pobres sobrevivência de pacientes em uso de imuno-histoquímica análise de 69 casos de espécimes de carcinoma espinocelular [19]. No entanto, não foi determinada a função de prognóstico da expressão FoxM1 em outros tipos de CPNPC. Liu et al. descobriu que o status expressão de FoxM1 em NSCLC é um fator prognóstico independente e negativamente correlacionada com o prognóstico., mas o seu estudo não encontrou nenhuma relação entre a expressão FoxM1 e outros parâmetros clínicos críticos [20]. Entretanto, todos os estudos acima não demonstram os mecanismos subjacentes potenciais. Em nosso estudo anterior, mostramos que FoxM1 promovido
in vitro
capacidade metastática do câncer de pulmão de pequenas células [21]. No estudo atual, pretendemos determinar as funções de prognóstico de FoxM1 superexpressão em CPNPC e explorar ainda mais o mecanismo pelo qual FoxM1 poderia contribuir para a metástase de CPNPC.
Resultados
características do paciente e Relacionamentos entre FoxM1 Expressão e características clínico-patológicas
as características clinicopatológicas dos pacientes estão resumidos na Tabela S1. As durações globais de acompanhamento variou de 1 a 84 meses (mediana, 42 meses). Para investigar se a expressão aumentada de FoxM1 foi associada a vários factores de prognóstico, os pacientes foram classificados em dois grupos em termos de coloração imuno-histoquímica para FoxM1 (Figura 1A, a-d): expressão negativa /fraca e forte expressão. Como mostrado na Tabela S2, os pacientes com metástases do linfonodo (Figura 1A, e) tinha uma expressão significativamente mais elevada de FoxM1 em comparação com os pacientes sem metástase ganglionar (Figura 1A, f) (p 0,0001). Enquanto isso, a expressão FoxM1 mais forte foi correlacionada com o estado positivo de fumar (P = 0,001), a diferenciação mais pobres (P = 0,0209), estágio do tumor avançado (P 0,0001) e estágios TNM mais elevados (P 0,0001), ao passo que não foi observada nenhuma diferença substancial na idade do paciente, sexo e histologia no momento do diagnóstico entre altos e baixos níveis de FoxM1
(a) os resultados representativos de coloração FoxM1 em tecidos tumorais NSCLC analisados por imuno-histoquímica (a, negativo;. b, fraco; c, moderada; d, intenso, respectivamente). Os resultados representativos dos níveis de expressão entre FOXM1 linfonodo positivo (e) e negativo nó de linfa (f) (A-F, esquerda, Ampliação: × 100, para a direita, a ampliação: 400x). analisa (B) A sobrevivência global para todos os pacientes (um), pacientes com a fase I /II (b), e doentes com estádio III /IV (c), de acordo com os resultados da análise imuno-histoquímica. O teste de log-rank foi usado para testar as duas distribuições de sobrevivência. P 0,05 foi considerado para significância estatística
FoxM1 Expressão positivamente correlacionada com a progressão do tumor and Poor Survival of células não pequenas do pulmão pacientes com câncer
Em primeiro lugar, foi utilizada a análise de sobrevida global. para examinar a correlação entre a expressão FoxM1 e prognóstico. O prognóstico desses doentes com uma expressão forte de tumor FoxM1 foi significativamente mais pobre do que a de pacientes com um tumor negativo expressão FoxM1 ou fraco (p 0,0001) (Figura 1B, a). Em análises posteriores, expressão FoxM1 foi associado com pior sobrevida para pacientes com estágio I /câncer II (P = 0,049) (Figura 1B, b) e para pacientes com estágio III /IV câncer (P = 0,095) (Figura 1B, c) , embora o resultado de fase III /IV não atingiu o significado. A análise univariada mostrou que o estágio do tumor (P 0,0001), status do nó de linfa (P 0,0001), estágio TNM (P 0,0001) e expressão FoxM1 (P 0,0001), cada previu um prognóstico significativamente pior em pacientes com NSCLC (Tabela 1 ). O prognóstico clínico foi, no entanto, não associada com a idade, sexo, tabagismo, histologia e diferenciação.
Além disso, foi aplicado um modelo de riscos proporcionais de Cox para estimar o efeito da expressão FoxM1 na sobrevivência. A taxa de risco bruto (HR) de forte expressão FoxM1 em comparação com a expressão FoxM1 negativo ou fraco era 1.899 (95% CI, 1,016-3,551, P 0,05), o que indica que a forte estatuto FoxM1 aumentou o risco de cancro do pulmão morte relacionada quase duas vezes maior do que o status FoxM1 negativo ou fraca. Com a análise multivariada, expressão FoxM1, metástases linfonodais e idade foram significativamente associados com a sobrevivência (Tabela 2). Estes achados sugerem que FoxM1 parece ser um preditor independente e significativo da sobrevivência mais pobre.
Knockdown alvejado de FoxM1 Expressão inibido
in vitro
metastáticos Potenciais de células NSCLC
os resultados acima revelaram que a alta expressão FoxM1 foi associada com mau prognóstico dos pacientes com NSCLC, mas os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. No nosso estudo anterior, nós demonstramos que FoxM1 poderia mediar a proliferação de linhas de células de SCLC, que podem ser associadas com o estádio do tumor avançado [21]. Mas os papéis de expressão FoxM1 na migração de células NSCLC e invasão são em grande parte desconhecida. Assim, para descobrir se FoxM1 medeia prognóstico no câncer de pulmão através da promoção de metástases, foi aplicado transdução-LENTIVIRUS para derrubar a expressão FoxM1 sobre a capacidade migratória e invasiva de H1299 e células PC-9 (Figura 2A e B). Os resultados sugerem que a interrupção da expressão FoxM1 pode inibir significativamente a capacidade migratórias e invasivos de células NSCLC por ensaio de migração trans-poço (Figura 2C e D). Além disso, também descobrimos que em diferentes duas linhas celulares, knockdown de expressão FoxM1 pode inibir significativamente a taxa de proliferação após 48 e 72 horas (Figura S1A), e a sobre-expressão de FoxM1 promoveu a proliferação do tumor, após 72 horas em ratinhos nus (Figura S1B), todas as quais eram consistentes com os resultados anteriores.
(A, B) A detecção de knockdown mediada por lentivírus de FoxM1 em células PC-9 e H1299 por WB e Q-PCR, respectivamente. (C, D) Um resultado representativo dos ensaios de migração trans-bem para os efeitos da FoxM1 no
in vitro
habilidades migratórias e invasivos de PC-9 e H1299 células. Os resultados são apresentados como a média ± sd, *
p
. 0,05
Expression forçado de FoxM1 Aumentou o
in vitro
e
In vivo
Habilidades metastáticos de células NSCLC
Para provar ainda mais o papel em NSCLC metástase, que overexpressed estavelmente expressão FoxM1 em linhas de células H292 (Figura 3A e B) PC-9 e. Em primeiro lugar, através da utilização de ensaios de Trans-assim, que mostrou que a sobre-expressão de FoxM1 poderia aumentar significativamente os potenciais migratórios e invasivos de células NSCLC (Figura 3C e D). Para confirmar adicionalmente o papel de FoxM1 na metástase do cancro do pulmão de células não pequenas, foi desenvolvido um modelo de ratinho por injecção veia caudal de PC-9 FoxM1 superexpressando (PC-9-FoxM1) e células de controlo (PC-9-Vector) . Cinco semanas após a inoculação de células, os murganhos foram sacrificados para a obtenção dos pulmões (Figura 4A), e monitorizada por meio de imagens de fluorescência, cujos resultados mostraram que as células PC-9-FOXM1 apresentado sinais de fluorescência muito mais forte nos pulmões do que os das células de controlo ( A Figura 4B). Além disso, o estudo histológico mostrou que o número de nódulos metastáticos nos pulmões do grupo superexpressão FoxM1 foi significativamente maior do que aqueles no grupo de controle (Figura 4C e D). Tomados em conjunto, estes resultados suportam a hipótese de que FoxM1 desempenha um papel importante na metástase do tumor de NSCLC.
(A, B) A detecção da superexpressão mediada por lentivírus de FoxM1 em células PC-9 e H292 pela WB e Q-PCR, respectivamente. (C, D) Um resultado representativo dos ensaios de migração trans-bem para os efeitos da FoxM1 no
in vitro
habilidades migratórias e invasivos de PC-9 e H292 células. Os resultados são apresentados como a média ± sd, *
p
. 0,05
(A, B) Visual Inspecção e análise por imagem de fluorescência de pulmão nódulos metastáticos em dois grupos ( PC-9-vector e PC-9-FoxM1) de modelos de murganho por injecção na veia da cauda de células de tumor, respectivamente. (C) Os efeitos do
FoxM1
no
in vivo
habilidades metastático de células PC-9 em modelos de xenotransplante de ratos pelados (n = 6), conforme determinado pelo exame dos pulmões do rato para microscópica nódulos. Os resultados representativos de exame histológico dos pulmões do rato para nódulos metastáticos (esquerda). O número de noudels metastáticos pulmonares em dois grupos de modelos do rato (para a direita). Os resultados são apresentados como a média ± sd, *
p
. 0,05
FoxM1 induziu a transição epitelial-mesenquimal de células NSCLC e amostras de tumores de tecido
Nós células ainda observado com expressão alta FoxM1, que foram encontrados para ter alterações fenotípicas que lembram EMT. Como mostrado na Figura 5A, não foram observadas diferenças morfológicas distintas entre a linha de células H292-FoxM1 e a sua linha de células H292 do vector parental em cultura de células. Considerando H292 células são poligonais e crescer em clusters, as células H292-FoxM1 são alongadas e fusiformes, e crescer em um padrão de espalhamento de confluência. Para explorar melhor os mecanismos associados com o aumento do potencial de metástases, testou-se alguns factores essenciais associados com EMT, que promove a metástase em carcinomas. Descobrimos que as células H292-FOXM1 expressa níveis mais baixos de ARNm e de proteína de E-caderina e ZO-1 enquanto obtidos níveis mais elevados de ARNm e proteína dos marcadores mesenquimais, como vimentina e N-caderina (Figura 5B e C). Slug é um repressor de transcrição, que é potente indutor de EMT. Temos observado um aumento da expressão Slug em células FoxM1-superexpressão (Figura 5D). Nossas observações sugerem que FoxM1 induz metástases através de EMT
(A) imagens de contraste de fase representativas do H292-vector e células H292-FoxM1. (Aumento de 200 ×). (B) quantitativa em tempo real A análise de PCR da expressão relativa de marcadores EMT como indicado. GADPH foram utilizados como controle de carga. Os dados são expressos como média ± D.P., *
P
. 0,05. (C) A expressão relativa de marcadores EMT como indicado foi determinada por imunotransf erência (esquerda), e os resultados de que foi adicionalmente quantificado (à direita). β-actina serviu como um controlo de carregamento. (D) A expressão relativa de Slug, tal como indicado foi determinada por imunotransf erência (esquerda), e os resultados de que foi adicionalmente quantificado (à direita). β-actina serviu como um controlo de carregamento.
Para demonstrar ainda mais a relação entre a expressão de marcadores e EMT FOXM1, coloração imuno-histoquímica foi levada a cabo para E-caderina, vimentina e Slug em amostras de tumores. Em amostras de câncer de pulmão humanos, o aumento da vimentina e expressão lesma e diminuição da expressão de E-caderina foram encontrados nos grupos com alta expressão FoxM1, enquanto diminuiu vimentina e expressão Slug e aumento da expressão de E-caderina nos grupos com baixa expressão FoxM1 (Figura 6A) . Além disso, nós estabelecemos modelos de tumores sólidos subcutâneos. Após 4 semanas de injecção de células PC-9-vector PC-9-FoxM1 e, tumores sólidos foram colhidas, incorporado em paraffarin e corados para marcadores de EMT. Como mostrado na Figura 6B, em comparação com os tumores derivados de células PC-9-vector, os tumores derivados de células PC-9-FOXM1 revelaram um aumento da expressão de vimentina e espaçador e a diminuição da expressão de E-caderina (Figura 6B). Nossas observações em alterações morfológicas e moleculares sugerem que FoxM1 superexpressão induz um fenótipo EMT-like através do aumento da regulação do Slug em células NSCLC.
(A) A expressão relativa de E-caderina, vimentina e Slug como indicado foi determinado por coloração imuno-histoquímica em amostras de tumores humanos com elevado (acima) e baixos (abaixo) FoxM1 expressão. (B) A expressão relativa de E-caderina, vimentina e Slug, tal como indicado foi determinada por coloração imuno-histoquímica em tumores de ratinhos nus derivados a partir de células PC-9 do vector (em cima) e células PC-9-FOXM1 (abaixo).
Discussão
neste estudo, foram avaliados os níveis de expressão de FoxM1 usando coloração IHC em uma coorte de 175 pacientes com NSCLC chinesa e pela primeira vez demonstraram que a expressão elevada de FoxM1 foi correlacionada com vários clínico-patológico fatores e previu um prognóstico desfavorável em pacientes com NSCLC, incluindo SCC e AC. Além disso, verificou-se que a desregulação da expressão FoxM1 foi significativamente associada com habilidades metastáticos mais elevadas através de indução de EMT.
Considerando o papel da FoxM1 no crescimento de células tumorais, alguns estudos têm avaliado a possibilidade de expressão FoxM1 como um biomarcador para prever a evolução clínica de pacientes com NSCLC. Yang et al descobriram que FoxM1 relacionada com fatores clínicos e desempenha papel crítico no prognóstico em 69 pacientes com SCC, não incluindo AC. e Liu et al demonstram que FoxM1 poderia ser um fator independente para prognóstico em 68 pacientes com NSCLC, incluindo 37 AC e 19 de SCC, mas a relação entre a expressão FoxM1 e outros clinicoparameters foi testado com nenhuma relação. Estes resultados paradoxais podem, devido à sua população de estudo diferente, pequeno tamanho da amostra e variada qualidade dos dados clínicos. Em nosso estudo, descobrimos que a expressão FoxM1 em amostras de tumor foi positivamente associado com vários parâmetros clínico, tais como estágio TNM, estágio do tumor e metástases em linfonodos. Além disso, maior expressão FoxM1 foi correlacionada com um prognóstico pobre de pacientes com NSCLC. Estes resultados indicaram que FoxM1 foi relacionado com a progressão e prognóstico NSCLC. No entanto, os mecanismos subjacentes precisa ser mais explorado.
A metástase envolve uma série de etapas complexas [22], incluindo diminuição de adesão, aumento da motilidade, a fixação das células, a dissolução da matriz, ea migração [23]. Durante a progressão do tumor, as células de cancro sofrem alterações dramáticas na organização do citoesqueleto para adoptar fenótipo invasivo e, eventualmente, metástase para outros órgãos. EMT é um processo chave em metástase tumoral [24], [25], [26], o que associado com expressão reduzida da superfície da célula de E-caderina, o aumento da N-caderina [27], [28] e a expressão alterada de várias cito proteínas -skeletal, desempenhando um papel significativo no sentido da atividade migratória das células tumorais [29].
Nossos dados revelaram que a inibição da FoxM1 poderia suprimir a capacidade metastática, enquanto up-regulada nível de FoxM1 expressão no câncer de pulmão células melhorou as propriedades migratórias e invasivos in vitro e in vivo. Níveis de E-caderina, ZO-1 eram elevados e vimentina, N-caderina foram reduzidos com maior expressão FoxM1. Além disso, a expressão regulada FoxM1 Slug, que é o indutor de EMT. Estes resultados sugeriram que FoxM1 foi associado com prognóstico promovendo a metástase de células tumorais através de indução de EMT. Hyun JP et al. também demonstraram que em CHC, FoxM1 pode activar a via de Akt-Snail1 e envolvem em transição EMT [17]. Além disso, existem alguns outros estudos indicaram que as MMPs têm emergido como factores centrais em ambos o crescimento local e metástase em tumores [30], [31], e também FoxM1 MMPs podiam regular para promover OSCLC metástase. Tomados em conjunto, FoxM1 pode desempenhar várias funções importantes em células tumorais. O seu papel completo na via relativa metástase worths uma análise mais aprofundada.
Em resumo, os nossos resultados sugerem que FoxM1-regulação pode ter efeito sobre NSCLC prognóstico e progressão. Nós mostramos que FoxM1 superexpressão foi relacionada à redução da sobrevida global e progressão rápida do tumor em pacientes com NSCLC. Além disso, a sobre-expressão de FoxM1 poderia aumentar as habilidades migratórias e invasivos de células NSCLC. Estes resultados sugerem que a expressão FoxM1 é crítico para a capacidade de invasão de células NSCLC malignas, e este efeito foi, pelo menos, em parte através de transição mechenmychal epithelial-. Portanto, a nossa observação faz FoxM1 um alvo atraente da terapia de câncer de pulmão, e pode ser usado como um biomarcador para predizer o prognóstico.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
participantes Humanos envolvidos nesta pesquisa, desde que o seu consentimento informado por escrito de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Ética Médica e Comissão julgamento humano Clínica Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan aprovou este estudo, bem como o processo de aprovação (Permit Number: 2011-221). Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Fudan Comissão dos cuidados animais, Shanghai, China (Permit Number: SYXK: 2008-0039). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
Pacientes e amostras de tumor
Um total de 232 pacientes com NSCLC histologicamente confirmados foram recrutados consecutivamente entre janeiro de 2005 e fevereiro de 2008 para o tratamento de pulmão de células não pequenas cancer (NSCLC) em Zhongshan Hospital, Universidade de Fudan. Quatro pacientes foram excluídos se eles já receberam radioterapia e /ou quimioterapia. A radiografia de tórax e tomografia computadorizada foram realizados em todos os pacientes antes da operação. Há 142 pacientes foram submetidos a ressecção cirúrgica curativa. A quimioterapia com um regime à base de cisplatina foi aplicado para a maioria dos pacientes com alto estágio (incluindo IIIB e IV) ou com alto risco de recorrência e metástase de acordo com a diretriz de tratamento para NSCLC no momento cirúrgico. Para este estudo, 53 pacientes foram excluídos da análise, incluindo 38 pacientes com má qualidade e /ou quantidade de amostras de tecido, 11 pacientes com dados clínicos incompletos e 4 pacientes morreram de outras causas foram originalmente excluídos da nossa análise. Finalmente, um total de 175 pacientes foram incluídos neste estudo (Tabela S1). Um total de 122 homens e 53 mulheres foram incluídas, incluindo 97 fumantes e 78 não-fumantes, com idades variando de 30 a 77 anos, dos quais 89 tinham menos de 55 anos de idade. Havia 76 estágio I, 23 de fase II, 51 estágio III e 25 estádio IV doenças, incluindo 91 pacientes sem metástase nodal e 84patients com metástase axilar. Havia 36 pacientes com tumor do estágio 1, 75 com a fase 2, 25 com estágio 3 e 39 com estágio 4 e 118 pacientes com adenocarcinoma (AC), enquanto 57 com carcinoma de células escamosas (SCC). Em termos de diferenciação, havia 93 pacientes com bem e moderadamente diferenciação e 82 com a diferenciação mal. Um total de 74 pacientes estavam vivos no final do follow-up, 101 pacientes morreram de câncer de pulmão, e os pacientes morreram de outras causas ou perdidos para follow-up foram excluídos do estudo.
informações clinico-patológica para cada paciente, incluindo sexo, idade, tabagismo, estágio do tumor, estado nodal, estágio TNM, grau histológico e sobrevida global, foi obtido retrospectivamente a partir de registros clínicos e relatórios patológicos. O tempo de sobrevida foi definida como a duração a partir da data do diagnóstico da data da morte ou o fim do follow-up. O estado TNM foi determinada de acordo com o sistema de edição de preparo 7ª para NSCLC [32].
Immunohischemistry Ensaio
Um anticorpo contra FoxM1 (Sigma Aldrich Inc., MO, EUA) e um imuno-histoquímica padrão técnica foram usadas para a detecção de expressão FoxM1 como descrito anteriormente [19], [20]. FoxM1 foi observada em citoplasmática ou nuclear e citoplasmática das células. A coloração foi avaliada em cinco campos de alta potência a 200 × ampliação. A pontuação de coloração foi categorizado em quatro grupos como negativo = 0, fraco = 1, moderada = 2 e intensa = 3 [20]. A área manchada percentagem positiva foi categorizado em quatro grupos: menos de 25% de células tumorais positivas = 0; 25% a 50% de células tumorais positivas = 1; 50% a 75% de células tumorais positivas = 2; mais de 75% de células tumorais positivas = 3. pontuação de marcação foi determinado multiplicando por pontuação da intensidade da área a percentagem marcação positiva, que pontua como 0, 1, 2, 3, 4, 6 e 9. A pontuação coloração foi classificada em dois grupos coloração tão fraco /negativo (escore 4) e forte coloração (pontuação ≥4). Este limite foi determinado pela determinação visualmente uma mancha positiva clara apoiado por histogramas da gama de pontuações [20], [33], [34]. A maior pontuação rotulagem entre as três secções de tecido foi inserido para análises estatísticas. Os patologistas que realizaram a avaliação imuno-histoquímica de FoxM1 estavam cegos para os pacientes “histopatológico e dados de acompanhamento.
dados epidemiológicos e clínicos Coleção
Doentes demográfica parâmetros e fumar história foram obtidos por meio de entrevista -Pessoa no momento da visita inicial, o acompanhamento nas clínicas ou revisão de prontuários médicos. Um indivíduo que fumou mais de 100 cigarros na história foi definida como um fumante nunca, caso contrário, como um não fumador [35]. informações de acompanhamento sobre a morte do paciente e sobrevivência foi atualizado em intervalos de 3 meses por meio de entrevista no local, chamada direta ou revisão de prontuários médicos. O último acompanhamento neste estudo foi realizado em maio de 2012.
linhas celulares, cultura de células e quimioterápico Reagentes
O pulmão linha de células de adenocarcinoma humano linha de células de câncer de PC-9 e pulmão humano NCI-H292, NCI-H1299 foram todos obtidos a partir de Instituto Cellular da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) [36]. Estas células foram cultivadas a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS, Hyclone Inc., UT, EUA), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram regularmente certificadas como livres de contaminação por micoplasma.
Experimentos shRNA
O shRNA vector-LENTIVIRUS foi construído como descrito anteriormente [37]. Resumidamente, FoxM1 e controlo negativo shRNA foram subclonados nos locais MluI /ClaI de um vector pLVTHM (Addgene) com os seguintes oligonucleótidos, respectivamente: 5′-CGCGTCGGCCGGAACATGACCATC AATTCAAGAGATTGATGGTCATGTTCCGGCTTTTTTCCAT 3’and-5′-CGATGGAAAAAAGCCGGAACATGACCATCAATCTCTTGAATTGATGGTCATGTTCCGGCCGA-3’for FoxM1, e 5 ‘ -CGCGTCGGT AGCGACTAAACACATCAATTCAAGAGATTGATGTGTTTAGTCGCTACTTTTTTCCAT-3’and 5’-CGATGGAAAAAAGTAGCGACTAAAC ACATCAATCTCTTGAATTGATGTGTTTAGTCGCTACCGA-3’for o controlo negativo. geração lenti-vírus e infecção de H1299 e PC-9 células foram realizados como descrito acima.
A transdução de células tumorais
O plasmídeo (EX-Z5438-LV135) e Lenti-Pac ™ HIV Expression Kit embalagens foram adquiridos da Gene Copoeia Inc. (Gene Copoeia Inc., Guangzhou, China) transduções de H292 e PC-9 células foram realizadas de acordo com as instruções fornecidas pelos fabricantes. Os transfectantes estáveis foram adicionalmente confirmada por RT-PCR e imunotransferência com base na sua expressão FoxM1.
Migração tumoral e invasão celular Os ensaios
Os ensaios para medir a migração de células de tumor foram realizadas numa câmara de Boyden modificada (Transwell, Corning Costar, MA, EUA) contendo um filtro de membrana de policarbonato revestidos com gelatina (tamanho de poro de 8 um). Bio-Revestimento de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA), que reconstitui membrana basal foi utilizada para avaliar a invasão celular. O grau de migração celular e invasão do tumor foi avaliada de acordo com os protocolos anteriores [38]. As células que não migraram foram removidos a partir do lado superior da membrana por lavagem. A contagem das células foi realizada por coloração com azul de Coomassie e as células foram visualizados sob um microscópio (Leica Inc., Solms, Alemanha) posteriormente.
Experimentação Animal
dadores BALB
com quatro a cinco semanas de idade /ratinhos nus CA (adquirido a partir de Xangai Instituto de Medicina material, Academia chinesa de Ciências, Xangai, China) foram mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos (SPF). O método utilizado é o mesmo que o descrito anteriormente para a geração modelo de cancro da mama [39]. células PC-9-FoxM1 (2 × 10
6 por ratinho) que expressam estavelmente FoxM1 ou vector foram injectados na veia da cauda de ratinhos nus (n = 6). Cinco semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e os pulmões foram removidos. Depois disso, estes pulmões foram processados para exame histológico e monitorados para potenciais metástases tumorais de pulmão por imagens de fluorescência [40]. lesões metastáticas foram identificados por sinais de fluorescência (Night Owl LB 981
In Vivo Imaging System
, Berthold, Alemanha) e analisados por software WinLight32. Para a análise histológica, os pulmões foram recolhidos na necropsia e fixados em formalina a 10%. As amostras fixadas foram então embebidas em parafina, e três secções em série não sequenciais foram obtidos por animal. Os cortes foram corados com H E e analisadas para a presença de metástase
Análise Estatística
Vários fatores clínico-patológicos foram avaliados.. O teste exato de Fisher foi usado para avaliar a correlação entre as variáveis clínicas e a expressão de FoxM1. As variáveis clínicas e a expressão de FoxM1 foram tidos em conta para a análise de sobrevivência em função do método de Kaplan-Meier; A análise multivariada foi realizada com o modelo de riscos proporcionais de Cox para examinar o efeito prognóstico independente de FoxM1 na sobrevivência através do ajuste para fatores de confusão. Um valor de P 0,05 foi considerado significativo em todas as análises. SPSS 17.0 foi utilizado para fazer as análises estatísticas neste trabalho.
Informações de Apoio
Figura S1.
Efeitos da expressão FoxM1 alteração na taxa de proliferação
in vitro
e
in vivo
. (A) taxa de proliferação de FoxM1 de SPC-A-1 sh-FoxM1 (esquerda) e H1299 sh-FoxM1 (à direita) células. expressão FoxM1 foi knocked-down por infecção-LENTIVIRUS no SPC-A-1 e células H1299 primeira forma estável. taxas de proliferação de células nos grupos transfectadas com shRNAs contra FoxM1 (sh-FoxM1) (linha vermelha) diminuiu significativamente, em comparação com o controle shRNA-alvo negativo (sh-NC) (linha azul). Os dados são expressos como média ± DP. (B) taxa de proliferação de tumores derivados de PC-9-FoxM1cells in vivo. As células PC-9-FOXM1 PC-9-vector e foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. O diâmetro do tumor foi medido nos pontos de tempo indicados. taxa de proliferação de tumores derivados de células PC-9-FoxM1 (linha azul) aumentaram significativamente, em comparação com que a partir de células PC-9-vector (linha vermelha). Os dados são expressos como média ± SD
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059412.s001
(JPG)
Tabela S1. .
Características de pacientes com câncer de pulmão não-pequenas células
doi: 10.1371 /journal.pone.0059412.s002
(DOCX)
Tabela S2.
Perfil clínico e correlação entre as características clínicas e expressão de FoxM1
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059412.s003
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Reconhecimentos
Agradecemos ao Dr. Qun Wang (Departamento de thoracology, Zhongshan Hospital) para ajudar-nos com o acompanhamento dos pacientes e Dr. Deming Ele (Departamento de patologia, Zhongshan Hospital) para ajudar com a recolha das amostras de câncer de pulmão de células não pequenas.